1、1,植物基因工程是80年代開始興起和發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它是在分子遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)上，綜合采用了分子生物學(xué)、微生物學(xué)和植物組織培養(yǎng)的現(xiàn)代方法和技術(shù)建立起來的。 轉(zhuǎn)移的目的基因可從動(dòng)物、人、植物或微生物中獲取。 植物基因工程首先是隨原核生物的基因工程的發(fā)展而得以發(fā)展。大腸桿菌，酵母，動(dòng)植物細(xì)胞。,2,植物基因工程發(fā)展迅速。自從1983年首例轉(zhuǎn)基因植物（煙草）誕生以來，現(xiàn)在已有100多種植物通過基因工程技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，包括番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、胡蘿卜、芹菜、萵苣、甜瓜、黃瓜、白菜、甘藍(lán)、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋蔥、柑橘、柿、楊樹、桉樹等。,3,2 植物基因工程的載體,Ti載體 其它載體

2、 RNAi,4,根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的Ti質(zhì)粒（Tumor-inducing plasmid）的改建與利用，從而開創(chuàng)了植物基因工程的新紀(jì)元。,根癌農(nóng)桿菌,5,6,7,8,TDNA,9,植物基因工程中，我們把接受外源(目的)基因的生命體系稱為“受體”。 受體包括：葉圓片(盤)、胚性愈傷、胚狀體、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等不同的形態(tài)。 其基本形態(tài)還是細(xì)胞。 葉圓片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是最簡單的轉(zhuǎn)化方法；愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率高、生長速度快，是快速檢測外源基因表達(dá)的最好受體；原生質(zhì)體則是單克隆轉(zhuǎn)化的最佳材料。,3 植物基因轉(zhuǎn)化的受體,10,轉(zhuǎn)化植株,（未）受精卵

3、細(xì)胞,花粉,胚,胚軸,子葉,葉片,莖段,萌發(fā)種子,子房,原生質(zhì)體,懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,花器官,根,創(chuàng)傷植株,塊莖,莖尖,植物基因轉(zhuǎn)化的外植體,11,被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞是單個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。 以懸浮細(xì)胞作受體的轉(zhuǎn)化方法包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、電激法和顯微注射法等。,3.1 懸浮細(xì)胞,12,原生質(zhì)體是無細(xì)胞壁的細(xì)胞。 與懸浮細(xì)胞一樣，被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞是單個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞，為選擇遺傳均一性的轉(zhuǎn)基因植株提供了可能性。,3.2 原生質(zhì)體,13,愈傷組織容易大量制備 愈傷組織的轉(zhuǎn)化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上獲得成功。 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法最適合。,3.3 胚性愈傷

4、組織,14,胚狀體是由愈傷組織經(jīng)過改造后分化而來的，其轉(zhuǎn)化方法與愈傷組織相同。,3.4 胚狀體,15,葉圓片是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要受體。 也稱為葉盤法。 用打孔器或解剖刀切取直徑35mm的葉圓片； 在液體培養(yǎng)瓶中與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)20-30min； 將葉圓片在濾紙上吸干； 轉(zhuǎn)移到非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d； 再移入含抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)； 誘導(dǎo)植株再生； 獲得轉(zhuǎn)基因植株。 葉盤法常見于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。,3.5 葉圓片,16,如子葉、胚軸、莖段、根、體細(xì)胞胚、花粉等,3.6 其他受體,17,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Agrobacterium-mediated transformation) 基因槍轉(zhuǎn)化法(

5、Microprojectile bombardment) 聚乙二醇-介導(dǎo)法(PEG-mediated transfomation) 電激法(Electroporation) 花粉管通道法(Pollen-tubepathway) 顯微注射法(Microinjection) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Liposomes transformation) 激光微束轉(zhuǎn)化法(Laser microbeam puncture),4 植物基因轉(zhuǎn)化的方法,18,根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacience)介導(dǎo)法是植物基因轉(zhuǎn)化中使用最普遍的一種方法。 其Ti質(zhì)粒(Tumor-inducing plasmi

6、d)具有將DNA整合到植物染色體上，并使之與植物內(nèi)源基因同步表達(dá)的能力。 每個(gè)Ti質(zhì)粒都有3個(gè)功能區(qū)域。一是T-DNA區(qū)，即轉(zhuǎn)化DNA區(qū)，與病癥發(fā)生有關(guān)的基因位于這個(gè)區(qū)，決定著腫瘤形態(tài)和冠癭堿的合成；二是Vir區(qū)，是T-DNA區(qū)以外的與感染腫瘤有關(guān)的區(qū)域；三是分解和利用冠癭堿的區(qū)域，分布著冠癭堿分解酶基因。,4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,19,4.2 微彈轟擊法,原理：金屬微粒在外力作用下達(dá)到一定速度后，可以進(jìn)入植物細(xì)胞，但又不引起細(xì)胞致命傷害，仍能維持正常的生命活動(dòng)。也稱為基因槍法。 利用這一特性，先將含目的基因的外源DNA同鎢、金等金屬微粒混勻，使DNA吸附在金屬微粒表面，隨后用基因槍轟擊，使DN

7、A隨高速金屬微粒進(jìn)入植物細(xì)胞。 此方法可直接處理植物某器官或某組織，是當(dāng)今普遍使用的植物轉(zhuǎn)基因方法。,20,21,聚乙二醇介導(dǎo)法與PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的機(jī)理相似，不同的是后者發(fā)生在原生質(zhì)體之間，而前者發(fā)生在原生質(zhì)體與DNA之間。 在高濃度的二價(jià)鈣離子(Ca2+)和高pH值的條件下，略帶負(fù)電的高分子PEG可能促進(jìn)DNA向原生質(zhì)體膜沉淀，或參與原生質(zhì)體的內(nèi)吞作用下，使外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體和細(xì)胞核，并整合到染色體上。,4.3 聚乙二醇-介導(dǎo)法,22,4.4 電激法,原理：細(xì)胞膜的基本組成是磷脂，在適當(dāng)?shù)耐饧用}沖電場作用下，細(xì)胞膜被擊穿，但還達(dá)不到細(xì)胞致命傷害。所以當(dāng)移去外加電場后，被擊穿的膜

8、孔可自行復(fù)原。也稱為電穿孔法。 根據(jù)這一性質(zhì)，植物原生質(zhì)體同外源DNA分子混合，置于電擊儀的樣品室中，按預(yù)定的參數(shù)進(jìn)行直流電脈沖處理，再通過常規(guī)的再分化培養(yǎng)和篩選，可獲得轉(zhuǎn)基因植株。 為避免制備原生質(zhì)體和原生質(zhì)體再生植株的困難，近來用此技術(shù)直接處理具有完整細(xì)胞壁的植物細(xì)胞、愈傷組織和花粉粒，均取得一定的效果。,23,24,25,4.5 花粉管通道法,原理：將重組DNA涂于授粉的柱頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具有正常細(xì)胞壁的卵、合子和早期的胚胎細(xì)胞，在活體內(nèi)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因種子。,26,花粉管通道法,27,4.6 顯微注射法,原理：利用顯微注射儀將外源DNA直接注入受

9、體的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。 重要問題：必須把受體細(xì)胞進(jìn)行固定。 動(dòng)物細(xì)胞具有獨(dú)特的貼壁生長待性，因此不存在固定細(xì)胞的問題。 植物細(xì)胞的顯微注射必須建立固定細(xì)胞技術(shù)。目前有三種方法：瓊脂糖（低熔點(diǎn)）包埋法；多聚-L-賴氨酸粘連法；吸管（毛細(xì)管）支持法。,28,4.7 脂質(zhì)體介導(dǎo)法,原理：脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，把用來轉(zhuǎn)染的DNA分子包在其中，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞接觸，將外源DNA導(dǎo)人受體細(xì)胞。 包裝成脂質(zhì)體的DNA的轉(zhuǎn)染串比裸露的DNA的轉(zhuǎn)染率高出100倍。 如先用PEG處理培養(yǎng)的受體細(xì)胞，使其易吸收培養(yǎng)基中的脂質(zhì)體，可提高轉(zhuǎn)染率1020倍。 在正常情況下，每個(gè)細(xì)胞平均可吸收10

10、00個(gè)左右的脂質(zhì)體。這是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法之一。,29,4.8 激光微束穿孔法,原理：利用直徑很?。{米級）、能量很高的激光微束可引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下用激光處理細(xì)胞，處于細(xì)胞周圍的重組DNA隨之進(jìn)入細(xì)胞。 此方法最適用于活細(xì)胞中線粒體和葉綠體等細(xì)胞器的基因轉(zhuǎn)移。,30,31,植株再生是基因轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，直接決定能否獲得轉(zhuǎn)基因植株。 兩種形式： 一種是愈傷組織再生 另一種是直接再生，從外植體直接誘導(dǎo)出芽而不經(jīng)過愈傷組織的分化。 轉(zhuǎn)墓因植株再生的方式與一般植株再生的方式相同，主要區(qū)別是轉(zhuǎn)基因植株的再生受外源基因、載體系統(tǒng)、抗生素、轉(zhuǎn)化過程的影響。,5 轉(zhuǎn)基因植株

11、的再生及其檢測方法,5.1 轉(zhuǎn)基因植株再生,32,常采用報(bào)告基因作為標(biāo)記，以便快速檢測。 主要采用分子生物學(xué)方法檢測，包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、Southern Blot、Northern Blot和Western Blot等方法。 進(jìn)行分子生物學(xué)檢測以后還要進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以確定基因是否可以正常地表達(dá)性狀，并穩(wěn)定地遺傳給后代。 如果一些有價(jià)值的目的基因被轉(zhuǎn)入，還必須鑒定基因的功能及其表型。,5.2 轉(zhuǎn)基因植株的檢測,33,如轉(zhuǎn)化抗病毒基因：要對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行病毒接種，以鑒定抗病毒能力。 若轉(zhuǎn)化的基因?yàn)榭钩輨┗颍哼€要對植物噴灑除草劑進(jìn)行檢測。 若轉(zhuǎn)基因植物是食用糧食作物或油料：還要通

12、過轉(zhuǎn)基因植物的安全性檢測，以免對人類和環(huán)境造成危害。 如果轉(zhuǎn)化的是花色素合成酶基因：則憑肉眼就可直觀鑒定花色變化。,34,35,6 植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性國際大討論,36,斑蝶事件：1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在Nature雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致44的幼蟲死亡。 現(xiàn)在這個(gè)事件也有了科學(xué)的結(jié)論： 第一，玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米地以外米，每一平方厘米馬利筋葉片上只找到一個(gè)玉米花粉。 第二，2000年開始在美國三個(gè)州和加拿大進(jìn)行的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中用10倍于

13、田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。 斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。,37,加拿大“超級雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”。 事實(shí)上，這種油菜在噴施另一種除草劑2，4-后即被全部殺死。 應(yīng)當(dāng)指出的是，“超級雜草”并不是一個(gè)科學(xué)術(shù)語，而只是一個(gè)形象化的比喻，目前并沒有證據(jù)證明已經(jīng)有“超級雜草”的存在。 同時(shí)，基因漂流并不是從轉(zhuǎn)基因作物開始，而是歷來都有。如果沒有基因漂流，就不會有進(jìn)化，世界上也就不會有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。,38,墨西哥玉米

14、事件：2001年11月，美國加州大學(xué)伯克萊分校的兩位研究人員在Nature上發(fā)表文章，聲稱在墨西哥南部Oacaca地區(qū)采集的個(gè)玉米地方品種樣本中，發(fā)現(xiàn)有CaMV 35S啟動(dòng)子及Novartis Btll抗蟲玉米中的adh1基因相似序列。 綠色和平組織借此大肆渲染，說墨西哥玉米已經(jīng)受到了“基因污染”，甚至指責(zé)墨西哥小麥玉米改良中心的基因庫也可能受到了“基因污染”。 文章發(fā)表后受到很多科學(xué)家的批評，。所謂測出的35S啟動(dòng)子，經(jīng)復(fù)查證明是假陽性。所稱玉米中的adh1基因已經(jīng)轉(zhuǎn)到了墨西哥玉米的地方品種，也是假的。 轉(zhuǎn)入玉米中的基因序列是adh1 -S基因，而作者測出的是玉米中本來就存在的adh1 -I

15、F基因，兩者的基因序列完全不同，是兩碼事。顯然作者沒有比較這兩個(gè)序列，審稿人和 Nature 編輯部也沒有核實(shí)。 墨西哥小麥玉米改良中心（CIMMYT）也發(fā)表聲明指出，經(jīng)對種質(zhì)資源庫和新近從田間收集的152份材料的檢測，在墨西哥任何地區(qū)都沒有發(fā)現(xiàn)35S啟動(dòng)子。,39,中國抗蟲棉破壞環(huán)境事件：2003年月日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會議，月日China Daily上發(fā)表了題為“GM Cotton Damage Environment”的文章，亦即“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉破壞了環(huán)境” 。 綠色和平組織也于當(dāng)天在其網(wǎng)站上刊登了南京環(huán)科所、綠色和平組織顧問薛達(dá)元先生長達(dá)26頁的英文報(bào)告，從而再次引發(fā)國

16、際爭論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響，成為國際上爭論轉(zhuǎn)基因作物安全性的重大事件之一。,40,6月5日德國農(nóng)業(yè)報(bào)發(fā)表了題為“Chinese Research: large Environment Damage by Bt Cotton”的文章，即：“中國研究：Bt棉破壞環(huán)境巨大”。 綠色和平組織的“中國項(xiàng)目主管”盧思聘聲稱：棉農(nóng)“將面對不受控制的超級害蟲”（這里他又全無科學(xué)根據(jù)地提出了“超級害蟲”的新名詞?。?，“聲稱可以減少農(nóng)藥使用的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”，“（棉農(nóng)）將被迫使用更多、更毒的化學(xué)農(nóng)藥”。 抗蟲棉在中國實(shí)踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎，相信不會同意他的這些結(jié)論。中

17、國、美國、德國、加拿大、比利時(shí)、印度等國的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評論，反駁綠色和平組織的觀點(diǎn)。,41,（1）國際轉(zhuǎn)基因作物爭論的實(shí)質(zhì)并不純粹是科學(xué)問題，而是經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易問題?，F(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。 （2）爭論應(yīng)該以科學(xué)為基礎(chǔ)，目前批準(zhǔn)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品還沒有發(fā)現(xiàn)環(huán)境和食品安全性問題。長期效應(yīng)需要跟蹤，包括非預(yù)期效應(yīng)，但非預(yù)期效應(yīng)的分析必須與安全性評價(jià)相結(jié)合。 （3）歸結(jié)到一點(diǎn)，今天與反生物技術(shù)組織的爭論，是要不要轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品、要不要科學(xué)和社會文明進(jìn)步的問題。他們的根本出發(fā)點(diǎn)是要禁止一切生物技術(shù)！而我們則是在保證環(huán)境和人類健康的同時(shí)促進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展，這是兩者的根本區(qū)別所在。,爭論的實(shí)質(zhì),42,7 植物轉(zhuǎn)基因的成果,一、植物新品種的培養(yǎng) （1）利用DNA重組技術(shù)將目的基因轉(zhuǎn)入蔬菜中，培育成的蔬菜稱為轉(zhuǎn)基因蔬菜，它主要是用來選育具有特殊優(yōu)良性狀的(如抗蟲、抗病、抗除草劑等)蔬菜新品種。 （2）通過基因工程手段，培育出高抗、優(yōu)質(zhì)林、草新品種。,43,利用轉(zhuǎn)基因植物作為反應(yīng)器，把外源基因引入植物體內(nèi)以生產(chǎn)醫(yī)用多肽和醫(yī)用疫苗正成為繼轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以后又一新興的研究領(lǐng)域。 生物學(xué)家把機(jī)體的免疫機(jī)理與植物DNA重組技術(shù)相結(jié)合，將激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)