1、第三十章 層析法測(cè)定生化物質(zhì),第2頁(yè),第三節(jié) 治療藥物測(cè)定,一、TDM的方法學(xué)概述 藥物的檢測(cè)采用臨床化學(xué)的常用技術(shù)。體液中的藥物為微量，其檢測(cè)不僅受結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)源性物質(zhì)干擾，還易受和原型藥僅有微小差別的代謝物干擾。而一些藥物除原型藥外，還需同時(shí)測(cè)定具藥理活性的代謝物，對(duì)檢測(cè)方法有較高要求。因此,常規(guī)的檢測(cè)方法不能滿足藥物檢測(cè)的靈敏度與特異性的要求。目前常用的體液中藥物濃度測(cè)定法有層析法、免疫化學(xué)方法等。,第3頁(yè),第3頁(yè),1.層析法,包括定量薄層法、氣相色譜法及高效液相色譜法等，其共同的特點(diǎn)是分離度好、專屬性強(qiáng)，可以同時(shí)測(cè)定幾種藥物。薄層色譜法雖然不斷改進(jìn)點(diǎn)樣定量技術(shù)并用掃描定量，但其靈敏度和

2、重復(fù)性仍差，除用于毒物的定性檢測(cè)外，在TDM中極少應(yīng)用。高效液相色譜法應(yīng)用最廣，美國(guó)的藥典規(guī)定大部分藥物的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法為高效液相色譜法，并常用作評(píng)估其他方法的參考方法。,第4頁(yè),1.層析法,近年還發(fā)展了HPLC-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-tandem mass spectrometers, LC-MS)，更進(jìn)一步提高了特異性和靈敏性，分離性能好,在檢測(cè)藥物的代謝物有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。興奮劑的檢測(cè)，則要求必須用HPLC-MC法。本法缺點(diǎn)是儀器昂貴,技術(shù)要求高，測(cè)定費(fèi)時(shí)，其專用性強(qiáng)，一臺(tái)儀器在同一時(shí)間內(nèi)只能測(cè)定一種或一類藥物,需要相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的訓(xùn)練, 需復(fù)雜的樣本預(yù)處理, 限制了其推廣普及。,第5頁(yè),第5頁(yè),2

3、.免疫化學(xué)方法,不少藥物都是半抗原或抗原，可制備藥物相應(yīng)的特異性抗體，用免疫化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。免疫化學(xué)方法靈敏度高，可達(dá)ng甚至pg水平，可滿足所有藥物TDM的要求。免疫化學(xué)方法包括放射免疫、酶免疫、熒光免疫、化學(xué)發(fā)光免疫等方法，其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，取樣少，操作簡(jiǎn)單，樣本不需要進(jìn)行預(yù)處理。放射免疫法同位素污染，需有防護(hù)設(shè)備，由于衰變和輻射自分解導(dǎo)致標(biāo)記物有效使用時(shí)間縮短，該法極少采用。,第6頁(yè),2.免疫化學(xué)方法,酶免疫法，成本低，測(cè)定快速,幾十分鐘多至幾小時(shí)能完成一個(gè)樣品測(cè)定,但靈敏度較差,極少藥物采用此法測(cè)定?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)、熒光偏振免疫法、微粒體發(fā)光技術(shù)、電化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨熒光免疫分析法

4、等方法的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性均佳，檢測(cè)周期短,自動(dòng)化程度高,操作簡(jiǎn)便,適用于急診和大量樣本的測(cè)定，發(fā)達(dá)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室通常采用此法，國(guó)內(nèi)應(yīng)用也漸增多。,第7頁(yè),（1）光譜分析法 包括可見(jiàn)光紫外分光光度法（UV）、熒光分光光度法、火焰發(fā)射光譜法和原子吸收光譜法等。分光光度法由于其專一性差,容易受血液中其他組分的干擾,在測(cè)定前必須進(jìn)行粗分離、抽取、濃縮,即使這樣,單獨(dú)用于測(cè)定血藥濃度時(shí)常常受到靈敏度的限制，操作繁瑣。如與層析法結(jié)合使用,可以大大提高其專一性,不易受其他藥物或內(nèi)源性物質(zhì)的干擾?；鹧姘l(fā)射光譜法和原子吸收光譜法則為鋰等金屬離子藥物測(cè)定的常用方法。,第7頁(yè),3.其他技術(shù),第8頁(yè),（2）毛細(xì)管電

5、泳技術(shù) 采用高電場(chǎng)強(qiáng)度的電泳方式,具有微量、高效、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、速度快、自動(dòng)化，不需要溶劑，僅用緩沖液，但儀器昂貴等特點(diǎn)。 （3）抑菌試驗(yàn) 曾用于抗菌藥物濃度測(cè)定,但由于其僅為分級(jí)式半定量,并且影響因素多,特異性、靈敏度、重復(fù)性都差。,第8頁(yè),3.其他技術(shù),第9頁(yè),1氣相色譜法 樣品經(jīng)過(guò)去除蛋白后，再用有機(jī)溶劑提取其待測(cè)藥物，使溶劑揮發(fā)，用一定量溶劑將殘?jiān)厝芎蠹纯稍谝欢l件下進(jìn)樣分析。當(dāng)樣品進(jìn)入氣化室后，在一定溫度下樣品內(nèi)各組分被瞬間氣化，并由載氣（流動(dòng)相）帶入分離柱，在分離柱的固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配，最后因分配系數(shù)不同而被相互分離。待各組分先后進(jìn)入監(jiān)測(cè)室后便產(chǎn)生相應(yīng)的信號(hào)，由記錄

6、儀記錄各組分的色譜峰。根據(jù)出峰時(shí)間（保留時(shí)間）和峰面積即可計(jì)算出樣品中所含藥物的濃度。目前，氣相色譜法是丙戊酸的主要檢測(cè)方法。,第9頁(yè),二、抗癲癇藥物的層析法測(cè)定,第10頁(yè),第10頁(yè),二、抗癲癇藥物的層析法測(cè)定,2高效液相層析法 一般采用反相高效液相色柱分離和紫外檢測(cè)器(或其他檢測(cè)器)檢測(cè)。首先需要用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ缂状迹┏悠分械牡鞍撞⑻崛∑渲械乃幬铩．?dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)通過(guò)層析分析柱時(shí)，因其理化性質(zhì)的差異而在柱上保留時(shí)間不同，極性強(qiáng)的物質(zhì)在反相C18柱上的保留時(shí)間短，出峰快；極性弱的物質(zhì)則相反。因此，經(jīng)層析柱可把苯巴比妥、苯妥因鈉及卡馬西平分離，根據(jù)其各自的峰高，從校正曲線方程求出其濃度。本法可同時(shí)監(jiān)測(cè)幾種抗癲癇藥物。,第11頁(yè),1氣相層析法 由于分析是在氣態(tài)下進(jìn)行的，故對(duì)那些熔點(diǎn)高、揮發(fā)性差、對(duì)熱不穩(wěn)定或極性大的藥物此法不太適合，例如苯妥英鈉、撲癇酮及苯巴比妥的血藥濃度測(cè)定。如與質(zhì)譜聯(lián)用可進(jìn)一步提高其檢出能力和精確度。,第11頁(yè),三、層析法測(cè)定抗癲癇藥的方法性能評(píng)價(jià),第12頁(yè),三、層析法測(cè)定抗癲癇藥的方法性能評(píng)價(jià),2高效液相層析法 HPLC可與質(zhì)譜聯(lián)用，迅速地對(duì)藥物進(jìn)行定性、定量分析。此法的優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)完成多個(gè)項(xiàng)目的分析,是多數(shù)臨床