1、第三章 高效液相色譜法,本章主要內(nèi)容,2.1 高效液相色譜分析原理 2.2 高效液相色譜儀 2.3 分離條件選擇的一般原則 2.4 定性和定量方法 2.5 高效液相色譜在食品分析中的應(yīng)用 2.6 超臨界流體色譜,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 液-固吸附色譜 液-液分配色譜 離子色譜 體積排阻色譜 親合色譜,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 1. 液-固吸附色譜(liquid-solid adsorption chromatography) 固定相：固體吸附劑，如碳酸鈣、硅膠、氧化鋁、氧化鎂、活性炭等。較常使用的是510mm的硅膠吸附劑

2、。 流動(dòng)相：底劑（烷烴）+ 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - -,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 1. 液-固吸附色譜(liquid-solid adsorption chromatography) 基本原理：吸附劑一般為多孔性的物質(zhì)，在它們的表明存在著分散的吸附中心，溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子在吸附劑表面的活性中心上進(jìn)行競爭，同時(shí)不同溶質(zhì)之間和同一溶質(zhì)的不同官能團(tuán)之間也存在競爭。競爭的綜合結(jié)果就是形成不同溶質(zhì)在吸附劑表面吸附、解吸平衡。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 1. 液-固吸附色譜(liquid-solid ad

3、sorption chromatography) 基本原理：,X表示溶質(zhì)分子，下標(biāo)m為流動(dòng)相，s為固定相，M表示流動(dòng)相分子，下標(biāo)m為流動(dòng)相，s為固定相，n為被溶質(zhì)分子取代的流動(dòng)相分子數(shù)目,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 1. 液-固吸附色譜(liquid-solid adsorption chromatography) 適用于分離中等分子質(zhì)量的油溶性樣品，而對強(qiáng)極性或離子型的樣品，有時(shí)會(huì)發(fā)生不可逆吸附，不能得到滿意的結(jié)果。 缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 1. 液-固吸附色譜(liquid-soli

4、d adsorption chromatography) 極性吸附劑上有機(jī)化合物的保留順序： 氟碳化合物飽和烴 烯烴芳烴有機(jī)鹵化物醚硝基化合物腈叔胺酯醛酮醇伯胺酰胺羧酸磺酸 弱極性組分先出柱，強(qiáng)極性組分后出柱,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 1. 液-固吸附色譜(liquid-solid adsorption chromatography) 影響k的因素：與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相性質(zhì)有關(guān) 溶質(zhì)分子極性，洗脫能力，k，tR 溶劑系統(tǒng)極性，洗脫能力，k， tR 注：調(diào)節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時(shí)間,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液

5、-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶） 基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配（溶解度不同）； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；現(xiàn)采用化學(xué)鍵合固定相：通過化學(xué)反應(yīng)將各種不同基團(tuán)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 固定相： 極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。 非極性鍵

6、合固定相： 鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18柱就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯硅烷通過化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 流動(dòng)相：對于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 rev

7、erse phase）。正相與反相的出峰順序相反。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 正相鍵合相色譜 分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、 誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力 固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相 流動(dòng)相：極性小 底劑 + 有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 正相鍵合相色譜 流

8、動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性，洗脫能力，組分tR，k 出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱 極性大的組分后出柱,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 正相鍵合相色譜 適用： 氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。?分離物質(zhì)也相似 氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性 分析極性大物質(zhì)、糖類等,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 反相

9、鍵合相色譜 分離機(jī)制：疏溶劑理論 固定相：極性小的烷基鍵合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC約80%） 流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水 流動(dòng)相極性 固定相極性 底劑 + 有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 2. 液-液分配色譜(liquid- liquid partition chromatography) 反相鍵合相色譜 流動(dòng)相極性與k的關(guān)系： 流動(dòng)相極性，洗脫能力，k，組分tR 出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱 適用：非極性中等極性組分（HPLC80%）,2.1 高效液相色譜分析原理

10、,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法（ion chromatography, IC） （1） 離子交換色譜法（ion exchange chromatography, IEC） （2） 離子排斥色譜法（ICE） （3） 離子對色譜（ion-pair chromatography, IPC）,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （1） 離子交換色譜(ion-exchange chromatography) 固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂 流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿

11、性水溶液。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （1） 離子交換色譜 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H+ 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （1） 離子交換色譜,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜

12、法 （2）離子對色譜(ion pair chromatography) 無機(jī)離子以及離解很強(qiáng)的有機(jī)離子通?？梢圆捎秒x子交換色譜進(jìn)行分離。有很多大分子或離解較弱的有機(jī)離子需要采用通常用于中性有機(jī)化合物分離的反相（或正相）色譜。 然而，直接采用正相或反相色譜又存在困難，因?yàn)榇蠖鄶?shù)可離解的有機(jī)化合物在正相色譜的硅膠固定相上吸附太強(qiáng)，致使被測物質(zhì)保留值太大、出現(xiàn)拖尾峰，有時(shí)甚至不能被洗脫。在反相色譜的非極性（或弱極性）固定相中的保留又太小。在這種情況下，就可采用離子對色譜。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （2）離子對色譜(ion pair chroma

13、tography) 原理：離子對色譜也稱離子相互作用色譜，是在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)木哂信c被測離子相反電荷的離子，即離子對試劑，使之與被測離子形成中性的離子對化合物，此離子對化合物在反相色譜柱上被保留。保留的大小主要取決于離子對化合物的解離平衡常數(shù)和離子對試劑的濃度。 陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （1）離子對色譜(ion pair chromatography) 反相離子對色譜：反相色譜中(非極性的疏水固定相(C-

14、18柱)，在極性流動(dòng)相(甲醇-水或乙腈-水)中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，在兩相間分配。 離子對試劑：烷基磺酸鈉分析堿 四丁基季胺鹽分析酸 適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （1）離子對色譜(ion pair chromatography) 反相離子抑制色譜：在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，抑制組分解離。 離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì) pH一定的緩沖溶液,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 3. 離子色譜法 （1）離子對色譜(ion pair chroma

15、tography) 反相離子抑制色譜 選擇流動(dòng)相：應(yīng)同時(shí)考慮極性及pH值 酸性物質(zhì)加入酸HAc tR，k 堿性物質(zhì)加入堿NH3H2O tR，k 調(diào)節(jié)pH范圍：3.08.0 pH8.0 破壞鍵合相與載體的結(jié)合 pH3.0 腐蝕柱子 適用：極弱酸堿物質(zhì) pH=37弱酸；pH=78弱堿；兩性化合物,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 4. 體積排阻色譜(size- exclusion chromatography) 原理：也稱凝膠色譜，按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分

16、子小，故在最后出峰。樣品全部在死體積前出峰； 可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 4. 體積排阻色譜(size- exclusion chromatography) 固定相： 化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無機(jī)多孔材料。 流動(dòng)相： 在體積排阻色譜中，流動(dòng)相的作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小流動(dòng)相粘度。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 4. 體積排阻色譜(size- exclusion chromatography) 凝膠過濾色譜（gel filtrat

17、ion chromatography, GFC）： 以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于水溶性高分子的分離。 凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography, GPC）： 以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色譜法。主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的測定。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.1 高效液相色譜的類型 5. 親和色譜(Affinity chromatograph) 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。,先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性

18、能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。,2.1 高效液相色譜分析原理,2.1.2 高效液相色譜的基本原理 保留時(shí)間(tR)和保留體積(VR) 調(diào)整保留時(shí)間(tR)和調(diào)整保留體積(VR) 容量因子(k) 相對保留值和選擇性 柱塔板數(shù)N,2.2 高效液相色譜儀,2.2 高效液相色譜儀,1.儲(chǔ)液瓶（輸液管入口端安裝有過濾器）；2.高壓輸液泵；3.混合器和阻尼器；4.進(jìn)樣器（閥）；5.色譜柱；6.檢測器；7.廢液瓶；8.數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng),2.2 高效液相色譜儀,2.2 高效液相色譜儀,2.2

19、高效液相色譜儀,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 液相色譜儀的關(guān)鍵部件，壓力：150350105 Pa。 其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。對于帶在線脫氣裝置的色譜儀，流動(dòng)相先經(jīng)過脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 1. 對輸液泵的基本要求 流量準(zhǔn)確可調(diào)。對于一般的分析工作而言，流動(dòng)相的流速在0.52mL/min，輸液泵的最大流量一般為510mL/min。輸液泵的流量控制精度通常要求小于0.5%。輸液泵必須能精確地調(diào)節(jié)流動(dòng)相流量，這可以通過電子線路調(diào)節(jié)電機(jī)轉(zhuǎn)速或沖程長短來實(shí)現(xiàn)。

20、流量的測定通常采用熱脈沖流量計(jì)。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 1. 對輸液泵的基本要求 耐高壓。高效液相色譜柱是將很細(xì)顆粒（310mm 粒徑）的填料，在高壓下填充到柱管中的，為了保證流動(dòng)相以足夠大的流速通過色譜柱，需要足夠高的柱前壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到3060MPa的高壓。 液流穩(wěn)定。輸液泵輸出的液流應(yīng)無脈動(dòng)，或配套脈沖抑制器。 泵的死體積小。為了快速更換溶劑和適于梯度洗脫，泵的死體積通常要求小于0.5mL。泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 2. 輸液泵的種類 輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。 輸液泵按工作方式分為氣

21、動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。,2.2 高效液相色譜儀,幾種高壓輸液泵的性能比較,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 2. 輸液泵的種類 (1) 活塞型往復(fù)泵活塞型往復(fù)泵是液相色譜儀中使用最廣泛的一種恒流泵。,單活塞往復(fù)泵：,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 2. 輸液泵的種類 (1) 活塞型往復(fù)泵,雙活塞往復(fù)泵：,2.2 高效液相色譜儀,2.2.1 高壓輸液泵 2. 輸液泵的種類 (2) 隔膜型往復(fù)泵,2.2 高效液相色譜儀,2.2.2 脫氣裝置 1. 為什么要脫氣 流動(dòng)相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而

22、形成氣泡。 氣泡進(jìn)入檢測器后會(huì)在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。 小氣泡慢慢聚集后會(huì)變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。 氣泡一旦進(jìn)入色譜柱，排出這些氣泡則很費(fèi)時(shí)間。 在熒光檢測中，溶解氧還會(huì)使熒光淬滅。 溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液pH值發(fā)生變化。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.2 脫氣裝置 2. 脫氣方法目前，液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。 超聲波振蕩脫氣： 將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣1020min。這種方法比較簡便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，

23、目前仍廣泛采用。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.2 脫氣裝置 2. 脫氣方法 惰性氣體鼓泡吹掃脫氣： 將氣源（鋼瓶）中的氣體（氦氣）緩慢而均勻地通入儲(chǔ)液罐中的流動(dòng)相中，氦氣分子將其它氣體分子置換和頂替出去，而它本身在溶劑中的溶解度又很小，微量氦氣所形成的小氣泡對檢測無影響。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.2 脫氣裝置 2. 脫氣方法 真空脫氣裝置： 將流動(dòng)相通過一段由多孔性合成樹脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時(shí)，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮?dú)狻⒍趸季蜁?huì)從膜內(nèi)進(jìn)入膜外而被脫除。一般的真空脫氣裝置有多條流路，可同時(shí)對多個(gè)溶液進(jìn)行脫氣。,2.2 高效液相色譜儀,2.2

24、.2 脫氣裝置 2. 脫氣方法,真 空 脫 氣 裝 置,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 1. 為什么要進(jìn)行梯度洗脫？在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作在液相色譜中流速（壓力）梯度和溫度梯度效果不大，而且還會(huì)帶來一些不利影響，因此，液相色譜中通常所說的梯度洗脫是指流動(dòng)相梯度，即在分離過程中改變流動(dòng)相的組成或濃度。 線性梯度 階梯梯度 高

25、壓梯度 低壓梯度,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作 線性梯度： 在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。 階梯梯度： 直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作 梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作 高壓梯度： 一般只用于二元梯度，即用

26、兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。 高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是，只要通過梯度程序控制器控制每臺(tái)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。其主要缺點(diǎn)是使用了兩臺(tái)高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對較高，而且只能實(shí)現(xiàn)二元梯度操作。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作 高壓梯度：,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作 低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。因?yàn)楸壤?/p>

27、閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置。來自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后的四種溶液進(jìn)入比例閥，混合后從一根輸出管進(jìn)入泵體。多元梯度泵的流路可以部分空置。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.3 梯度洗脫裝置 2. 梯度洗脫操作 低壓梯度：,2.2 高效液相色譜儀,2.2.4 進(jìn)樣器 進(jìn)樣器是將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置，分手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式。進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣時(shí)引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小?，F(xiàn)在的液相色譜儀所采用的手動(dòng)進(jìn)樣器幾乎都是耐高壓、重復(fù)性好和操作方便的六

28、通閥進(jìn)樣器。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.5 色譜柱 1. 色譜柱的構(gòu)成 色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。 色譜填料： 經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是510 粒徑的球形顆粒。 色譜柱管： 內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長250mm。 色譜柱： 也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.5 色譜柱 1. 色譜柱的構(gòu)成,2.2 高效液相色譜儀,2.2.5 色譜柱 2. 填料的結(jié)構(gòu)色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成。 基質(zhì)： 又

29、常稱作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對分離不起明顯的作用，只是作為功能基團(tuán)的載體。常用來作基質(zhì)的有硅膠和有機(jī)高分子聚合物微球。 功能層： 是通過化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對樣品分子的保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.5 色譜柱 2. 填料的結(jié)構(gòu),功能層冠醚分子吸附或鍵合在硅膠基質(zhì)的表面,2.2 高效液相色譜儀,2.2.5 色譜柱 2. 填料的結(jié)構(gòu) 填料的物理結(jié)構(gòu)： 分為微孔型（或凝膠型）、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四種類型。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與自動(dòng)控

30、制單元 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)： 又稱色譜工作站。它可對分析全過程（分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài)）進(jìn)行在線顯示，自動(dòng)采集、處理和儲(chǔ)存分析數(shù)據(jù)。 老型號(hào)液相色譜儀：配有積分儀或記錄儀 現(xiàn)代的色譜儀：一般都帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，使用起來非常方便。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與自動(dòng)控制單元 自動(dòng)控制單元： 將各部件與控制單元連接起來，在計(jì)算機(jī)上通過色譜軟件將指令傳給控制單元，對整個(gè)分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，從而使整個(gè)分析過程全自動(dòng)化。也有的色譜儀沒有設(shè)計(jì)專門的控制單元，而是每個(gè)單元分別通過控制部件與計(jì)算機(jī)相連，通過計(jì)算機(jī)分別控制儀器的各部分。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 用來連續(xù)監(jiān)測

31、經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。檢測器利用溶質(zhì)的某一物理或化學(xué)性質(zhì)與流動(dòng)相有差異的原理，當(dāng)溶質(zhì)從色譜柱流出時(shí)，會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相背景值發(fā)生變化，從而在色譜圖上以色譜峰的形式記錄下來。,H P L C 中 常 見 檢 測 器 的 基 本 特 性,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 1. 紫外-可見光（UV-VIS）檢測器 原理： 基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。 很多有機(jī)分子都具紫外或可見光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見光吸收能力，因此UV-VIS檢測器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對環(huán)境溫

32、度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測器。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 1. 紫外-可見光（UV-VIS）檢測器 用UV-VIS檢測時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長作檢測波長，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動(dòng)相。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 2. 光電二極管陣列檢測器(PAD) 普通的紫外可見吸收檢測器只能測定某一波長時(shí)吸光度與時(shí)間關(guān)系曲線，即只能作二維圖譜。要測定某組分的紫外可見吸收光譜圖，需采

33、用“停留掃描”的方法，使被測組分停留在檢測池中，然后用波長掃描測定。 光電二極管陣列檢測器能夠同時(shí)測定吸光度、時(shí)間、波長三者的關(guān)系，通過計(jì)算機(jī)處理，可以得到三維圖譜，也可做出任意波長的吸光度-時(shí)間曲線(色譜圖)和任意時(shí)間的吸光度-波長曲線(紫外可見光譜圖)。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 2. 示差折光檢測器（differential refractometers, RI） 原理：基于樣品組分的折射率與流動(dòng)相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來時(shí)，會(huì)引起流動(dòng)相折射率的變化，這種變化與樣品組分的濃度成正比。 示差折光檢測法也稱折射指數(shù)檢測法。絕大多數(shù)物質(zhì)的折射率與流動(dòng)相都有差異，所以R

34、I是一種通用的檢測方法。雖然其靈敏度比其他檢測方法相比要低13個(gè)數(shù)量級(jí)。對于那些無紫外吸收的有機(jī)物（如高分子化合物、糖類、脂肪烷烴）是比較適合的。在凝膠色譜中是必備檢測器，在制備色譜中也經(jīng)常使用。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 3. 熒光檢測器（fluorescence detector） 原理： 許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機(jī)胺、維生素、激素、酶等，被一定強(qiáng)度和波長的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長要長的熒光。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機(jī)化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測。 特點(diǎn)： 有非常高的靈敏度和良

35、好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測法高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。而且所需樣品量很小，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 4. 電導(dǎo)檢測器（conductivity detector, CD） 原理： 基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。用兩個(gè)對電極測量水溶液中離子型溶質(zhì)的電導(dǎo)，由電導(dǎo)的變化測定淋洗液中溶質(zhì)濃度。電導(dǎo)檢測器是離子色譜中必備的檢測器。 電導(dǎo)檢測器的構(gòu)成： 由電導(dǎo)池、測量電導(dǎo)率所需的電子線路、變換靈敏度的裝置和數(shù)字顯示儀等幾部分組成，電導(dǎo)池是其核心。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 4. 電導(dǎo)檢測器（conduc

36、tivity detector, CD） 電導(dǎo)檢測器工作原理： 當(dāng)向電導(dǎo)池的兩個(gè)電極施加電壓時(shí)，溶液中的陰離子向陽極移動(dòng)，陽離子向陰極移動(dòng)。在電解質(zhì)溶液中的離子數(shù)目和離子的移動(dòng)速率決定溶液的電阻大小，離子的遷移率或單位電場中離子的速率取決于離子的電荷及其大小、介質(zhì)類型、溶液溫度和離子濃度。離子的遷移速率取決于施加電壓的大小。所施加的電壓既可以是直流電壓，也可以是正弦波或方波電壓。當(dāng)施加的有效電位確定后，即可測量出電路中的電流值，即能測出電導(dǎo)值。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 4. 電導(dǎo)檢測器 電導(dǎo)檢測器工作原理：,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 5. 蒸發(fā)光散射檢測器

37、（evaporative light-scattering detector, ELSD） ELSD是一種質(zhì)量型檢測器，是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測器。散射光強(qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無關(guān)。 ELSD可以用來檢測任何不揮發(fā)性化合物，包括氨基酸、脂肪酸、糖類、表面活性劑等，尤其對一些較難分析的樣品，如磷脂、皂苷、生物堿、甾族化合物等無紫外吸收或紫外末端吸收的化合物，也適合于無電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 5. 蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector, ELSD） E

38、LSD的檢測靈敏度要高于低波長紫外檢測器和示差折光檢測器。 ELSD對流動(dòng)相的組成不敏感，也可用于梯度洗脫。另外，由于操作簡便，可與任何品牌的HPLC系統(tǒng)連接。 ELSD由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成。,2.2 高效液相色譜儀,2.2.7 檢測器 5. 蒸發(fā)光散射檢測器 色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣（壓縮空氣或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過加熱漂移管時(shí)，流動(dòng)相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。,2.3 分離條件選擇的一般原則,2.4 定性和定量方法,2.4.1 定性方法

39、 1. 利用已知標(biāo)準(zhǔn)樣定性 2. 利用紫外或熒光光譜定性 3. 收集柱后流出組分，再用其他化學(xué)或物理方法定性,2.4 定性和定量方法,2.4.2 定量方法 1. 外標(biāo)法：用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。 2. 內(nèi)標(biāo)法：在分析測定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動(dòng)而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。,2.5 高效液相色譜在食品分析中的應(yīng)用,2.5 高效液相色譜在食品分析中的應(yīng)用,2.6 超高效液相色譜,隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對液相色譜技術(shù)的要求也不斷提高，需要“更快地得到更好的結(jié)果”。因此提出超高效液相色譜（UltraPerformance LC）概念。 UPLC采用新型的、耐壓而且顆粒度分布范圍很窄的1.7mm顆粒填料，提高了分離能力，可以分離出更多的色譜峰。 Waters公司已推出了六種新的色譜柱，包括：BEH C18、C8、苯基和ShieldRP18、 HILIC 及HSS T3。同時(shí)還有適應(yīng)UPLC使用的蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），進(jìn)一步擴(kuò)展了UPLC