1、第二章,工業(yè)微生物菌種選育,工業(yè)微生物育種的必要性,發(fā)酵工業(yè)的目的是為人們提供各種各樣的發(fā)酵產(chǎn)品，菌種的特性是發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵，野生菌株不會積累過多的代謝產(chǎn)物，我們需要對野生菌株改造，使其符合人們的要求（高代謝產(chǎn)物及其它特性等）；這個過程就是育種。,工業(yè)微生物育種方法,自然選育 誘變育種 雜交育種 基因工程育種,工業(yè)微生物菌種的篩選步驟,菌株的篩選通常分采樣 富集分離篩選產(chǎn)物鑒別等步驟.,出發(fā)菌株采樣,向菌中保藏機構(gòu)購買或索取 向其它機構(gòu)購買或索取 從自然界采樣,從自然界采樣,從土壤中采樣 根據(jù)微生物特點采樣,從土壤中采樣,土壤有機質(zhì)狀況 土壤酸堿度和植被狀況 地理條件 季節(jié)變化,根據(jù)微生物

2、的生理特點,產(chǎn)纖維素酶 產(chǎn)蛋白酶 產(chǎn)淀粉酶,糖化酶 以碳氫化合物為底物的菌種等,采樣方法,出去表層5CM左右的土層,取525CM的土樣1015克(北方土壤干燥,可在10-30CM處取樣),裝入事先準備好的容器內(nèi),編號并記錄地點 土壤質(zhì)地 植被狀況取樣時間及其它環(huán)境條件等.,富集培養(yǎng),富集培養(yǎng)是根據(jù)微生物的生理特點,設(shè)計一種選擇性培養(yǎng)基,取樣品少許加入培養(yǎng)基中,給目的微生物一個最適的生長環(huán)境,經(jīng)過一定時間的培養(yǎng),目的微生物在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢,可有效地分離出所需要的菌株.,富集培養(yǎng)方法,富集培養(yǎng)主要根據(jù)微生物的碳氮源PH溫度需氧等生理因素加以控制. 舉例一:分離纖維素水解酶產(chǎn)生菌 舉例二:分離耐高

3、滲透壓的酵母,分離,純化分離,包括稀釋分離法和劃線分離法 組織分離法（常用于病變組織或特殊組織） 控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件,控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件,控制培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份 控制培養(yǎng)基的PH 抑制不需要的菌類 加溫處理 利用指示劑或呈色劑的生化反應(yīng)等,工業(yè)微生物的誘變育種,微生物育種是建立在遺傳和變異的基礎(chǔ)上的,一個菌種生物合成代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量由遺傳因素所決定.一個性能好的菌種只有在合適的條件下才能表現(xiàn)出來.因此誘變育種的包括誘變 篩選和優(yōu)化環(huán)境條件三個重要環(huán)節(jié).,人工誘變育種的目的,提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量. 改善菌種特性 提高產(chǎn)品質(zhì)量.例如:孢子生長力強,產(chǎn)泡沫少,需氧量低,抗噬菌體,耐高溫等. 開發(fā)新

4、品種.,人工誘變育種的優(yōu)點,人工誘變育種能加速基因突變,可大大地提高突變株的數(shù)量.具有速度快 收效大 方法簡單等優(yōu)點.,育種前準備工作,了解菌落的特征以及和生產(chǎn)性能的關(guān)系 了解產(chǎn)物的代謝途徑. 了解影響菌種發(fā)育的主要因素. 建立一個準確 簡便 快速檢測突變株和產(chǎn)物的方法. 研究最佳保藏條件.,誘變育種方法與步驟,出發(fā)菌株的選擇. 菌懸液制備. 誘變劑選擇. 誘變處理方法. 突變株純化及分離.,出發(fā)菌株的選擇,選擇具有一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株作出發(fā)菌株. 選擇純種作出發(fā)菌株. 選擇菌株應(yīng)考慮穩(wěn)定性. 采用多出發(fā)菌株. 選擇出發(fā)菌株的其它因素.,出發(fā)菌株的純化,將液體培養(yǎng)物或從斜面移接菌體細胞

5、到0.9%生理鹽水中,按10倍稀釋法,逐一稀釋到10-610-5,從適當(dāng)濃度的稀釋管中吸取0.1毫升,于事先準備好的瓊脂平板上均勻涂抹,培養(yǎng)后,挑取一定數(shù)量(3050個)菌落,進一步培養(yǎng)鑒定,最后確定遺傳性狀穩(wěn)定菌株供誘變處理.,單孢子菌懸液制備,菌懸液要求:對進行誘變的菌體要保持同步,同時又要處在最旺盛的對數(shù)期. 菌懸液制備方法(細菌):把經(jīng)過2024小時培養(yǎng)的新鮮斜面,移到裝有基本培養(yǎng)基的三角瓶中,于370C振動培養(yǎng)到對數(shù)期(1618小時).接著于60C培養(yǎng)1小時, 使之同步生長.然后加入一定濃度的嘧啶和嘌呤繼續(xù)培養(yǎng)2060分鐘.置于低溫(約20C)10分鐘.離心洗滌 .用生理鹽水或緩沖溶

6、液制備菌懸液.,誘變,誘變劑的選擇. 誘變處理方式.,突變株分離和篩選,微生物通過誘變因子處理,群體中產(chǎn)生各種突變體,其中有正突變 負突變和穩(wěn)定型.需經(jīng)過分離篩選,逐個挑出. 突變是隨機不定向的,但篩選是定向的.篩選的條件決定選育方向.,常規(guī)篩選程序,第一次誘變:出發(fā)菌株 誘變分離在平皿上挑選菌落(200個) 初篩(1瓶/株) 選取50株復(fù)篩(35瓶/株) 選取35株(供下次做出發(fā)菌株). 第二次誘變:取上述菌株4株誘變分離到平皿上每株取100個菌落初篩(1瓶/株) 復(fù)篩選取35株供第三次誘變.,篩選方法,隨機篩選:將誘變處理后的菌體分離在瓊脂平板上,隨機挑選菌落,逐個進行鑒定.其優(yōu)點是不管種子或發(fā)酵條件如何,都能做到與大生產(chǎn)條件接近.缺點是效率低. 平板菌落預(yù)選法:根據(jù)菌種及其代謝產(chǎn)物的特性,在平板上設(shè)計許多巧妙的篩選方法和活性粗測方法.,平板菌落預(yù)選法,根據(jù)形態(tài)