1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué) 課件模板-7,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：第五節(jié)抗體的制備,第五節(jié)抗體的制備：,為了研究抗體的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)與功能，以及應(yīng)用抗體于臨床疾病的診斷、治療及預(yù)防都需要人工制備抗體。目前，根據(jù)制備的原理和方法可分為多克隆抗體、單克隆抗體及基因工程抗體三類。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、多克隆抗體,一、多克隆抗體：,大多數(shù)抗原是由大分子蛋白質(zhì)組成，但只是抗原上有限部位的特殊分子結(jié)構(gòu)能與其相應(yīng)抗體結(jié)合，稱此部位為抗原決定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。 一種天然抗原性物質(zhì)（如細菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等）往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機體一種抗

2、體形成細胞產(chǎn)生一種特異性抗體。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、多克隆抗體,一、多克隆抗體：,在機體淋巴組織內(nèi)可存在千百種抗體形成細胞（即B細胞），每種抗體形成細胞只識別其相應(yīng)的抗原決定簇，當(dāng)受抗原刺激后可增殖分化為一種細胞群，這種由單一細胞增殖形成的細胞群體可稱之為細胞克隆（clone）。同一克隆的細胞可合成和分泌在理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、遺傳標(biāo)記以及生物學(xué)特性等方面都是完全相同的均一性抗體，亦可稱之為單克隆抗體。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、多克隆抗體,一、多克隆抗體：,在早期傳統(tǒng)的抗體制備方法是將一種天然抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，由于抗原性物質(zhì)具有多種抗原決定簇，故可刺激產(chǎn)生多種抗體形成細胞克隆，合成和分泌抗各種決定簇抗

3、體分泌到血清或體液中，故在其血清中實際上是含多種抗體的混合物，稱這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清為多克隆抗體，也是第一代抗體。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、多克隆抗體,一、多克隆抗體：,由于這種抗體是不均一的，無論是對抗體分子結(jié)構(gòu)與功能的研究或是臨床應(yīng)用都受到很大限制，因此如何能獲得均一性抗體成為關(guān)注的問題。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：二、單克隆抗體,二、單克隆抗體：,體內(nèi)免疫法很難獲得單克隆抗體（monoclonal antibody,McAb）。如能將所需要的抗體形成細胞選出并能在體外進行培養(yǎng)即可獲得已知特異的單克隆抗體。1975年德國學(xué)者Kohler和英國學(xué)者Milstein將小鼠骨髓瘤細胞和經(jīng)綿羊紅細胞（she

4、ep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾細胞在體外進行兩種細胞融合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分形成的雜交細胞既能繼續(xù)在體外培養(yǎng)條件下生長繁殖又能分泌抗SRBC抗體，稱這種雜交細胞系為雜交瘤（hybridoma）。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：二、單克隆抗體,二、單克隆抗體：,這種雜交瘤細胞既具有骨髓瘤細胞能大量無限生長繁殖的特性，又具有抗體形成細胞合成和分泌抗體的能力。它們是由識別一種抗原決定簇的細胞克隆所產(chǎn)生的均一性抗體，故稱之為單克隆抗體。應(yīng)用雜交瘤技術(shù)可獲得幾乎所有抗原的單克隆抗體，只要這種抗原能引起小鼠的抗體應(yīng)答。 這種用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體可視為第二代抗體。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：二、單克隆抗體,

5、二、單克隆抗體：,單克隆抗體由于純度高、特異性強、可以提高各種血清學(xué)方法檢測抗原的敏感性及特異性，但單克隆抗體多為雙價抗體，與抗原結(jié)合不易交聯(lián)為大分子集團，故不易出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。單克隆抗體的應(yīng)用大促進了對各種傳染病和惡性腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。 單克隆抗體亦可與核素、各種毒素（如白喉外毒素或篦麻毒素）或藥物通過化學(xué)偶聯(lián)或基因重組制備成導(dǎo)向藥物（targetting drug）用于腫瘤的治療，是一種新型免疫治療方法，有可能提高對腫瘤的療效。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：二、單克隆抗體,二、單克隆抗體：,單克隆抗體亦可用于對各種免疫細胞及其它組織細胞表面分子的檢測，這對免疫細胞的分離、鑒定及分類及研究各種膜表面分子的結(jié)構(gòu)

6、與功能都具有重要意義。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：三、基因工程抗體,三、基因工程抗體：,自1975年單克隆抗體雜交瘤技術(shù)問世以來，單克隆體在醫(yī)學(xué)中被廣泛地應(yīng)用于痢疾的診斷及治療。但目前絕大數(shù)單克隆抗體是鼠源的，臨床重復(fù)給藥時體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體，使臨床療效減弱或消失。因此，臨床應(yīng)用理想的單克隆抗體應(yīng)是人源的，但人-人雜交瘤技術(shù)目前尚未突破，即使研制成功，也還存在人-人雜交瘤體外傳代不穩(wěn)定，抗體親合力低及產(chǎn)量不高等問題。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：三、基因工程抗體,三、基因工程抗體：,目前較好的解決辦未能是研制基因工程抗體，(genetically engineering antibody)以代替鼠源單克隆抗體用于臨床。 基因

7、工程抗體興起于80年代早期。這一技術(shù)是將對Ig基因結(jié)構(gòu)與功能的了解與DNA重組技術(shù)相結(jié)合，根據(jù)研究者的意圖在基因水平對Ig分子進行切割、拼接或修飾，甚至是人工全合后導(dǎo)入受體細胞表達，產(chǎn)生新型抗體，也稱為第三代抗體。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：三、基因工程抗體,三、基因工程抗體：,基因工程抗體包括嵌合抗體、重構(gòu)抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體及抗體庫等。其中以嵌合抗體研究的較多，也較成熟。單鏈抗體及單區(qū)抗體雖具有結(jié)構(gòu)簡單、分子小等優(yōu)點但其臨床應(yīng)用的前景尚待證實。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：第三章補體系統(tǒng),第三章補體系統(tǒng)：,在血液或體液內(nèi)除Ig分子外，還發(fā)現(xiàn)另一族參予免疫效應(yīng)的大分子，稱為補體分子。早在19世紀(jì)末，發(fā)現(xiàn)在新鮮免疫血清

8、內(nèi)加入相應(yīng)細菌，無論進行體內(nèi)或體外實驗，均證明可以將細菌溶解，將這種現(xiàn)象稱之為免疫溶菌現(xiàn)象。如將免疫血清加熱60C30分鐘則可喪失溶菌能力。進一步證明免疫血清中含有二種物質(zhì)與溶菌現(xiàn)象有關(guān)，即對熱穩(wěn)定的組分稱為殺菌素，即抗體（complement,C）。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：第三章補體系統(tǒng),第三章補體系統(tǒng)：,其后又證實了抗各種動物紅細胞的抗體加入補體成分亦可引起紅細胞的溶解現(xiàn)象。自此建立了早期的補體概念。即補體為正常血清中的單一組分，它可被抗原與抗體形成的復(fù)合物所活化，產(chǎn)生溶菌和溶細胞現(xiàn)象。而單獨的抗體或補體均不能引起細胞溶解現(xiàn)象。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,進入

9、60年代后，由于蛋白質(zhì)化學(xué)和免疫化學(xué)技術(shù)的進步，自血液中分離、純化補體成分成功，現(xiàn)已證明補體是單一成分的論點是不正確的，它是由三組球蛋白大分子組成。即第一組分是由9種補體成分組成，分別命名為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。其中C1是由三個亞單位組成，命名為Clq、Clr、Cls，因此第一組分是由11種球蛋白大分子組成。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,在70年代又發(fā)現(xiàn)一些新的血清因子參予補體活化，但它們不是經(jīng)過抗原抗體復(fù)合物的活化途徑。而是通過旁路活化途徑。這此些因子包括B因子、D因P因子，它們構(gòu)成補體的第二組分。其后又發(fā)現(xiàn)多種參矛控制補

10、體活化的抑制因子或滅活因子，如CI抑制物、I因子、H因子、C4結(jié)合蛋白、過敏毒素滅活因子等。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,這些因子可控制補體分子的活化，對維持補體在體內(nèi)的平衡起調(diào)節(jié)作用，它們構(gòu)成了補體的第三組分。 由于補體活化另一途徑的深入研究，對補體系統(tǒng)的生物學(xué)意義有了新的識別，從而打破了對補體的傳統(tǒng)觀點，建立了新的概念。即補體系統(tǒng)是由將近20多種血清蛋白組成的多分子系統(tǒng)，具有酶的活性和自我調(diào)節(jié)作用。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,它至少有二種不同的活化途徑，其生物學(xué)意義不僅是抗體分子的輔助或增強因子，也具有獨立的生物

11、學(xué)作用，對機體的防御功能、免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)以及免疫病理過程都發(fā)揮重要作用。 1968年世界衛(wèi)生組織（WHO）的補體命名委員會對補體進行了統(tǒng)一命名。分別以C1C9命名,1981年對新發(fā)現(xiàn)的一些成分和因子也進行了統(tǒng)一命名。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,每一補體的肽鏈結(jié)構(gòu)用希臘字母表示,如C3a和鏈等。每一分子的酶解斷片可用小寫英文字母表示如C3a和C3b等酶解斷片，具有酶活性分子可在其上畫橫線表示之，如C1為無酶活性分子，而C1為有酶活性分子。對具有酶活性的復(fù)合物則應(yīng)用其斷片表示，如C3轉(zhuǎn)化酶可用C4b,2a表示。 表3-1 WHO對部分補體成分的命名（19

12、81） 統(tǒng)一名稱曾用名稱B因子C3激活劑前體，熱穩(wěn)定因子等D因子C3激活劑前體轉(zhuǎn)化酶，GBGase等P因子備解素H因子C3bINA促進因子I因子C3b滅活因子，KAF等 補體分子是分別由肝細胞、巨噬細胞以及腸粘膜上皮細胞等多種細胞產(chǎn)生的。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,其理化性質(zhì)及其在血清中的含量差異甚大。全部補體分子的化學(xué)組成均為多糖蛋白，各補體成分的分子量變動范圍很大，其中C4結(jié)合蛋白的分子量最大，為55萬，D因子分子量最小僅為2.3萬。大多數(shù)補體成分的電泳遷移率屬球蛋白，少數(shù)屬a球蛋白及球蛋白。血清中補體蛋白約占總球蛋白的10%，其中含量最高的為C3，

13、約含1mg/ml，而D因子僅含1g/ml，二者相差約千倍。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：一、補體分子的組分和命名,一、補體分子的組分和命名：,人類某些疾病其總補含量或單一成分含量可發(fā)生變化，因而對體液中補體水平的測定，或組織內(nèi)補體定位觀察，對一些疾病的診斷具有一定意義。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：二、補體的理化性質(zhì),二、補體的理化性質(zhì)：,補體系統(tǒng)中各成分的理化性狀概括列于表3-2。由表見，補體成分大多是球蛋白，少數(shù)幾種屬a或球蛋白，分子量在25390KD之間。在血清中的含量以C3為最高，達1300g/ml，其次為C4、S蛋白和H因子，各約為C3含量的1/3；其他成分的含量僅為C3的1/10或更低。 補體成分的產(chǎn)生部位如表3

14、-3所示，其中C7的產(chǎn)生部位尚不清楚。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：二、補體的理化性質(zhì),二、補體的理化性質(zhì)：,表3-2 補體系統(tǒng)各成分的理化性狀 補體成分分子量(KD)電泳區(qū)帶肽鏈數(shù)目血清含量裂解片段Clq39021870Clr95135Cls85135C21171130C2a,C2bC3(A因子)190121300C3a,C3bC3c,C3dC418023430C4a,C4b C4c,C4dC51901275C5a,C5bC61282160C71202155C81631355C9791200B因子（C3PA）951240Ba,BbD因子（C3PA酶原）2512P因子（備解素）2202425C1INH1051

15、180C4bp110068250I因子（C3bINA）93250H因子（1H）1501400S蛋白801500 表3-3 補體系統(tǒng)各成分產(chǎn)生部位 補體成分產(chǎn)生部位C1小腸上皮細胞、脾、巨噬細胞C2巨噬細胞C3巨噬細胞、肝C4巨噬細胞、肝C5巨噬細胞C6肝C7？C8肝C9肝B因子巨噬細胞、肝D因子巨噬細胞、血小板P因子巨噬細胞I因子巨噬細胞H因子巨噬細胞、血小板。,醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：第二節(jié)補體系統(tǒng)的激活,第二節(jié)補體系統(tǒng)的激活：,補體系統(tǒng)各成分通常多以非活性狀態(tài)存在于血漿之中，當(dāng)其被激活物質(zhì)活化之后，才表現(xiàn)出各種生物學(xué)活性。補體系統(tǒng)的激活可以從C1開始；也可以越過C1、C2、C4，從C3開始。前一種激活途徑稱為經(jīng)典途徑（classical pathway）或替代途徑?！?/p>