1、乳鐵蛋白,乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等強(qiáng)大生物功能，被認(rèn)為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑。,乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf) 是一個(gè)大約有700個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的、分子量約為80KDa的單體糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，主要由乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)和分泌。 因其晶體呈紅色，故也有學(xué)者稱之為“紅蛋白”。,定義,乳鐵蛋白廣泛分布于哺乳動(dòng)物乳汁和其他多種組織及其分泌液中（包括淚液、精液、膽汁、滑膜液等內(nèi)、外分泌液和嗜中性粒細(xì)胞，人乳中乳鐵蛋白濃度約為1.0-3.2mg/ml，是牛乳中的10倍（牛乳中含量為0.02-0.35mg/ml

2、），占普通母乳總蛋白的20%。,分 布,血液中乳鐵蛋 白主要來(lái)自中性白細(xì)胞，骨髓、子宮內(nèi)膜及胎盤等也能分泌少量的乳鐵蛋白進(jìn)入血液 。,人在泌乳期間，乳鐵蛋白含量隨著泌乳時(shí)間的不同而發(fā)生變化，如人初乳中乳鐵蛋白可達(dá)6-14mg/ml，常乳期降至1mg/ml。,乳鐵蛋白由700個(gè)左右的氨基酸組成。人乳鐵蛋白分子量為82.4KDa，有692個(gè)氨基酸殘基；牛乳鐵蛋白分子量為83.1KDa，由689個(gè)氨基酸組成。,乳鐵蛋 白 N 端 (1 338) 與 C 端 (339 692) 兩個(gè)球狀結(jié)構(gòu)相應(yīng)位置上有 37 (125 個(gè)) 的氨基酸完全相同。,結(jié)構(gòu)及性質(zhì),人乳鐵蛋白與牛乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)相似，氨基酸殘基組

3、成單鏈，兩端折疊成球形(N葉和 C 葉)，中間由一段螺旋肽鏈連接呈現(xiàn)“二枚銀杏葉型”結(jié)構(gòu)。,在晶體結(jié)構(gòu)中Phe17Leu29間肽鏈形成-螺旋結(jié)構(gòu)，Ser33Arg39間無(wú)規(guī)則卷 曲結(jié)構(gòu)并使一個(gè)平行 -折疊結(jié)構(gòu)與N 端相連。Phe17 Leu29間肽段具有較強(qiáng) 的抗菌活性，如果將其a -螺旋變成-折疊結(jié)構(gòu)抗菌活性有較大提高，可能是由于 -折疊結(jié)構(gòu)易于細(xì)菌表面接觸的緣故。,每個(gè)分子中有2個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)可結(jié)合一個(gè)Fe3+ 和 一 個(gè)HCO3- 或 CO32-,乳鐵蛋白對(duì)胰蛋白酶類具有很強(qiáng)的抗降解能力，尤其是結(jié)合鐵離子后抗降解能力增強(qiáng)，因此在腸道內(nèi)不易被降解，能以完整分子的形式被吸收。這種抗

4、蛋白酶水解的特性可能與糖基化有關(guān) 。,在鐵離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包括三個(gè)陰離子配子體(兩個(gè)酪氨酸殘基，一個(gè)天冬氨酸殘基)和一個(gè)組氨酸殘基，可與鐵離子形成穩(wěn)定的結(jié)合。,在酸性條件下對(duì)熱穩(wěn)定; 在堿性條件下,高于80即開始凝膠化。,根據(jù)Lf結(jié)合Fe的多寡，可將其分為缺鐵型乳鐵蛋白(apoLf)、鐵半飽和型乳鐵蛋白和 鐵飽和型乳鐵蛋白(Holoix)三種形式。不同形式的Lf具有不同的抗變性能力，其抗巴 氏殺菌熱變性能力依次為：Holoix 鐵半飽和型乳鐵蛋白 apoLf 。,牛乳L(zhǎng)f的等電點(diǎn)pH值為8.2左右，人Lf的等電點(diǎn)為6左右。,1、乳 鐵 蛋 白具 有 廣 譜 抗 菌 作 用,Lf抑菌效果取決于微

5、生物對(duì)鐵的需求程度、外源鐵的生物利用率、Lf的鐵飽和度 、 鹽類、pH值、抗體或其他免疫物質(zhì)、介質(zhì)等。,生物學(xué)功能,首 先 ， Lf 對(duì) 革 蘭 氏 陰 性 菌 和 陽(yáng) 性 菌 的 抑 菌 作 用 是 由于 乳 鐵 蛋 白 高 度 結(jié) 合 鐵 ， 使 細(xì) 菌 失 去 生 長(zhǎng) 所 需 的 基本 元 素 鐵 ； 其 次 ， L f 通 過(guò) 氨 基 末 端 強(qiáng) 陽(yáng) 離 子 結(jié) 合 區(qū)域 ，增 加 細(xì) 菌 細(xì) 胞 膜 的 通 透 性 ， 使 細(xì) 菌 的 脂 多 糖 從外 膜 滲 出 ，達(dá) 到 直 接 殺 菌 作 用； 另 外 ， Lf 可 通 過(guò)水 解 得 到 的 抗 菌 肽 來(lái) 實(shí) 現(xiàn) 抗 菌 作

6、用。 將 Lf 通 過(guò)蛋 白 酶 水 解 獲 得 一 些 低 分 子 量 的 肽 ， 這 些 肽 的 抗 菌活 性 大 幅 度 增 強(qiáng) ， 可 抑 制 G+ 和 G- 菌 生 長(zhǎng) ， 其 中 包括 一 些 對(duì) Lf 具 有 抵 抗 性 的 菌 株 。,目 前 認(rèn) 為 Lf 的 抗 菌 機(jī) 理 可 能 有 以 下 3 個(gè) 方 面 ：,2、乳 鐵 蛋 白 具 有 抗 病 毒 作 用,天 然 的 Lf 能 夠 抑 制 人 免 疫 缺 陷 病 毒 和 巨 細(xì) 胞 病 毒 對(duì) M T4 細(xì) 胞 和 成 纖 維 細(xì) 胞 的 病 變 作 用 ， 此 外 ， 還 具 有 抑 制 流 感 病 毒 的 活 性 ，

7、 主 要 是 因 為 其 碳 水 化 合 物 殘 基 上 含 唾 液 酸 ， 它 干 擾 病 毒 對(duì) 靶 細(xì) 胞 的 結(jié) 合 和 侵 染。 乳 鐵 蛋 白 通 過(guò) 抑 制 病 毒 進(jìn) 入 細(xì) 胞 ， 減 輕 對(duì) 人 體 肝 細(xì) 胞 的 損 害。,3、乳 鐵 蛋 白 具 有 抗 氧 化 作 用,研 究 結(jié) 果 顯 示 ， 乳 鐵 蛋 白 能 抑 制 鐵 誘 導(dǎo) 的 脂 質(zhì) 過(guò) 氧 化 過(guò) 程 所 產(chǎn) 生 的 硫 代 巴 比 妥 酸 和 丙 二 醛 的 生成 。 另 外 ， 牛 乳 鐵 蛋 白 能 降 解 酵 母 中 的 tR N A ，具 有 核 糖 核 酸 酶 的 活 性 ， 且 能 抑 制

8、超 氧 離 子 的 形 成 。 所有 這 些 都 可 降 低 人 體 內(nèi) 自 由 基 對(duì) 動(dòng) 脈 血 管 壁 彈 性 蛋 白 的 破 壞 ， 達(dá) 到 預(yù) 防 和 治 療 動(dòng) 脈 粥 樣 硬 化 和 冠 心 病 的 目 的,4、乳 鐵 蛋 白具 有 抗 癌 作 用,乳 鐵 蛋 白 對(duì) 消 化 道 腫 瘤 ， 如 結(jié) 腸 癌 、 胃 癌 、 肝 癌 、 胰 腺 癌 ， 具 有 化 學(xué) 預(yù) 防 作 用 ， 并 可 抑 制 由 此 引 發(fā) 的 腫 瘤 轉(zhuǎn) 移 。 另 外 ， 乳 鐵 蛋 白 在 啟 動(dòng) 宿 主 防 御 系 統(tǒng) 的 初 始 活 化 反 應(yīng) ， 調(diào) 控 不 同 類 型 淋 巴 細(xì) 胞 比

9、例 的 改 變 對(duì) 機(jī) 體 免 疫 反 應(yīng) 的 影 響 ， 提 高 免 疫 力 等 方 面 都 起 到 了 促 進(jìn) 作 用 。,5、乳 鐵 蛋 白 調(diào) 節(jié) 機(jī) 體 免 疫 反 應(yīng),乳 鐵 蛋 白 具 有 調(diào) 節(jié) 巨 噬 細(xì) 胞 活 性 和 刺 激 淋 巴 細(xì) 胞 合 成 的 能 力 ； 而 且 嗜 中 性 粒 細(xì) 胞 是 含 乳 鐵 蛋 白 最 多 的 細(xì) 胞 ， 在 機(jī) 體 受 感 染 時(shí) 可 以 將 乳 鐵 蛋 白 釋 放 出 來(lái) ， 釋 放 出 的 乳 鐵 蛋 白 奪 取 致 病 菌 的 鐵 離 子 致 使 后 者 死 亡 。 另 外 ， 經(jīng) 研 究 顯 示 ， 乳 鐵 蛋 白 對(duì) 抗

10、體 生 成 、T 細(xì) 胞 成 熟 、 淋 巴 細(xì) 胞 中 自 然 殺 傷 細(xì) 胞 比 例 都 具 有 調(diào) 節(jié) 作 用,6、乳 鐵 蛋 白 調(diào) 節(jié) 胃 腸 道 鐵 的 吸 收,乳 鐵 蛋 白 通 過(guò) 它 的 氨 基 和 羧 基 末 端 兩 個(gè) 鐵 結(jié) 合 區(qū) 域 能 高 親 和 性 地 ， 可 逆 地 與 鐵 結(jié) 合 ， 并 維 持 鐵 元 素 在 一 個(gè) 較 廣 的 p H 值 范 圍 內(nèi) 完 成 鐵 在 十 二 指 腸 細(xì) 胞 的 吸 收 和 利 用 。,7、乳 鐵 蛋 白 同 藥 物 的 協(xié) 同 作 用,研 究 顯 示 ， 乳 鐵 蛋 白 能 同 多 種 抗 生 素 和 抗 病 毒 藥 物

11、 協(xié) 同 作 用 ， 減 少 藥 物 用 量 ， 降 低 抗 生 素 或 抗 真 菌 制 劑 對(duì) 人 肝 。 腎 功 能 的 損 害 。 同 時(shí) ， 增 強(qiáng) 體 內(nèi) 微 生 物 對(duì) 藥 物 的 敏 感 性 。,影 響 Lf 功 能 的 因 素,實(shí)驗(yàn)證明，嬰兒或仔畜出生初期，Lf降解程度很低，隨后迅速升高，生理功能也逐漸消失。 Lf的抑菌作用具有很強(qiáng)的鐵依賴性，只有在其處于不飽和狀態(tài)時(shí)，才具有較強(qiáng)的抑菌能力，而在Lf呈鐵飽和狀態(tài)時(shí)，抑菌作用也不復(fù)存在。 pH值也影響Lf的活性，在pH中性環(huán)境中，Lf活力較強(qiáng)，當(dāng)pH 6 時(shí)，則基本無(wú)抑菌功能。 鹽的種類明顯影響Lf的抑菌能力，碳酸鹽可增強(qiáng)Lf的抑

12、菌作用，而檸檬酸鹽則會(huì)減弱 Lf的抑菌作用， 腸液內(nèi)存在 HC03一， 因此有利于Lf發(fā)揮抑菌功能。 此外， 抗體或其他免疫物質(zhì)也會(huì)影響Lf的抑菌能力，例如，Lf和初乳中的IgA 、 IgG就具有協(xié)同抑菌的作用。,Lf只有在維持其活性不被降解的前提下，才能發(fā)揮生理功能。,乳鐵蛋白的生產(chǎn)制備方法,牛初乳富含LF,可采用色譜法、超濾法、鹽析法、酸沉淀法等方法從初乳中提取乳鐵蛋白。,牛初乳經(jīng)冷凍離心機(jī)脫脂 ,35下加入適當(dāng)稀釋的皺胃酶液 ,分離去除酪蛋白. 微濾后即為用于超濾研究的物料. 用 MWCO為100000的超濾膜進(jìn)行首次超濾 ,透過(guò)液再用MWCO為50000的超濾膜進(jìn)行第二次超濾 ,然后用

13、 MWCO為10000的超濾膜進(jìn)行濃縮 ,冷凍干燥 ,即得到Lf 的粗品.,超濾法：,Lf的分離純化及檢測(cè)方法,目 前 鑒 定 乳 鐵 蛋 白 的 方 法主 要 有 ： 免 疫 雙 擴(kuò) 散 法 、酶 聯(lián) 免 疫 檢 測(cè) 法 (E L ISA ),反相高效液相色譜法等,反相高效液相色譜法測(cè)定牛初乳中乳鐵蛋白含量,色譜條件 色譜柱：Kromasil C4色譜柱（250mm*4.6mm,5m）。流動(dòng)相：乙腈-水-三氟乙酸（80:20:0.1)流速0.6mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):220nm,柱溫：25；進(jìn)樣量10.0L,樣品溶液的制備 量取新鮮牛初乳離心除脂肪，得到的脫脂乳調(diào)pH值至4.6，離心除酪蛋白

14、，收集乳清，然后調(diào)pH值至6.8，加硫酸銨使飽和度達(dá)到40%，離心取乳清液，用截留分子量為300Ku、100Ku、30Ku的超濾膜包進(jìn)行超濾，收集30Ku膜包超濾后的回留液進(jìn)行離子交換層析，收集洗脫峰，即為樣品溶液。,精密稱取乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品1mg,配制濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.05、0.025mg/mL的對(duì)照品溶液。,乳鐵蛋白進(jìn)樣量濃度在25-1000g/mL時(shí)，線性關(guān)系良好。,取樣品進(jìn)行RP-HPLC檢測(cè)。如圖3所示為離子交換層析后收集各洗脫峰，其中峰1、2為未吸附蛋白流穿液，峰3為低鹽濃度洗脫液，峰4為高鹽濃度洗脫液，即提取的乳鐵蛋白洗脫液。 圖4為峰4洗脫液經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示牛初乳經(jīng)除脂肪、除酪蛋白、超濾和離子交換層析后，提取的乳鐵蛋白的平均純度為92.23%，RSD為1.3%。,作為一種高效補(bǔ)鐵組分，Lf可用作食品添加劑，以改變嬰幼兒及孕婦普遍缺鐵的現(xiàn)狀 ， 也可制成含鐵飲料或補(bǔ)鐵膠囊，用來(lái)提高造血功能，改善貧血。 在食品或乳制品(如嬰幼兒奶粉)甚至口香糖中，添加Lf可調(diào)節(jié)免疫功能