1、課題3 血紅蛋白的提取和分離,課標(biāo)領(lǐng)航 1概述凝膠色譜法、電泳法等分離大分子的基本原理。 2能根據(jù)凝膠色譜過(guò)程中的現(xiàn)象和結(jié)果，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)操作的過(guò)程是否規(guī)范，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 3嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗(yàn)從復(fù)雜的體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法。 【重點(diǎn)】凝膠色譜法、電泳法基本原理。 【難點(diǎn)】實(shí)驗(yàn)操作的過(guò)程及分析。,基礎(chǔ)自主梳理,一、凝膠色譜法 1概念：也稱(chēng)作分配色譜法，是根據(jù)_質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。 2原理 (1)由微小的多孔球體構(gòu)成的凝膠，內(nèi)部有許多貫穿的通道。,相對(duì)分子,蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)：分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等,

2、(2)由相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量_的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在_移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快，從而使相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。,較小,凝膠外部,蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析,2配制：由12種緩沖劑溶解于水中配制而成，通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖劑的_就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。 三、電泳 1概念：指_在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。 2原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解離基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷_的電極移動(dòng)。,使用比例,

3、帶電粒子,相反,二、緩沖溶液 1作用：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的_對(duì)溶液pH的影響，維持pH基本不變。,酸和堿,3作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異及分子本身的大小、_的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。 4方法：常用的電泳方法有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。,形狀,遷移速度,四、,四、實(shí)驗(yàn)操作 1樣品處理：通過(guò)_、_、分離血紅蛋白溶液等操作收集血紅蛋白溶液。 (1)紅細(xì)胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。分離時(shí)采取低速短時(shí)間離心，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 (2)血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和_的作用下，紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白。,(3)

4、分離血紅蛋白溶液：把攪拌好的混合液離心后, 分為四層：1.無(wú)色透明的甲苯層2.白色薄層固體(脂類(lèi)物質(zhì))3.紅色透明液體(血紅蛋白的水溶液)4.其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層,于分液漏斗中靜置片刻后，分離出下層的紅色透明液體。,甲苯,血紅蛋白的釋放,紅細(xì)胞的洗滌,2粗分離：即透析 (1)方法：將血紅蛋白溶液裝入透析袋，將透析袋放入一定量適宜濃度的_中，透析12 h. (2)目的：將樣品中分子較小的雜質(zhì)除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子物質(zhì)保留在袋內(nèi)。,磷酸緩沖液,3純化：通過(guò)凝膠色譜柱將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去。操作如下： (1)凝

5、膠色譜柱的制作。 (2)凝膠色譜柱的裝填 材料：本實(shí)驗(yàn)使用的是交聯(lián)葡聚糖凝膠。 方法：凝膠用_充分溶脹后，配成凝膠懸浮液，一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)。不能有_存在；不能發(fā)生洗脫液流干露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。 (3)樣品的加入和洗脫 a.準(zhǔn)備：加樣前，打開(kāi)流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與_平齊，關(guān)閉出口。,蒸餾水,氣泡,凝膠面,b加樣：用吸管小心地將1 mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。 c加樣后：打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi). 洗脫：加入_，打開(kāi)下端出口，進(jìn)行洗脫。 4純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 五、操作提示 1紅細(xì)胞的洗滌：洗滌

6、次數(shù)、_與離心時(shí)間十分重要。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法除去血漿蛋白：離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使_等一同沉淀，達(dá)不到分離效果。,磷酸緩沖液,離心速度,白細(xì)胞,2色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在洗脫液中膨脹，可以將加入其中的濕凝膠用_加熱，加速膨脹。 3凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時(shí)，不得有氣泡存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 4蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶_地移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。,沸水浴,均勻一致,血紅蛋白的提取和分離,蛋白質(zhì)的提取和分離一般分四步： 樣品處理粗分離純化純度鑒定。 1樣品處理,(1)紅細(xì)胞的洗滌 采集血樣低速短時(shí)間離心吸取血漿生理鹽水洗滌低速離心重

7、復(fù)步驟三次。 特別提醒 (1)洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。 (2)離心時(shí)轉(zhuǎn)速要低，時(shí)間要短，一般為500 r/min，離心2 min。 (3)洗滌三次后，如上清液仍有黃色，可增加洗滌次數(shù)。,重點(diǎn)回顧：,特別提醒 (1)將試管中的液體用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層。 (2)將濾液于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的血紅蛋白水溶液層。,(4)透析 取1 mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300 mL的物質(zhì)的量濃度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中(pH為7.0)，透析12 h。目的是除去樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。,2凝膠色譜操作 (1)凝膠色譜柱的制作 取長(zhǎng)4

8、0 cm，內(nèi)徑為1.6 cm的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。 底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。 頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。 組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。 安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。,特別提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。,(2)凝膠色譜柱的裝填(本實(shí)驗(yàn)使用的凝膠是交聯(lián)葡聚糖凝膠) 固定：將色譜柱垂直固定在支架上 裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內(nèi) 洗滌：用磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h,(3)樣品的加入和洗脫 調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊 滴加透析樣品：用量為1 m

9、L 樣品滲入凝膠床：樣品完全滲進(jìn)凝膠層 洗脫：打開(kāi)下端出口，用磷酸緩沖液洗脫 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集,特別提醒 (1)滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 (2)在蛋白質(zhì)分離過(guò)程中，仔細(xì)觀察紅色區(qū)帶在洗脫過(guò)程中的移動(dòng)情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功。,謝謝大家,有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說(shuō)法正確的是() A它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法 B它們的原理相同 C使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要 D以上說(shuō)法都正確,A,下列各項(xiàng)中，一般不影響凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的分離度的是() A層析柱的高度 B層析柱的直徑 C緩沖溶液 D樣品的分布,B,下面是凝膠色譜法分離血紅蛋白時(shí)樣品的加入(圖)和洗脫(圖)示意圖，請(qǐng)據(jù)圖回答下列問(wèn)題。,(1)在加樣示意圖中，正確的加樣順序是_。 (2)用吸管加樣時(shí)，應(yīng)注意正確操作，分別是_、貼著管壁加樣、 。 (3)等樣品 時(shí)，才加入緩沖液，待_接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每_mL收集一管，連續(xù)收集。,不要破壞凝膠面,使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng),完全進(jìn)入凝膠層,紅色的蛋白質(zhì),5,【互動(dòng)探究】(1)凝膠色譜柱的裝