1、蛋白質(zhì)層析技術(shù)和工藝放大,曹杰 2013.05.11,一、離子交換層析技術(shù) 二、親和層析技術(shù) 三、切向流過(guò)濾技術(shù) 四、工藝放大,一、,陰離子交換,陽(yáng)離子交換,分辨率: 1 選擇性: 填料的性質(zhì)及所帶功能基團(tuán)的數(shù)目、pH值、離子強(qiáng)度、洗脫條件 2 柱效： 填料顆粒大小、層析柱裝填效果 3 樣品： 能應(yīng)用的樣品量即樣品各成分性質(zhì),二、,親和層析原理,親和層析的策略,配基與目標(biāo)蛋白的特異性 盡可能簡(jiǎn)單 設(shè)計(jì)洗脫方案,抗體純化,基于G蛋白/A蛋白的IgG的純化,1. LMW Markers 2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:10 3. Pool,un

2、bound material,nonredued,diluted 1:10 4. Pool,purified mouseIgG1, nonredued,diluted 1:10,如何除去特定的污染物,三、,切向流過(guò)濾技術(shù),膜過(guò)濾原理,膜過(guò)濾技術(shù)，又稱(chēng)膜分離技術(shù)，是使用一定孔徑的過(guò)濾介質(zhì)將不同物質(zhì)按照大小和形狀進(jìn)行選擇性分級(jí)分離的物理分離方法。,膜過(guò)濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),（1）快速高效、低能耗、硬件設(shè)備簡(jiǎn)單易于維護(hù)； （2）易于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化操作和線性放大 （3）膜分離操作條件溫和、不涉及相變，有利于保持生物活性分子的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。,過(guò)濾技術(shù)的分類(lèi),按照濾膜孔徑范圍可以分為常規(guī)過(guò)濾、微濾、超濾和反滲透等,

3、過(guò)濾技術(shù)的分類(lèi),按照過(guò)濾操作方式分： 死端過(guò)濾( Normal Flow Filtration , NFF ) 切向流過(guò)濾( Cross -flow Filtration, CFF),切向流過(guò)濾,切向流過(guò)濾又稱(chēng)錯(cuò)流過(guò)濾，過(guò)濾過(guò)程中平行于膜的切向流不斷清洗沖刷膜表面，有效的緩解膜表面濾餅層和濃差極化層的形成，避免過(guò)濾阻力的快速增加，有利于保持穩(wěn)定的過(guò)濾流速和壓力，從而實(shí)現(xiàn)更高的膜過(guò)濾處理量，延長(zhǎng)濾膜壽命,根據(jù)濾膜流道結(jié)構(gòu)形式又可分為中空纖維柱和平板膜包,過(guò)濾技術(shù)的選擇,膜孔徑選擇 過(guò)濾操作方式選擇 切向流過(guò)濾技術(shù)選擇,膜孔徑選擇,(1)如希望目標(biāo)物質(zhì)透過(guò)膜孔，一般選擇膜孔徑大小為目標(biāo)物質(zhì)直徑5

4、- 10倍以上以降低過(guò)濾阻力，提高通透性：例如重組抗體純化中，CHO 細(xì)胞培養(yǎng)液的柱前澄清，建議使用0.2 或0.45 m 中空纖維微濾膜，可以保持單抗分子( 150 kDa ) 良好的膜通透性，實(shí)現(xiàn)高收率。,膜孔徑選擇,(2) 如希望目標(biāo)物質(zhì)充分截留，一般需選擇膜孔徑小于目標(biāo)物質(zhì)直徑1/3 1/5 ：例如抗體150k的濃縮和緩沖液置換，一般選擇30k或50k超濾膜實(shí)現(xiàn)充分截留. (3) 超濾膜用于細(xì)胞收集速度更快，操作更簡(jiǎn)單：例如中空纖維750k超濾膜用于大腸桿菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞快速收集，取代離心機(jī)。 （4）微濾膜用于蛋白澄清去除細(xì)胞碎片具有更好的目標(biāo)蛋白收率：例如中空纖維0.1m濾膜用于較難過(guò)濾

5、的大腸桿菌裂解液澄清，保護(hù)層析柱。,過(guò)濾操作方式選擇,過(guò)濾常見(jiàn)的操作方式包括NFF死端過(guò)濾和CFF切向流過(guò)濾,切向流過(guò)濾技術(shù)的選擇,中空纖維柱和平板膜包的優(yōu)缺點(diǎn)：,切向流過(guò)濾技術(shù)的選擇,中空纖維濾膜具有開(kāi)放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容塵量高，適合病毒和蛋白等生物大分子低剪切力的溫和超濾濃縮、可直接處理高固含量高黏度的復(fù)雜料液，如細(xì)胞菌體收集、裂解液澄清和硫酸銨沉淀收集等應(yīng)用。 平板膜包的篩網(wǎng)流道結(jié)構(gòu)( Screen Channel ) ，適合無(wú)固體顆粒的低黏度低濃度樣品的濃縮，如層析柱之間的緩沖液交換和濃縮等。,切向流過(guò)濾技術(shù)的選擇,中空纖維濾膜可以用于微濾或超濾，用于

6、蛋白/ 病毒等濃縮洗濾或直接處理高固含量料液； 而平板膜包常用于澄清料液的超濾濃縮，對(duì)于高固含量高黏度樣品的澄清過(guò)濾存在較大局限性，易于堵塞流道。,四、,Process Scale up 工藝放大,菌種的特性，相關(guān)論文、專(zhuān)利，藥典，試劑等,親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩、超濾，層析介質(zhì)粒徑大小，純化步驟等,載體構(gòu)建優(yōu)化、發(fā)酵工藝優(yōu)化、純化工藝優(yōu)化、檢測(cè)方法選擇等,發(fā)酵工藝是否能夠放大、純化工藝是否能放大等，工藝穩(wěn)定性,環(huán)境安全性：廢氣廢液排放，菌種的處理，選擇有關(guān)試劑的替代品,知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，專(zhuān)利什么時(shí)候到期？,Regulatory requirements,了解相關(guān)法律、法規(guī)、驗(yàn)證計(jì)劃、QA和QC等,如何保證質(zhì)量？確定分析方法、檢測(cè)方法、如何保證工藝穩(wěn)定性。,工藝放大（以蛋白純化為例）,要考慮的問(wèn)題： （1）樣品、試劑：樣品來(lái)源（原核或真核、胞內(nèi)或胞外等），目標(biāo)蛋白的性質(zhì)（等電點(diǎn)、分子量、穩(wěn)定性等），緩沖液（pH、溶質(zhì)類(lèi)型、鹽離子濃度等） （2）介質(zhì)的選擇（離子、疏水、親和填料，介質(zhì)的化學(xué)耐受性、強(qiáng)度，載量，不同批次介質(zhì)的穩(wěn)定性） （3）質(zhì)量合格，符合GMP要求，生產(chǎn)成本， （4）設(shè)備選擇，驗(yàn)證，,（5）工藝參數(shù)： 不