1、【目標(biāo)導(dǎo)航】1.能利用選擇培養(yǎng)基分離細(xì)菌。2.能運(yùn)用稀釋 涂布平板法測(cè)定土壤中分解尿素細(xì)菌的數(shù)量。,一、研究思路 1課題背景 尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，但農(nóng)作物_(能、不能)直 接吸收利用，而是首先通過(guò)_將尿素在_的催化下分解為氨之后，才能被植物吸收。 2篩選菌株 微生物篩選的原理：_，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)，如可從熱泉中將Taq細(xì)菌篩選出來(lái)。,土壤中的細(xì)菌,不能,脲酶,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件,3統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 (1)測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有_和_ _。 (2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般設(shè)置_個(gè)平板，選擇菌落數(shù)在_的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取_。 統(tǒng)計(jì)的

2、菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目_，因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用_而不是用_來(lái)表示。 4設(shè)置對(duì)照 設(shè)置對(duì)照的主要目的是_ _。,稀釋涂布平板法,顯微,鏡直接計(jì)數(shù)法,多于3,30300,平均數(shù),少,菌落數(shù),活菌數(shù),排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié),果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1操作步驟：土壤取樣_微生物的_。 2土壤取樣一般要鏟去_，因?yàn)榻^大多數(shù)細(xì)菌分布于距地表約_的土壤層。 3樣品的稀釋?zhuān)翰煌奈⑸镄枰♂尩谋稊?shù)不同，請(qǐng)?zhí)顚?xiě)下表：,4微生物的培養(yǎng)與觀察 微生物的生長(zhǎng)受_的影響，菌落的數(shù)目和_是觀察的主要內(nèi)容。,樣品的稀釋,培養(yǎng)與觀察,表層土,38 cm,104、105、106,103、10

3、4、105,102、103、104,溫度,特征,三、操作提示 1無(wú)菌操作：取土樣用的_和盛土樣的_在使用前都需要滅菌。稱(chēng)取土樣要在_旁進(jìn)行。稀釋樣品要在_旁操作。 2做好標(biāo)記：要對(duì)_和試管進(jìn)行標(biāo)記，尤其進(jìn)行系列稀釋時(shí)要按_順序?qū)⒃嚬芘帕谐尚小?小鐵鏟,信封,火焰,平板,稀釋度遞增,火焰,四、課題延伸 分解尿素的細(xì)菌合成的_將尿素分解成了氨，使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。在以_為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入_指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變_，可以初步鑒定該種細(xì)菌能夠分解_。,尿素,脲酶,酚紅,紅,尿素,判斷正誤： (1)選擇培養(yǎng)基只允許特定的微生物生長(zhǎng)，而抑制或阻止其 他微生物的生長(zhǎng) () (2)對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，

4、所做的平板越大越好 () (3)設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以排除一些非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影 響 () (4)從土壤中取樣時(shí)，土層越淺越好 () (5)來(lái)自土壤的微生物稀釋倍數(shù)越大越好 () 答案(1)(2)(3)(4)(5),一、選擇培養(yǎng)基相關(guān)問(wèn)題分析 1概念：在微生物學(xué)中，將允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱(chēng)作選擇培養(yǎng)基。 2原理：根據(jù)不同微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性不同而制備培養(yǎng)基。 例如：用培養(yǎng)基選擇能分解尿素的微生物的原理 培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源，而

5、不能生長(zhǎng)、繁殖，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出能分解尿素的微生物。,3方法 (1)在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)。例如，加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌；加入高濃度的食鹽可以得到金黃色葡萄球菌。這里的“加入”是在培養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上加入。 (2)改變培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。例如，缺乏氮源時(shí)可以分離固氮微生物；石油作為唯一碳源時(shí)，可以分離出能消除石油污染的微生物。 (3)改變微生物的培養(yǎng)條件。例如，將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物。,1伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基為什么不是選擇培養(yǎng)基？ 答案伊紅美藍(lán)只能顯示有無(wú)大腸桿菌，不能實(shí)現(xiàn)只允許一種微生物生存而抑制或影響其他微生物的生存，所以伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基不是選擇培養(yǎng)基

6、。 2一種自養(yǎng)微生物與多種異養(yǎng)微生物混合在一起，如何將自養(yǎng)微生物選擇出來(lái)？ 答案用不含有機(jī)碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，因?yàn)樽责B(yǎng)微生物可以利用空氣中的CO2而異養(yǎng)微生物不可以，所以能在培養(yǎng)基中生存的就是自養(yǎng)微生物。,32013年11月22日凌晨3點(diǎn)，青島黃島區(qū)發(fā)生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制選擇培養(yǎng)基將這類(lèi)微生物選擇出來(lái)？ 答案配制的選擇培養(yǎng)基中，石油作為唯一的碳源，然后用這種培養(yǎng)基培養(yǎng)多種微生物，凡是能在該種培養(yǎng)基上生存的就是能分解石油的微生物。,1苯酚是工業(yè)生產(chǎn)排放的有毒污染物質(zhì)，自然界中存在著降解苯酚的微生物。某工廠產(chǎn)生的廢水中含有苯酚，為了降解廢水中的苯酚，研究人員從土

7、壤中篩選獲得了只能降解利用苯酚的細(xì)菌菌株，篩選的主要步驟如圖所示，為土壤樣品。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。,(1)中培養(yǎng)目的菌株的選擇培養(yǎng)基中應(yīng)加入_作為唯一碳源，中不同濃度碳源的培養(yǎng)基_(填“影響”或“不影響”)細(xì)菌的數(shù)量，如果要測(cè)定中活細(xì)菌數(shù)量，常采用_法。 (2)為對(duì)照，微生物在中不生長(zhǎng)，在中生長(zhǎng)，與培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于_ _； 使用_法可以在上獲得單菌落。采用固體平板培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)進(jìn)行倒置培養(yǎng)的原因是_ _。,(3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如何防止其他微生物的污染？ _ _。,【問(wèn)題導(dǎo)析】(1)題目中的目的菌株是_，選擇培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基相比最大的差別是_不同，選擇培養(yǎng)基中_是唯一的碳源。 (2)苯酚的_會(huì)對(duì)能分解

8、苯酚的細(xì)菌產(chǎn)生影響。能否生存取決于細(xì)菌_，細(xì)菌的分解能力可以通過(guò)改變_ _判斷出來(lái)。 答案(1)苯酚影響稀釋涂布平板(2)的培養(yǎng)基沒(méi)有加入苯酚作為碳源，的培養(yǎng)基加入苯酚作為碳源稀釋涂布平板法或平板劃線以防止冷凝后形成的水珠滴落在培養(yǎng)基上污染培養(yǎng)基(3)培養(yǎng)基滅菌，接種環(huán)境滅菌，接種過(guò)程無(wú)菌操作,降解苯酚的細(xì)菌,碳源,苯酚,濃度,能否利用苯酚,苯酚,的濃度,解析根據(jù)微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，在培養(yǎng)基中加入或不加某些物質(zhì)以達(dá)到促進(jìn)目的菌生長(zhǎng)，抑制或阻止其他雜菌生長(zhǎng)的目的，然后再用稀釋涂布平板法、平板劃線法或其他方法篩選出單個(gè)目的菌落，再接種培養(yǎng)即可獲得純目的菌。為防止培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)形成的水珠落入培養(yǎng)基

9、中影響菌體生長(zhǎng)，所以要將培養(yǎng)皿倒置。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中要注意單一變量原則和對(duì)照原則，操作中要嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作。,【一題多變】 (1)為什么測(cè)定活菌的數(shù)量不能用平板劃線法？ 答案由于在所劃的線中，只有最后一次劃線的末端才會(huì)形成由一個(gè)細(xì)菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由兩個(gè)細(xì)菌或多個(gè)細(xì)菌繁殖而成，而在計(jì)數(shù)時(shí)一個(gè)菌落對(duì)應(yīng)著一個(gè)細(xì)菌，這樣在劃線所得的平板中，菌落數(shù)目低于活菌的實(shí)際數(shù)值，所以不能用平板劃線法測(cè)定活菌數(shù)量。 (2)如何判斷培養(yǎng)基是否被污染？ 答案在不接種微生物的情況下將培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，如果培養(yǎng)基中無(wú)菌落出現(xiàn)，則說(shuō)明沒(méi)有被污染，如果有菌落出現(xiàn)，則說(shuō)明培養(yǎng)基被污染。,(3)兩位同學(xué)在取土壤

10、樣品時(shí)，一位同學(xué)在不含苯酚的土壤中取樣，另一位同學(xué)在含苯酚的土壤中取樣，哪位同學(xué)做法較好？ 答案在含有苯酚的土壤中取樣較好。,二、統(tǒng)計(jì)菌落的數(shù)目 1顯微鏡直接計(jì)數(shù)法(總菌計(jì)數(shù)法) (1)原理：此法利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。 (2)方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，上面有一個(gè)特定的面積為1 mm2和高為0.1 mm的計(jì)數(shù)室，在1 mm2的面積里又被劃分成25個(gè)(或16個(gè))中格，每個(gè)中格進(jìn)一步劃分成16個(gè)(或25個(gè))小格，但計(jì)數(shù)室都是由400個(gè)小格組成的，如圖所示。,(3)計(jì)算公式：每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)40010 000

11、稀釋倍數(shù) (4)缺點(diǎn)：不能區(qū)分細(xì)菌的死活。,2間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法) (1)原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。 (2)計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)(CV)M。其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。 (3)統(tǒng)計(jì)方法：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板上菌落數(shù)的平均值，然后按公式進(jìn)行計(jì)算。,2自然界中的微生物往往是混雜生長(zhǎng)的。人們?cè)谘芯课⑸飼r(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測(cè)定。下面是對(duì)

12、大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)回答有關(guān)問(wèn)題。 步驟如下： 制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。 為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，應(yīng)選用_法接種樣品。 適宜溫度下培養(yǎng)。結(jié)果分析：,(1)測(cè)定大腸桿菌數(shù)時(shí)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，與事實(shí)更加接近的是_。 A一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230 B兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是220和260，取平均值240 C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是400、212和256，取平均 值289 D四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、260、240和250， 取平均值240 (2)一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測(cè)得平板上菌

13、落數(shù)的平均值為212，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)約是(涂布平板時(shí)所用的稀釋液體積為0.2 mL)_。,(3)用這種方法測(cè)定菌體密度時(shí)，實(shí)際活菌數(shù)量要比測(cè)得的數(shù)量_(多/少)，因?yàn)開(kāi) _。,【問(wèn)題導(dǎo)析】(1)因?yàn)轭}中操作的目的需要對(duì)大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量的測(cè)定，所以接種的方法是_。 (2)測(cè)定活菌數(shù)量時(shí)，選擇的平板越多誤差_，且選擇的平板要能形成_個(gè)菌落。 (3)所做的多個(gè)平板中，如果其中一個(gè)平板中菌落的數(shù)目 明顯_其他幾個(gè)平板，則說(shuō)明該平板不符合要求，應(yīng)_或舍棄。 答案步驟：稀釋涂布平板(1)D(2)1.06109個(gè) (3)多當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落,稀釋涂布平板法,越小,30300,多于或少于,重做,解析若對(duì)大腸桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，則需要用稀釋涂布平板法接種樣品。(1)應(yīng)選取多個(gè)菌落數(shù)相差不大的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值。(2)2120.21061.06109(個(gè))。(3)因?yàn)橐粋€(gè)菌落可能由兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起生長(zhǎng)而成，所以實(shí)際活菌數(shù)量要比測(cè)得的數(shù)量多。,【一題多變】 (1)如果某同