1、一、 總 則1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物檢驗(yàn)的基本要求。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。2.儀器和設(shè)備2.1 天平。2.2 高壓滅菌器。2.3 振蕩器。2.4 三角瓶，250mL。2.5 玻璃珠。2.6 琉璃棒。2.7 刻度吸管，1mL、10mL。2.8 研缽或均質(zhì)器。2.9 恒溫水浴箱。3.培養(yǎng)基和試劑3.1 生理鹽水成分：氯化鈉 8.5g蒸餾水加至 1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶90 mL，103.43kPa (121 15 lb)20min高壓滅菌。3.2 SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨 17g大豆蛋白胨 3g氯化鈉 5g磷酸氫二鉀 2.5g

2、葡萄糖 1g吐溫80 7g蒸餾水 1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.27.3分裝，103.43 kPa (121 15 lb)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3 滅菌液體石蠟。3.4 滅菌吐溫80。4.樣品的采集及注意事項(xiàng)4.1 所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機(jī)抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別從兩個(gè)包裝單位以上的樣品中共取10g或10mL。包裝量小于20g的樣品，采樣量可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。4.2 供檢

3、驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗(yàn)前不得打開，防止樣品被污染。4.3 接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。如不能及時(shí)檢驗(yàn)，樣品應(yīng)放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或冷凍。4.4 若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。4.5 在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。4.6 如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個(gè)月。5.供檢樣品的制

4、備5.1 液體樣品5.1.1 水溶性的液體樣品，可量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL，仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5mL則加到45mL滅菌生理鹽水中，混勻后制成1：10檢液。5.1.2 油性液體樣品，取樣品10mL,先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80,在4044水浴中充分混合，制成1：10檢液。5.3 固體樣品稱取10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1：10的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，

5、加入10mL滅菌液體石蠟，10mL吐溫80,70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min5min。二、菌落總數(shù)1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2.定義本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù)（Aerobic bacterial count）是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等），1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。3.儀器和設(shè)備3.1 三角瓶，250mL。3.2 量筒，

6、200mL。3.3 pH計(jì)或精密pH試紙。3.4 高壓滅菌器。3.5 試管：15150mm。3.6 滅菌平皿：直徑9cm。3.7 滅菌刻度吸管，10mL、1mL。3.8 酒精燈。3.9 恒溫培養(yǎng)箱：361。3.10 放大鏡。4.培養(yǎng)基和試劑4.1 生理鹽水：見總則中3.1。4.2 卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.1 成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化鈉 5g瓊脂 15g卵磷脂 1g吐溫80 7g蒸餾水 1000mL4.2.2 制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80,將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調(diào)pH值為7.17

7、.4,加入瓊脂，103.43kPa (121 15 lb)20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。4.3 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC）成分：TTC 0.5g蒸餾水 1000mL溶解后過濾，103.43kPa (121 15 lb)20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4冰箱備用。5.操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢液2mL,分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，制成1：100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)

8、，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：1000,1：10000，等，每種稀釋度應(yīng)更換1支吸管。5.2 將融化并冷至4550的卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15 mL,隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h，為空白對(duì)照。5.3 為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入1mL 0.5%的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變

9、化。6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5倍10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一個(gè)稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2,以代表全皿菌落數(shù)。7.菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法7.1 首先選取平均菌落數(shù)在30個(gè)300個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表1中例1）。7.2 若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30個(gè)300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值

10、來決定，若其比值小于或等于2,應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表1中例2及例3）。7.3 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例4）。7.4 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個(gè)，剛應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例5）。7.5 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30個(gè)300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例6）。7.6 若所有的稀釋度均無菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g或每mL小于10 CFU。7.7 菌落

11、計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來表示（見表1報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1 細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方式例次不同稀釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度菌數(shù)之比菌落總數(shù)(CFU/mL或CFU/g）報(bào)告方式(CFU/mL或CFU/g）10-110-210-311365164201640016000或1.610422760295461.63800038000或3.810432890271602.22710027000或2.71044不可計(jì)46505

12、13或5.1105527115270270或2.71026不可計(jì)305123050031000或3.11047000110110*CFU：菌落形成單位。三、糞大腸菌群1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2.定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群（Fecal coliforms）系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在440.5培養(yǎng)24h48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌直接來自糞便，是重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。3.儀器3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：440.5。3.2 溫度計(jì)。3.3 顯微鏡。3.4 載玻片。3.5 接種環(huán)。3.6 電磁爐。3.7 三角

13、瓶，250mL。3.8 試管：15150mm。3.9 小倒管。3.10 pH計(jì)或pH試紙。3.11 高壓滅菌器。3.12 滅菌吸管，10mL、1mL。3.13 滅菌平皿：直徑90mm。4.培養(yǎng)基和試劑4.1 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白胨 40g豬膽鹽 10g乳糖 10g0.4%溴甲酚紫水溶液 5mL卵磷脂 2g吐溫80 14g蒸餾水 1000mL制法：將卵磷脂、吐溫80溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、豬膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào)pH到7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管（每支試管中加一個(gè)小倒管）。68.95kPa (115 10 lb)20min

14、高壓滅菌。4.2 伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂成分：蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 20g2%伊紅水溶液 20mL0.5%美藍(lán)水溶液 13mL蒸餾水 1000mL制法：先將瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000mL。校正pH值為7.27.4,分裝于三角瓶?jī)?nèi)，103.43kPa (121 15 lb)15min高壓滅菌備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60左右無菌操作加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。4.3 蛋白胨水（做靛基質(zhì)試驗(yàn)用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g氯化鈉 5g蒸餾水 1000mL制法

15、：將上述成分加熱融化，調(diào)pH值為7.07.2.分裝小試管，103.43kPa (121 15 lb)15min高壓滅菌。4.4 靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白胨水中，于440.5培養(yǎng)24h2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL0.5mL，輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。4.5 革蘭氏染色液：4.5.1 染液制備4.5.1.1 結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 1g95%乙醇 20mL1%草酸銨水溶液 80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨

16、溶液混合。4.5.1.2 革蘭氏碘液：碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水加至 300mL將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。4.5.1.3 脫色液：95%乙醇。4.5.1.4 復(fù)染液：（1）沙黃復(fù)染液：沙黃 0.25g95%乙醇 10mL蒸餾水 90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。（2）稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇100mL,放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL,混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水90mL,即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.5.2 染色法4.5.2.1 將涂片在火焰上固定，

17、滴加結(jié)晶紫染色液，染1min,水洗。4.5.2.2 滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。4.5.2.3 滴加95%乙醇脫色，約30s,或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色10s,水洗。4.5.2.4 滴加復(fù)染液，復(fù)染1min,水洗，待干，鏡檢。4.5.3 染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1：10稀釋石碳酸復(fù)紅液做復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需10s。5.操作步驟5.1 取10mL 1：10稀釋的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置440.5培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。5.2 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種到伊紅

18、美藍(lán)瓊脂平板上，置361培養(yǎng)18h24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白胨水中，置440.5培養(yǎng)24h2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。5.3 挑取上述可疑菌落，涂片做革蘭氏染色鏡檢。5.4 在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL,觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。6.檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，靛基質(zhì)試

19、驗(yàn)陽性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。四、銅綠假單胞菌1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗(yàn)。2.定義本規(guī)范采用了下列定義銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在421條件下能生長(zhǎng)。該菌對(duì)人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3.儀器3.1 培養(yǎng)箱：421、361。3.2 三角瓶，250mL。3.3 試管：15150mm。3.4 滅菌平皿：直徑90mm。3.5 滅菌刻度吸管，10mL、1mL。3.6 顯微鏡。3.7

20、 載玻片。3.8 接種針，接種環(huán)。3.9 電磁爐。3.10 高壓滅菌器。4.培養(yǎng)基和試劑4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基見總則中3.2。4.2 十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分：牛肉膏 3g蛋白胨 10g氯化鈉 5g十六烷基三甲基溴化銨 0.3g瓊脂 20g蒸餾水 1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.47.6,加入瓊脂，68.95kPa (115 10 lb)20min滅菌后，制成平板備用。4.3 乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺 10.0g氯化鈉 5.0g無水磷酸氫二鉀 1.39g無水磷酸二氫鉀 0.73g硫酸鎂（MgSO4.7H2O） 0.5g酚紅 0.012g瓊脂 20g

21、蒸餾水 1000mL制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2,加入瓊脂、酚紅，103.43kPa (121 15 lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。4.4 綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨 20g氯化鎂 1.4g硫酸鉀 10g瓊脂 18g甘油（化學(xué)純） 10g蒸餾水 1000mL制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使其溶解，調(diào)pH至7.4,加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，68.95kPa (115 10 lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5 明膠培養(yǎng)基成分： 牛肉膏 3g蛋白胨 5g明膠 120g蒸餾水 1000mL制法：取

22、各成分加到蒸餾水中浸泡20min,隨即攪拌加溫使之溶解，調(diào)pH至7.4,分裝于試管內(nèi)，經(jīng)68.95kPa (115 10 lb)20min高壓滅菌后，直立制成高層備用。4.6 硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨 10g酵母浸膏 3g硝酸鉀 2g亞硝酸鈉 0.5g蒸餾水 1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào)pH為7.2,煮沸過濾后補(bǔ)足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，68.95kPa (115 10 lb)20min高壓滅菌后備用。4.7 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 5g瓊脂 15g蒸餾水 1000mL制法：

23、除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7.27.4,加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，103.43kPa (121 15 lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.操作步驟5.1 增菌培養(yǎng)：取1：10樣品稀釋液10mL加到90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置361培養(yǎng)18h24h。如有銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。5.2 分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置361培養(yǎng)18h24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴(kuò)散或略在蔓延，表面濕潤(rùn)，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此

24、培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，大腸埃希氏菌不能生長(zhǎng)，革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)較差。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種于平板上，置361培養(yǎng)24h2h，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其它菌落不生長(zhǎng)。5.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。5.4 氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙上，然后在其上滴加一新配制的1%二甲基對(duì)苯二胺試液，在15s30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗(yàn)陰性。

25、5.5 綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落2個(gè)3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測(cè)定培養(yǎng)基上，置361培養(yǎng)24h2h,加入氯仿3mL5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中，置361培養(yǎng)24h2h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?.7 明膠液化試驗(yàn)，取銅綠假單胞菌可

26、疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置361培養(yǎng)24h2h,取出放冰箱10min30min,如仍呈溶解狀或表面溶解時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽性；如凝固不溶者為陰性。5.8 42生長(zhǎng)試驗(yàn)：挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在421培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h48h,銅綠假單胞菌能生長(zhǎng)，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長(zhǎng)。6.檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42生長(zhǎng)試驗(yàn)三者皆為陽性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。五、金黃色葡

27、萄球菌1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2.定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽孢，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對(duì)人類致病力最強(qiáng)的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致敗血癥。3.儀器和設(shè)備3.1 顯微鏡。3.2 恒溫培養(yǎng)箱：361。3.3 離心機(jī)。3.4 滅菌吸管，1mL、10mL。3.5 滅菌試管：15150mm。3.6 載玻片。3.7 酒精燈。4.培養(yǎng)基和試劑4.1 SCDLP液體培養(yǎng)基見總則中3.2。4.2 7.

28、5%的氯化鈉肉湯成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 75g蒸餾水加至 1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)pH為7.4,分裝，103.43kPa (121 15 lb)15min 高壓滅菌。4.3 Baird Parker 氏培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨 10g牛肉膏 5g酵母浸膏 1g丙酮酸鈉 10g甘氨酸 12g氯化鋰（LiCl6H2O） 5g瓊脂 20g蒸餾水 950mLpH 7.00.2增菌劑的配制：30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至251校正pH。分裝每瓶95mL,103.43kPa (12

29、1 15 lb)高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，每95mL加入預(yù)熱至50左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h2h。4.4 血瓊脂培養(yǎng)基成分：營(yíng)養(yǎng)瓊脂 100mL脫纖維羊血（或兔血） 10mL制法：將營(yíng)養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50左右無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。4.5 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨 10g氯化鈉 5g甘露醇 10g牛肉膏 5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液 12mL蒸餾水 1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH 7.4，加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，

30、68.95kPa (115 10 lb)20min滅菌備用。4.6 兔（人）血漿制備取3.8%檸檬酸鈉溶液，103.43kPa (121 15 lb)30min高壓滅菌，1份加兔（人）全血4份，混勻靜置；2000rpm3000rpm離心3min5min。血球下沉，取上面血漿。5.操作步驟5.1 增菌：取1：10稀釋的樣品接種到90mL SCDLP液體培養(yǎng)基中，置361培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h2h。注：如無此培養(yǎng)基也可用7.5%氯化鈉肉湯。5.2 分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在Baird Parker氏培養(yǎng)基，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置361培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h48h。在

31、血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird Parker氏培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，直徑2mm3mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個(gè)菌落分純?cè)谘傊桨迳希?61培養(yǎng)24h2h。5.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽孢，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5m1m。5.4 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入2mm3mm高的滅菌液體石蠟，置361培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h2h,金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5 血漿凝固酶試驗(yàn)：吸取1：4新鮮血漿0.5 mL,放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h2h肉湯培養(yǎng)物0.5 mL?；靹?，放361恒溫箱或恒溫水浴中，每半個(gè)小時(shí)觀察一次，6h之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時(shí)以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5 mL,分別加入滅菌1：4血漿0.5