1、第八章 血清學(xué)反應(yīng),第一節(jié)血清學(xué)反應(yīng)概述,抗原與相應(yīng)抗相遇可發(fā)生特異性結(jié)合，并在外界條件的作用下出現(xiàn)某種反應(yīng)，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原（或抗體）檢測未知抗體（或抗原）。因抗體主要存在于血清中，又稱為血清學(xué)反應(yīng)（serological reaction),一、免疫血清學(xué)技術(shù)的類型,按抗原抗體反應(yīng)性質(zhì)不同，可分為凝 集性反應(yīng)、標(biāo)記抗體技術(shù)、有補(bǔ)體參與的 反應(yīng)、中和反應(yīng)以及電免疫反應(yīng)、免疫轉(zhuǎn) 印、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)。,1 凝集試驗(yàn) 直接凝集試驗(yàn)、間接凝 集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn) 2 沉淀試驗(yàn) 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、絮狀沉淀試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳 3 補(bǔ)體參與的試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),4 標(biāo)記抗體技術(shù) 熒光

2、抗體技術(shù)、酶標(biāo)抗體技術(shù)、放射免疫測定、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù) 5 中和試驗(yàn) 病毒中和試驗(yàn) 6 電免疫反應(yīng) 免疫傳感器技術(shù) 7 免疫芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù),二、血清學(xué)反應(yīng)的特點(diǎn),1、抗原抗體結(jié)合的特異性與交叉性 血清學(xué)反應(yīng)具有高度的特異性，如豬瘟病毒的抗體只與豬瘟病毒結(jié)合。 同一抗原分子可具有多種不同的抗原表位，若兩種不同的抗原具有一個(gè)或多個(gè)相同（相似）的抗原表位，在與相應(yīng)抗體反應(yīng)時(shí)可出現(xiàn)交叉反應(yīng)（cross reacion),2、抗原抗體結(jié)合的可逆性 抗原與抗體的結(jié)合為弱能量的共價(jià)結(jié)合，其結(jié)合力取決于抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原表位之間形成的共價(jià)鍵的數(shù)量、性質(zhì)和距離，由此

3、可分為高親和力、中親和力和低親和力抗體?？乖贵w結(jié)合是分子表面的結(jié)合，該過程受物理、化學(xué)和熱力學(xué)的法則所制約，結(jié)合溫度在040，pH在49。如溫度超過60或pH在3以下，則可解離。,等價(jià)帶表示抗原與抗體比例最合適，形成大而多的結(jié)合物，此時(shí)在反應(yīng)體系中測不出或有極少游離的抗原或抗體；抗體過剩帶（前帶）和抗原過剩帶（后帶）皆表示抗原與抗體的比例不合適，所形成的結(jié)合物少且小，在反應(yīng)體系中存在著較多的游離抗原或抗體,3、抗原抗體結(jié)合的比例性與結(jié)合物的可見性,4、抗原抗體反應(yīng)的階段性 第一階段是抗原抗體的特異結(jié)合，此階段僅需幾秒到幾分鐘，尚無可見反應(yīng) 第二階段為可見反應(yīng)階段，需數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)乃至數(shù)日，受

4、各種因素影響,三、抗原抗體反應(yīng)的主要影響因素,1、抗原和抗體濃度、比例抗原和抗體濃度、比例對抗原抗體反應(yīng)影響最大、是決定性因素，如前所述。 2、電解質(zhì) 3、溫度 4、酸堿度,四 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,一、動(dòng)物疫病診斷 二、動(dòng)植物體內(nèi)生理活性物質(zhì)研究 三、物種及微生物鑒定 四、生物制品研究 五、動(dòng)物疫病致病機(jī)理研究 六、分子生物學(xué)研究,第二節(jié) 凝集反應(yīng) （agglutination） (動(dòng)畫演示),凝集試驗(yàn)是指顆粒性抗原（細(xì)菌、細(xì)胞等） 與相應(yīng)的抗體，或可溶性抗原（亦可用抗體） 吸附于與免疫無關(guān)的載體，形成致敏顆粒（免 疫微球）與相應(yīng)的抗體（或抗原），在有合適 的電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集小塊

5、 。,一、直接凝集試驗(yàn)(direct agglutination test),顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合，并出現(xiàn)凝 集現(xiàn)象的試驗(yàn)，稱直接凝集試驗(yàn)。按操作方法， 分為玻片法和試管法兩種。 1 玻片法 為一種定性試驗(yàn)。是將含有已知抗體的診斷 血清（適當(dāng)稀釋）與待檢菌懸液各一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，出現(xiàn)顆粒狀凝集。方便快速，用于細(xì)菌的鑒定或分型。,直接凝集反應(yīng),顆粒性抗原,凝集素,2 試管法 為一種半定量試驗(yàn)。用以檢測待檢血清中是否存在相應(yīng)抗體和測定該抗體的效價(jià)?？勺鳛榕R床診斷或流行病學(xué)調(diào)查。操作時(shí)將待檢血清進(jìn)行倍比稀釋，然后加入等量抗原，37水浴數(shù)小時(shí)，觀察凝集程度。,二 間接凝集試驗(yàn) （in

6、dirct agglutination）,可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的不溶性顆粒表面，然后與相應(yīng)的抗體（或抗原）作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下，出現(xiàn)特異性的凝集反應(yīng)。 常用的載體有紅細(xì)胞、乳膠、炭粉、離子交換樹脂等?？扇苄钥乖瓰榧?xì)菌的裂解物或浸出液、病毒、寄生蟲分泌物或裂解物、各種蛋白等。,1 間接血凝試驗(yàn) (indirect hemagglutination test) 亦稱為被動(dòng)血凝試驗(yàn)，是將可溶性抗原致敏于紅細(xì)胞表面，用以檢測相應(yīng)抗體。 如用抗體致敏于紅細(xì)胞表面，用以檢測相應(yīng)抗原，稱反向間接血凝試驗(yàn)（reverse passive hemagglutinat

7、ion test).,正向間接凝集反應(yīng),可溶性抗原,載體顆粒,反向間接凝集反應(yīng),抗體,可溶性抗原,載體顆粒,2 乳膠凝集試驗(yàn) （Latex agglutination test) 3 協(xié)同凝集試驗(yàn)（co-agglutination test） 覆蓋有特異性抗體的金黃色葡萄球菌與相應(yīng)的抗原結(jié)合時(shí)，可產(chǎn)生凝集反應(yīng)，稱協(xié)同凝集試驗(yàn).因金黃色葡萄球菌表面有SPA，能與多種動(dòng)物的IgG結(jié)合。,第三節(jié) 沉淀反應(yīng)(precipitation test) 沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在合適電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀。參與反應(yīng)的抗原稱沉淀原，抗體稱沉淀素 。 可溶性抗原分子量小，單位體積內(nèi)所含的量

8、多，在做定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，常稀釋抗原，否則易出現(xiàn)前帶現(xiàn)象。,1 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)（ring precipitation test) 是最簡單的沉淀試驗(yàn)，目前仍使用。在一支小口徑試管內(nèi)，先加入已知抗體，然后小心沿管壁加入待檢抗原疊加于抗體表面。數(shù)分鐘后，液面交界處出現(xiàn)白色環(huán)狀沉淀。如Ascoli試驗(yàn),2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（,瓊脂是一種含有硫酸基的多糖，高溫可溶解于水，冷卻后形成凝膠。其呈多孔結(jié)構(gòu)，內(nèi)充滿水分，1%瓊脂凝膠的孔徑有85nm。因此可允許抗原抗體在里面自由擴(kuò)散。,（1）雙向雙擴(kuò)散 （double diffusion in two dimension) 又稱雙擴(kuò)散。是在1%的瓊脂凝膠板上澆注23 mm的凝膠板，在上面打梅花孔或長方形槽，在相鄰孔內(nèi)加抗原或抗體，在飽和濕度下擴(kuò)散24小時(shí)，觀察沉淀帶。,（2） 雙向單擴(kuò)散 （simple diffusion in two dimension) 又稱輻射擴(kuò)