1、細胞間基本規(guī)定每次操作結束后開啟超凈臺紫外（30 min）和房間大紫外（30 min）。顯微鏡開啟使用后將光調(diào)暗，最后一個操作者將顯微鏡關閉。超凈臺用完收拾干凈，移液器、盒子等擺放整齊。帶走空盒子、細胞圓盤以及封口膜等任何因你而產(chǎn)生的垃圾。細胞培養(yǎng)盤至少需備注：所屬者，細胞系名稱細胞間冰箱內(nèi)物品至少需備注：所屬者，物品名稱?；嘈鑼懮祥_啟時間。細胞培養(yǎng)標準流程1、 細胞換液、傳代（以圓盤培養(yǎng)為例）Note：所有用于培養(yǎng)細胞的液體均需提取20-30分鐘從冰箱取出恢復到室溫或置于37的水浴箱內(nèi)。所有物品（包括雙手）進入安全柜之前要酒精消毒。步驟：1.觀察：高倍鏡下觀察細胞狀態(tài)、密度以及是否染菌 2

2、.棄舊：細胞生長融合達90%時，吸出培養(yǎng)基 3.漂洗：PBS（2mL） 漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，輕輕晃動圓盤讓所有細胞接觸到胰酶，后吸去胰酶計時CO2 放置40s-1min,，輕輕拍打圓盤側壁促使細胞脫壁。 5.終止：吸棄胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。 6.吹懸：輕輕吹打混勻，(倒置顯微鏡下觀察細胞完全脫壁，呈卵圓形)，吹打成單細胞懸液后按1：2 或1：3 比例傳代接種于新培養(yǎng)皿。再加入10ml全培。（大盤10ml全培，小盤6ml全培）（細胞生長快留30%，慢40%-50%；其余細胞可提取蛋白或RNA） 7.培養(yǎng)：每天或每兩天更換一次培養(yǎng)基

3、，直至細胞生長至融合時再次進行傳代，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。PS:六孔板一般加培養(yǎng)基2300L/孔。2、 細胞轉染 TurboFect 轉染試劑轉染（用于質粒的轉染，說明書附后）細胞接板24 h 后轉染。轉染時細胞密度需達到70-90%。以6 孔板為例，轉染前細胞先換液，加4ml全培。取1.5 ml 離心管，加入400 L 無血清無雙抗DMEM 培養(yǎng)液，加入質粒2 g，混勻后靜置5 min，再轉染試劑4 L，混勻（轉染試劑是質粒的2倍），室溫靜置1520 min。(轉染試劑需加在培養(yǎng)液中部，切忌勿貼壁;靜置時間不可超過20 min）無血清無雙抗DMEM量全培體積的10。如6孔

4、板加4mL培養(yǎng)液培養(yǎng)，即轉染體系為400ul無血清無雙抗DMEM。緩慢均勻加到培養(yǎng)液后，輕輕晃動圓盤，使其均勻分布。轉染后6h后細胞換液，排除試劑的毒性影響。2448 h 后收集細胞用于后續(xù)實驗。Note：如果用這種方法轉染效率一直不佳，可以在接種細胞前，把轉染試劑配好，把轉染試劑加到培養(yǎng)盤上，再把細胞接種上。該方法不適用所有細胞，這種方法會導致細胞死亡，不貼壁。HiPerFect轉染試劑轉染（用于siRNA的轉染，說明書附后）For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA以6 孔板為例，轉染之前，以2mL全培接種1.5-61

5、05細胞于6孔板每孔。將細胞放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至轉染。（前50%-染90%）取1.5 ml 離心管，加入100 L 無血清無雙抗DMEM 培養(yǎng)液，加入siRNA(20uM濃度，相當于0.25ug/L)5uL,轉染試劑12L，輕輕混勻，室溫靜置5-10 min。siRNA：轉染試劑：無血清無雙抗DMEM 5uL：12ul：100ul。（比例待定）將步驟3混合液緩慢均勻加到培養(yǎng)液后，輕輕晃動圓盤，使其均勻分布。2448 h 后收集細胞用于后續(xù)實驗。3、 細胞凍存 （慢凍快融）1） 配凍存液：全培10%DMSO或者90%胎牛10DMSO。（保護細胞膜不被凍壞）2） 提前準備好程序性降溫盒。3）

6、標記凍存管：帽子：細胞系名稱 凍存者 側面：細胞系名稱 凍存者 凍存時間 級別（按照細胞狀態(tài)標記A，A，B）,太差的別凍4) 細胞經(jīng)過換液消化后，離心，棄上清.加入2ml的預先配好的凍存液，快速吹打混勻。若不離心，則在凍存管中加100LDMSO+900L細胞懸液。5) 凍存順序：用凍存儀（程序性降溫盒）80過夜液氮。 或者4半小時202小時 80存儲。 凍存儀的使用方法1、確認凍存儀內(nèi)的異丙醇是否已經(jīng)使用5次，準備細胞，放入凍存盒（最多18管）。2、將凍存盒放入-80冰箱，并登記信息（凍存者，凍存細胞名稱，異丙醇使用次數(shù)）3、至少三個小時后（過夜），將細胞取出放置于自己的細胞盒內(nèi)或液氮中。4、

7、將凍存盒取出放回原處。凍存盒內(nèi)需放置250ml的異丙醇，異丙醇使用4-5次后需要更新4、細胞復蘇 （DMEM培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗）1) 準備37水浴箱，10mL離心管，配制相應培養(yǎng)基，標記好培養(yǎng)皿。（離心管和培養(yǎng)皿可提前加好約5ml培養(yǎng)基）2) 將取出的細胞凍存管快速投入到溫水中，同時手握凍存管快速攪動，讓細胞以最快的速度融解。3）吸取所有融化的細胞懸液至加有5倍體積培養(yǎng)基的離心管中。4）離心800rpm，3min。5）棄上清，加全培重懸細胞。6）依次加2ml細胞懸液和10ml全培入新培養(yǎng)皿。（6cm小圓盤上加入 2 ml的全培;10cm大圓盤上加入10ml的全培）。7）混勻(十字混勻)，CO2培養(yǎng)。標準程序：3）離心1000rpm，2-3 分鐘；棄上清，加入1ml全培重懸后轉入10ml管，再加入4-5ml全培重懸4）離心1000rpm，2-3 分鐘