1、第三節(jié) 電子傳遞和氧化呼吸鏈,主要內(nèi)容：重點(diǎn)討論線(xiàn)粒體電子傳遞體系的組成、電子傳遞機(jī)理。,一、生物氧化概述,糖類(lèi)、脂肪、蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)在細(xì)胞中進(jìn)行氧化分解生成CO2和H2O并釋放出能量的過(guò)程稱(chēng)為生物氧化（biological oxidation），其實(shí)質(zhì)是需氧細(xì)胞在呼吸代謝過(guò)程中所進(jìn)行的一系列氧化還原反應(yīng)過(guò)程。,（一）生物氧化的特點(diǎn),在活的細(xì)胞中（pH接近中性、體溫條件下），有機(jī)物的氧化在一系列酶、輔酶和中間傳遞體參與下進(jìn)行，其途徑迂回曲折，有條不紊。 氧化過(guò)程中能量逐步釋放，其中一部分由一些高能化合物（如ATP）截獲，再供給機(jī)體所需。在此過(guò)程中既不會(huì)因氧化過(guò)程中能量驟然釋放而傷害機(jī)體，又能

2、使釋放的能量盡可能得到有效的利用。,生物氧化和有機(jī)物在體外氧化（燃燒）的實(shí)質(zhì)相同，都是脫氫、失電子或與氧結(jié)合，消耗氧氣，都生成CO2和H2O，所釋放的能量也相同。但二者進(jìn)行的方式和歷程卻不同：,（二）CO2的生成,方式：糖、脂、蛋白質(zhì)等有機(jī)物轉(zhuǎn)變成含羧基的中間化合物，然后在酶催化下脫羧而生成CO2。 類(lèi)型：-脫羧和-脫羧 氧化脫羧和單純脫羧,（三）H2O的生成,代謝物在脫氫酶催化下脫下的氫由相應(yīng)的氫載體（NAD+、NADP+、FAD、FMN等）所接受，再通過(guò)一系列遞氫體或遞電子體傳遞給氧而生成H2O 。,例：,12 O2,NAD+,電子傳遞鏈,H2O,2e,O=,2H+,脂肪,葡萄糖、其它單糖

3、,三羧酸循環(huán),電子傳遞（氧化）,蛋白質(zhì),脂肪酸、甘油,多糖,氨基酸,乙酰CoA,e-,磷酸化,+Pi,小分子化合物分解成共同的中間產(chǎn)物（如丙酮酸、乙酰CoA等）,共同中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán),氧化脫下的氫由電子傳遞鏈傳遞生成H2O，釋放出大量能量，其中一部分通過(guò)磷酸化儲(chǔ)存在ATP中。,大分子降解成基本結(jié)構(gòu)單位,生物氧化的三個(gè)階段,二、電子傳遞鏈（呼吸鏈）,（一）線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)特點(diǎn) （二）電子傳遞呼吸鏈的概念 （三）呼吸鏈的組成 （四）機(jī)體內(nèi)兩條主要的呼吸鏈及其能量變化 （五）電子傳遞抑制劑,（一）線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu),嵴,線(xiàn)粒體外膜 自由透過(guò)小分子和離子 線(xiàn)粒體內(nèi)膜 不能自由透過(guò)大部分小分子和離子,包括H+。

4、 含有：電子傳遞體（復(fù)合體I、II、III、IV） ADP-ATP轉(zhuǎn)運(yùn)載體 ATP合酶（FoF1） 其他載體 線(xiàn)粒體基質(zhì)含有丙酮酸脫氫酶 檸檬酸循環(huán)酶系 脂肪酸-氧化酶系 DNA，核糖體其他酶 ATP、ADP、Pi、Mg2+ 、 Ca2+ 、 K+ 可溶的中間代謝產(chǎn)物,Cristae (the infoldings of the inner membrane of mitochondria) is where the respiratory chain is located.,（二）線(xiàn)粒體呼吸鏈,線(xiàn)粒體基質(zhì)是呼吸底物氧化的場(chǎng)所，底物在這里氧化所產(chǎn)生的NADH和FADH2將質(zhì)子和電子轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜的

5、載體上，經(jīng)過(guò)一系列氫載體和電子載體的傳遞，最后傳遞給O2生成H2O。這種由載體組成的電子傳遞系統(tǒng)稱(chēng)電子傳遞鏈（electron transfer chain),因?yàn)槠涔δ芎秃粑饔弥苯酉嚓P(guān)，亦稱(chēng)為呼吸鏈。 電子傳遞鏈在原核生物存在于質(zhì)膜上，在真核細(xì)胞存在于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上。,呼吸鏈由4個(gè)多蛋白的復(fù)合物（I, II, III, 和 IV;3個(gè)是質(zhì)子泵）和2個(gè)移動(dòng)的電子載體，泛醌（Q或輔酶Q）以及細(xì)胞色素c組成。 呼吸鏈中蛋白質(zhì)的輔基包括： 黃素類(lèi)（FMN，F(xiàn)AD）， 血紅素（血紅素 A，鐵原卟啉IX ，血紅素 C）， 鐵硫聚簇（ 2Fe-2S, 4Fe-4S), 和 銅 。,呼吸鏈上很多電子載體的順

6、序通過(guò)多種研究得以闡明,方法一：測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)還原電位（E0） 電子傾向于從低還原電位（E0）的載體流向還原電位高的載體（不過(guò)在真正的細(xì)胞中可能有偏差）,Electron carriers may have an order of increasing E0,方法二：氧化作用動(dòng)力學(xué)研究 完全的還原伴隨著O2的突然傳導(dǎo)； 較早的氧化作用更接近呼吸鏈的末端； 使用快速而靈敏的分光光度技術(shù)跟隨細(xì)胞色素的氧化作用，發(fā)現(xiàn)最大吸收峰的波長(zhǎng)不同。,Reduced,Reduced,Reduced,Oxidized,Oxidized,方法三: 各種特異性抑制劑的作用，在阻止步驟之前的處于還原態(tài)而阻止之后的處于氧化態(tài)。

7、,魚(yú)藤酮,抗霉素 A,方法四:分離并鑒定每個(gè)多蛋白質(zhì)復(fù)合物： 鏈上組分中特有的電子供體和受體可以確定。,（三）呼吸鏈的組成,黃素蛋白酶類(lèi) （flavoproteins, FP） 鐵-硫蛋白類(lèi) （ironsulfur proteins) 細(xì)胞色素類(lèi) （cytochromes） 輔酶 （ubiquinone,亦寫(xiě)作CoQ）,NADH,輔 酶 Q（CoQ）,Fe-S,Cyt c1,O2,Cyt b,Cyt c,Cyt aa3,琥珀酸等,黃素蛋白（FAD）,黃素蛋白（FMN）,細(xì)胞色素類(lèi),鐵硫蛋白（Fe-S）,鐵硫蛋白（Fe-S）,NADH呼吸鏈,NADH,FMN,CoQ,Fe-S,Cyt c1,O2

8、,Cyt b,Cyt c,Cyt aa3,Fe-S,FAD,Fe-S,琥珀酸等,復(fù)合物 II,復(fù)合物 IV,復(fù)合體 I,復(fù)合物 III,NADH脫氫酶,細(xì)胞色素還原酶,細(xì)胞色素氧化酶,琥珀酸-輔酶Q還原酶,FADH2呼吸鏈,兩條主要呼吸鏈,1.NADH-Q還原酶(NADH脫氫酶、復(fù)合體）,NADH-Q還原酶是一個(gè)大的蛋白質(zhì)復(fù)合體，F(xiàn)MN和鐵-硫蛋白（Fe-S）是該酶的輔基，由輔基或輔酶負(fù)責(zé)傳遞電子和氫。 傳遞氫機(jī)理:,NADH dehydrogenase (Complex I),NADH + 5H+N + Q NAD+ + QH2 + 4H+P,輔酶Q是呼吸鏈電子傳遞的樞紐 Ubiquinon

9、e (Q) accepts electrons from both NADH and FADH2 in the respiratory chain,FMN can accept one electron or FMNH2 can donate one electron to form a semiquinone radical intermediate.,鐵硫蛋白,特點(diǎn)：含有Fe和對(duì)酸不穩(wěn)定的S原子，F(xiàn)e和S常以等摩爾量存在（Fe2S2, Fe4S4 )，構(gòu)成FeS中心，F(xiàn)e與蛋白質(zhì)分子中的4個(gè)Cys殘基的巰基與蛋白質(zhì)相連結(jié)。,鐵硫蛋白參與電子傳遞,2Fe-2S,Different types

10、 of iron-sulfur centers,2Fe-2S,4Fe-4S,Ferredoxin（鐵氧還蛋白）,Iron atoms cycle between Fe2+ (reduced) and Fe3+(oxidized).,2. CoQ,特點(diǎn)：帶有聚異戊二烯側(cè)鏈的苯醌，是脂溶性醌類(lèi)化合物，而且分子較小，可在線(xiàn)粒體內(nèi)膜的磷脂雙分子層的疏水區(qū)自由擴(kuò)散。 功能基團(tuán)是苯醌，通過(guò)醌/酚的互變傳遞氫，Q (醌型結(jié)構(gòu)) 很容易接受2個(gè)電子和2個(gè)質(zhì)子，還原成QH2（還原型）；QH2也容易給出2個(gè)電子和2個(gè)質(zhì)子，重新氧化成Q。因此，它在線(xiàn)粒體呼吸鏈中作為電子和質(zhì)子的傳遞體。,泛醌是一個(gè)移動(dòng)的電子/質(zhì)子載

11、體,脂溶性的苯醌有一個(gè)很長(zhǎng)的異戊二烯側(cè)鏈，可以接受1或2個(gè)電子，形成半醌或還原型輔酶Q。（QH2）； QH2擴(kuò)散到下一個(gè)復(fù)合物（III）；是唯一的一個(gè)不結(jié)合于一種蛋白的電子載體。,3. 琥珀酸-Q還原酶（復(fù)合體）,琥珀酸脫氫酶也是此復(fù)合體的一部分，其輔基包括FAD和Fe-S聚簇。 琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸氧化為延胡索酸，同時(shí)其輔基FAD還原為FADH2，然后FADH2又將電子傳遞給Fe-S聚簇。 最后電子由Fe-S聚簇傳遞給琥珀酸-Q還原酶的輔酶CoQ。 琥珀酸 FADH2 Fe-S CoQ,4.細(xì)胞色素還原酶（細(xì)胞色素bc1復(fù)合體、復(fù)合體）,含有兩種細(xì)胞色素（細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素c1）和一鐵硫

12、蛋白（ 2Fe-2S ）。 細(xì)胞色素bc1復(fù)合體的作用是將電子從QH2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素c,QH2 cyt.b Fe-S cyt.c1 cyt.c,細(xì)胞色素（cytochrome, cyt）,特點(diǎn)：以血紅素（heme）為輔基，血紅素的主要成份為鐵卟啉。 類(lèi)別: 根據(jù)吸收光譜分成a、b、c三類(lèi)，呼吸鏈中含5種（b、c、c1、a和a3)，cyt b和cytc1、cytc在呼吸鏈中為電子傳遞體，a和a3以復(fù)合物存在，稱(chēng)細(xì)胞色素氧化酶，其分子中除含F(xiàn)e外還含有Cu ，可將電子傳遞給氧，因此亦稱(chēng)其為末端氧化酶。,細(xì)胞色素=血紅素+蛋白質(zhì) 血紅素有a,b和c Cyt c是水溶性的，存在于內(nèi)外膜之間，在復(fù)合體I

13、II和IV間傳遞電子 血紅素中的鐵得失電子而還原和氧化,Cyt a: 600 nm Cyt b: 560 nm Cyt c: 550 nm,Reduced cytochromes has three absorption bands in the visible wavelengths,Cytochrome bc1 complex (Complex III),5.細(xì)胞色素c,在復(fù)合體III和之間傳遞電子。（細(xì)胞色素c 交互地與細(xì)胞色素還原酶的C1和細(xì)胞色素氧化酶接觸） 是唯一能溶于水的細(xì)胞色素。 相對(duì)分子質(zhì)量為13000，由104個(gè)氨基酸構(gòu)成的單一肽鏈。,半胱氨酸,6. 細(xì)胞色素氧化酶（復(fù)合體

14、、細(xì)胞色素c氧化酶 ）,由 cyta和a3 組成。復(fù)合物中除了含有鐵卟啉外，還含有2個(gè)銅原子（CuA，CuB）。Cyta與CuA相配合，cyta3與CuB相配合，當(dāng)電子傳遞時(shí)，細(xì)胞色素的Fe3+ 、 Fe2+間循環(huán)，同時(shí)Cu2+ 、 Cu+間循環(huán)，將電子從cytc直接傳遞給O2，也叫末端氧化酶。,The three critical subunits of cytochrome oxidase (Complex IV) A 204 kD 13-subunit protein complex, with structure determined in 1996,CuB,Heme a,Heme a

15、3,2CuA,CuA,CuA,The electron path in Complex IV,NADH呼吸鏈,NADH,FMN,CoQ,Fe-S,Cyt c1,O2,Cyt b,Cyt c,Cyt aa3,Fe-S,FAD,Fe-S,琥珀酸等,復(fù)合物 II,復(fù)合物 IV,復(fù)合體 I,復(fù)合物 III,NADH脫氫酶,細(xì)胞色素還原酶,細(xì)胞色素氧化酶,琥珀酸-輔酶Q還原酶,FADH2呼吸鏈,（四）機(jī)體內(nèi)兩條主要呼吸鏈和能量的變化,電子傳遞鏈標(biāo)準(zhǔn)氧化還原自由能變化,NADH,FMN,CoQ,Fe-S,Cyt c1,O2,Cyt b,Cyt c,Cyt aa3,Fe-S,FMN,Fe-S,琥珀酸等,復(fù)合

16、物 II,復(fù)合物 IV,復(fù)合體 I,復(fù)合物 III,NADH脫氫酶,細(xì)胞色素C還原酶,細(xì)胞色素C氧化酶,琥珀酸-輔酶Q還原酶,The chemiosmotic model by Mitchell,（五）電子傳遞 抑制劑,概念：能夠阻斷呼吸鏈中某部位電子傳遞的物質(zhì)稱(chēng)為電子傳遞抑制劑。 電子傳遞抑制劑的使用是研究呼吸鏈中電子傳遞體順序的有效方法。（阻斷部位物質(zhì)的氧化-還原狀態(tài)可以測(cè)出）,電子傳遞 抑制劑,NADH,FMN,CoQ,Fe-S,Cyt c1,O2,Cyt b,Cyt c,Cyt aa3,Fe-S,FMN,Fe-S,琥珀酸,復(fù)合物 II,復(fù)合物 IV,復(fù)合物 I,復(fù)合物 III,抗霉素

17、A的抑制部位,NAD FP Q b c aa3,NAD FP Q b c aa3,呼吸鏈的比擬圖解,第四節(jié) 氧化磷酸化作用,一、氧化磷酸化,代謝物在生物氧化過(guò)程中釋放出的自由能用于合成ATP（即ADP+PiATP）,這種氧化放能和ATP生成（磷酸化）相偶聯(lián)的過(guò)程稱(chēng)氧化磷酸化。,類(lèi)別： 底物水平磷酸化 電子傳遞水平磷酸化,磷氧比（ P/O ）,呼吸過(guò)程中無(wú)機(jī)磷酸（Pi）消耗量和分子氧（O2）消耗量的比值稱(chēng)為磷氧比。由于在氧化磷酸化過(guò)程中，每傳遞一對(duì)電子消耗一個(gè)氧原子，而每生成一分子ATP消耗一分子Pi ，因此P/O的數(shù)值相當(dāng)于一對(duì)電子經(jīng)呼吸鏈傳遞至分子氧所產(chǎn)生的ATP分子數(shù)。,NADH,FADH

18、2,H2O,H2O,例 實(shí)測(cè)得NADH呼吸鏈： P/O 3,實(shí)測(cè)得FADH2呼吸鏈： P/O 2,2e-,2e-,二、氧化磷酸化的偶聯(lián)機(jī)理,1.線(xiàn)粒體ATP合酶（mitochondrial ATPase） 2.能量偶聯(lián)假說(shuō) 1953年 Edward Slater 化學(xué)偶聯(lián)假說(shuō) 1964年 Paul Boyer 構(gòu)象偶聯(lián)假說(shuō) 1961年 Peter Mitchell 化學(xué)滲透假說(shuō),3.質(zhì)子梯度的形成 4.ATP合成的機(jī)制,1978年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),ATP合酶催化ATP的合成,H+被吸引到膜的Fo通道的基質(zhì)側(cè)，在Fo和F1連接處形成高濃度的H+ 通過(guò)ATP合酶每傳送4H+引導(dǎo)1個(gè)ATP的生成,線(xiàn)粒

19、體ATP合酶復(fù)合體組分,氧化磷酸化重建示意圖,電子傳遞的自由能驅(qū)動(dòng)H+從線(xiàn)粒體基質(zhì)跨過(guò)內(nèi)膜進(jìn)入到膜間隙，從而形成H+跨線(xiàn)粒體內(nèi)膜的電化學(xué)梯度，這個(gè)梯度的電化學(xué)勢(shì)( H+ )驅(qū)動(dòng)ATP的合成。,三、化學(xué)滲透假說(shuō)(chemiosmotic hypothasis),化學(xué)滲透假說(shuō)原理示意圖,4H+,2H+,2H+,4H+,NADH+H+,2H+,2H+,2H+,ADP+Pi,ATP,高質(zhì)子濃度,H2O,2e-,+ + + + + + + + +,_ _ _ _ _ _ _ _ _ _,質(zhì)子流,線(xiàn)粒體內(nèi)膜,線(xiàn)粒體電子傳遞和H+排出的數(shù)目和途徑,H2O,2H+,Cytc,Cytc,Cytc,Q,FMN,F

20、eS,FeS,Cytc1,CytbK,Cytbr,Cyta,FeS,Cyta3,2e-,2e-,NADH+H+,NAD+,O2 +2H+ H2O,4H+,2H+,2H+,復(fù)合物 III,Boyer和Walker的工作,美國(guó)科學(xué)家Boyer為解釋ATP酶作用機(jī)理，提出旋轉(zhuǎn)催化假說(shuō)，認(rèn)為ATP合成酶亞基有三種不同的構(gòu)象，一種構(gòu)象(L)有利于ADP和Pi結(jié)合，一種構(gòu)象(T)可使結(jié)合的ADP和Pi合成ATP，第三種構(gòu)象(O)使合成的ATP容易被釋放出來(lái)。在ATP合成過(guò)程中，三個(gè)亞基依次進(jìn)行上述三種構(gòu)象的交替變化，所需能量由跨膜H+提供。 英國(guó)科學(xué)家Walker通過(guò)x光衍射獲得高分辯率的牛心線(xiàn)粒體ATP

21、酶晶體的三維結(jié)構(gòu)， 證明在ATP酶合成ATP的催化循環(huán)中三個(gè)亞基的確有不同構(gòu)象， 從而有力地支持了Boyer的假說(shuō)。,ATP合酶結(jié)構(gòu)示意圖,定子,旋轉(zhuǎn)催化理論認(rèn)為質(zhì)子流通過(guò)Fo引起亞基III 寡聚體和及亞基一起轉(zhuǎn)動(dòng),這種旋轉(zhuǎn)配置 /亞基之間的不對(duì)稱(chēng)的相互作用,引起催化位點(diǎn)性質(zhì)的轉(zhuǎn)變, 亞基的中心 -螺旋被認(rèn)為是轉(zhuǎn)子,亞基I和II與亞基組合在一起組成定子,它壓住 /異質(zhì)六聚體.,OSCP,F1,H+通道,FO,柄,DCCD結(jié)合蛋白,基質(zhì)表面,外表面,Rotation of the g subunit and the ring of c subunits in the F0F1 complex w

22、as observed by in vitro studies using fluorescence microscopy,肌動(dòng)蛋白,ATP合成,L態(tài)：低親和力態(tài)，ATP合成,O態(tài)：開(kāi)放態(tài)，親和力極低，ATP釋放,T態(tài)：緊密結(jié)合態(tài)，ATP合成,當(dāng)H+通過(guò)Fo時(shí)， Fo旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致F13個(gè)亞基構(gòu)象的改變 F1 構(gòu)象的變化促使ADP+Pi合成ATP并釋放,ATP酶作用機(jī)理,ATP,有利于ADP與Pi結(jié)合的構(gòu)象,有利于ADP與Pi生成的構(gòu)象,有利于ATP釋放的構(gòu)象,Oxidative Phosphorylation (on inner membrane of mitochondria),四、 線(xiàn)粒

23、體外NADH的氧化磷酸化作用,1.磷酸甘油穿梭系統(tǒng) 2.蘋(píng)果酸天冬氨酸穿梭系統(tǒng),胞漿NADH不能直接進(jìn)入線(xiàn)粒體,胞漿NADH不能直接進(jìn)入線(xiàn)粒體 穿梭系統(tǒng)： 3-磷酸甘油穿梭 NADH FADH2 腦、骨骼肌等（速度快） 蘋(píng)果酸-天冬氨酸穿梭 NADH NADH 心、骨骼肌等,線(xiàn)粒體外NADH的氧化,3-磷酸甘油穿梭：NADH FADH2,-磷酸甘油穿梭,（線(xiàn)粒體基質(zhì)）,磷酸二羥丙酮,3-磷酸甘油,磷酸二羥丙酮,3-磷酸甘油,FAD,FADH2,NADHFMN CoQ b c1 c aa3 O2,NADH,NAD+,線(xiàn)粒體內(nèi)膜,（細(xì)胞液）,蘋(píng)果酸-草酰乙酸穿梭作用,（、 、 、 為膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)載體

24、）,2,4-二硝基苯酚的解偶聯(lián)作用,H+,H+,線(xiàn)粒體內(nèi)膜,內(nèi),外,在酸性環(huán)境中接受H+,成為不解離形式，是脂溶性的，很容易過(guò)膜，同時(shí)將H+帶入膜內(nèi)，起消除質(zhì)子濃度梯度的作用，亦稱(chēng)質(zhì)子載體。,離子載體（離子載體抑制劑）,是一類(lèi)脂溶性物質(zhì)，能與H+以外的其他一價(jià)陽(yáng)離子結(jié)合，并作為他們的載體使它們能夠穿過(guò)膜，消除跨膜的電位梯度。 纈氨霉素（K+） 短桿菌肽（K+ Na+）,五、葡萄糖徹底氧化生成ATP的總結(jié)算,葡萄糖分解通過(guò)糖酵解和檸檬酸循環(huán)形成的ATP或GTP的分子數(shù)，根據(jù)化學(xué)計(jì)算可以得到明確的答復(fù)。但是氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP分子數(shù)并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)橘|(zhì)子泵、 ATP的合成以及代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程并不需要是完整的數(shù)值甚至不需要是固