1、1,第八章 體液蛋白質檢驗,人類白蛋白分子,2,1、掌握血漿蛋白質的組成、功能及分類；個別血漿蛋白質（前 白蛋白、白蛋白）的來源和生理功能；血清總蛋白和白蛋白的 測定方法和原理。,2、熟悉急性時相反應蛋白的概念和種類；血清球蛋白和纖維蛋 白原的測定方法,3、了解其他蛋白質的來源和生理功能；尿液蛋白和腦脊液蛋白 的檢測 。,本章教學要求：,3,第一節(jié) 血漿蛋白質概述,機體蛋白質：,體液蛋白質的檢測：,機體主要的 生物大分子,含量：人體固體成分的45%,種類：10萬，30005000種/單細胞,功能：生長，代謝、血凝、運動、免疫、信息傳遞等,疾病發(fā)生,體液蛋白質異常,4,要判斷異常,首先要清楚正常

2、的血漿蛋白質組成、功能、分類及特點,一、血漿蛋白質的功能及分類,組成：,種類：1000種 500種 200種 含量：g mg g 來源：肝臟是蛋白質主要的加工廠,5,功能：,維持血漿膠體滲透壓：白蛋白維持75%80%的血漿滲透壓； 運輸功能：脂溶性物質、激素、維生素、脂類、代謝產物、離子、藥物等的載體； 維持血漿的酸堿平衡：酸性或堿性蛋白質； 免疫與防御功能：血漿免疫球蛋白與補體等免疫分子； 凝血、抗凝血及纖溶等功能：除因子外均可 營養(yǎng)作用，修補組織蛋白; 催化作用：酶的本質； 調控物質代謝；作為底物，酶或中間產物抑制或激活組織蛋白酶；,6,分類：,依據(jù)來源、分離方法和生理功能,來源,肝生成：

3、絕大多數(shù)血漿蛋白質,其他組織細胞生成：免疫球蛋白和蛋白類激素,7,分離方法,鹽析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半飽和的硫酸銨溶液）,電泳法：,醋酸纖維素薄膜電泳：6種,瓊脂糖凝膠電泳：13種,聚丙烯酰胺凝膠電泳：30種,SDS聚丙烯酰胺凝膠等電雙向電泳：300種,分辨率增高,-,-,-,+,纖維蛋白原,醋酸纖維素薄膜,8,即時可用的蛋白質電泳標準,9,功能分類:,10,二、血漿中幾種主要的蛋白質,結構： MW=54000，四個相同亞基構成的四聚體。 理化性質：p4.7，肝細胞合成，半壽期12 小時。 測定方法：免疫比濁法免疫擴散技術。,（一）前清蛋白（PA）急性時相反應蛋白,11,功能：營養(yǎng)指

4、標，載體功能（甲狀腺素維生素）。 臨床意義： 敏感性高的指標； 降低：營養(yǎng)不良，肝功不全， 急性炎癥，惡性腫瘤， 肝硬化及腎炎時。 參考值： 200400mg/L 。,12,結構：585個aa殘基構成的單鏈多肽， MW=66458，含17個二硫鍵。 理化性質：pI=45.8，肝細胞合成但不儲存，半衰期為15-19 天，占總蛋白的40%60%，p7.4時帶負電。 測定方法：色素結合法:溴甲酚綠（BCG），溴甲酚紫（BCP）,鹽析等。,（二）清蛋白（ALB）急性時相反應蛋白,13,功能：營養(yǎng)作用，載體功能（高親和力）和解毒，維持血漿滲透壓和正常p值。 臨床意義：合成受食物影響，敏感性較低。 降低:

5、在營養(yǎng)不良，肝功不全，急慢性肝疾病時; 增高:少見,假性升高。 參考值：35-50 g/,14,結構： MW=12-16 萬, 1046個aa殘基構成的單鏈多肽，含糖約，每分子銅藍蛋白可結合個銅原子。 理化性質：肝合成,巨噬細胞和淋巴細胞合成少量；pI 值為4.4， 具遺傳基因多態(tài)性。 測定方法：免疫化學（擴散或比濁）等,（三）銅藍蛋白(CER) 急性時相反應蛋白,15,功能：具氧化酶活性且起抗氧化劑作用，銅的無毒代謝庫 臨床意義： 增加感染,創(chuàng)傷,腫瘤; 降低-營養(yǎng)不良，嚴重肝病及腎綜;協(xié)助診斷肝豆狀核變性（Wilson ?。恒~藍蛋白降低，游離銅增加致銅在肝沉積引起肝硬化，腦基底節(jié)豆狀核變

6、性。 參考值：了解,16,結構： MW=7.7 萬,單鏈糖蛋白，含糖約。 理化性質：肝細胞合成， pI 值為5.5-5.9,半壽期7 天，可逆結合多價離子如Fe,Cu,Zn,Co 等，一分子TRF 可結合兩個三價鐵。 測定方法：免疫擴散法，放免法和免疫比濁法等。,（四）轉鐵蛋白(TRF) 急性時相反應蛋白,17,功能：運輸鐵。 臨床意義：血TRF 濃度受鐵供應調節(jié)，缺鐵TRF 升，鐵治療后恢復?？捎糜谪氀脑\斷和對治療的監(jiān)測。 降低:急性時相反應、慢性肝病、營養(yǎng)不良及蛋白丟失時； 升高：妊娠或雌激素會使其升高;缺鐵性低色素貧血升高。 參考值：了解,18,結構： 兩對肽鏈形成四聚體，有變異體。

7、理化性質：肝合成， pI 值為4.1，電泳位a2 -球蛋白區(qū)帶 測定方法：電泳法，免疫化學法（擴散,濁度）,化學法等,（五）結合珠蛋白(Hp) 急性時相反應蛋白,19,功能： 與紅細胞中釋出自由Hb 結合,防止Hb 從尿中丟失保存鐵, 急性溶血后一周再生恢復。 高效的過氧化物酶。 需鐵細菌的天然抑菌劑。 臨床意義： 升高：急性時相反應；雄激素刺激升高 降低：血管內溶血時；雌激素使其降低。 參考值：0.5-2.2 g/L,20,結構：394個aa殘基構成的單鏈多肽，含1012%的糖MW=5.5 萬。 理化性質：pI值為4.8，占1-球蛋白區(qū)帶顯色的90。 測定方法：免疫化學法，電泳（酸性凝膠電泳

8、或等電聚焦電泳），利用蛋白酶抑制能力測定等。,（六）1-抗胰蛋白酶（AAT）急性時相反應蛋白,21,功能：蛋白酶抑制物（具有90的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，彈性蛋白酶，但此抑制作用有明顯的p依賴性。 臨床意義： 降低：血漿AAT僅見于胎兒呼吸窘迫綜合癥。 升高：炎癥、術后，某些激素治療后。 參考值： 0.831.99g/L,22,結構：181個aa殘基構成的單鏈多肽， MW=4萬，含45%的糖，其中唾液酸占11%12%。 理化性質：pI 值2.73.5，肝合成，膿毒癥時粒細胞和單核細胞及某些腫瘤組織也可合成。 位于1-球蛋白區(qū)帶。 測定方法：免疫化學法（擴散,濁度）,化學法（間接法），EL

9、ISA法等,（七）1-酸性糖蛋白（AAG） 急性時相反應蛋白,23,功能：與免疫防御功能有關，機制不詳；抑制血小板凝集影響膠原纖維形成；參與脂類運輸。 臨床意義： 升高：急性炎癥，組織損傷，風濕，腫瘤，急性心肌梗死（AMI），潰瘍性結腸炎； 降低：營養(yǎng)不良降低, 嚴重肝損傷和雌激素使其降低。 參考值：.252.0g/L 。,24,結構： MW=6280 萬,分子量最大，由四個相同的亞基組成，含糖量約。 理化性質：肝細胞與單核吞噬細胞系統(tǒng)中合成，半壽期5 天。 測定方法：免疫化學等,（八）2-巨球蛋白(AMG),25,功能：與多種分子和離子結合，影響蛋白水解酶活性（主要的蛋白酶抑制劑具有選擇性保

10、護某些酶的作用）。 臨床意義：嬰幼兒及兒童比成人高； 升高：雌激素，低蛋白血癥可使其含量升高； 降低：胰腺炎及前列腺癌時。 參考值：1.31-2.93g/L,26,結構： MW11.5-14 萬，分子含個相同的亞基，亞基間靠非共價鍵連接成圓盤狀多聚體。 理化性質：肝合成， pI 值為6.2，電泳位于 區(qū)帶。 測定方法：半定量沉淀法（早），免疫化學法。,（九）C-反應蛋白質(CRP) 急性時相反應蛋白,27,功能：結合多糖，磷脂和核酸；激活補體，抗凝。 臨床意義：第一個認定的急性時相反應蛋白,是急性時相反應的一個敏感指標，在、創(chuàng)傷、感染、外科手術時含量迅速升高，達到正常的2000倍。 參考值：

11、8.0mg/L （血漿）,28,（十）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）,生 化 特 性,1、于結腸癌的提取物中發(fā)現(xiàn)，因此抗原也出現(xiàn)在胚 胎細胞上，故稱癌胚抗原。 2、CEA是一種結構復雜的可溶性酸性糖蛋白，含糖量約為45%55%； CEA屬細胞表面糖蛋白家族，不規(guī)則地分布于細胞表面，易被細胞分泌或脫落至血液或其它體液中； 電泳位置于-球蛋白的位置；有5種互相不重疊的抗原決定族，分別命名為Gold15，其中13有很高的特異性，45有交叉反應,29,基因位于19號染色體上，由10個基因組成，可表達36種不同的糖蛋白， 胚胎期主要由胎兒的消化道上皮、肝臟和胰細胞分

12、泌，出生后消失。 成人CEA主要是由結腸粘膜細胞分泌到糞便中， 少量重吸收入血。 健康成人血中CEA濃度小于2.5g/L。,生 化 特 性,30,臨 床 應 用,CEA是一種低器官特異性腫瘤標志物。不適合作某種惡性腫瘤的診斷和篩查，但對預后判斷、療效觀察及輔助診斷是一個有效的監(jiān)測指標，也是發(fā)現(xiàn)復發(fā)的理想指標,1、用于輔助診斷： 腫瘤名稱 陽性率 結腸癌 70%90% 胰腺癌（中晚期） 88% 91%， 肺癌 76%， 乳腺癌 70% 2、檢測胃液中的CEA對胃癌有一定的診斷意義。,31,3、CEA比正常持續(xù)升高510倍（如20g/L） 往往提示有惡性腫瘤特別是腸癌的存在。 4、注意排除非癌性C

13、EA升高。 良性疾病如吸煙者、酒精性肝硬化、肺氣腫、結腸息肉、非特異性結腸炎、胰腺炎、良性乳腺疾病等也可引起CEA的上升,臨 床 應 用,32,結構：590個aa殘基構成的單鏈多肽， MW=6.5萬萬，含4%的糖。 理化性質：pI 值.7-.8，在白蛋白和1-球蛋白之間。胎兒肝卵黃囊合成，成人量微，升高由于腫瘤細胞合成。 測定方法：免疫化學法（擴散,火箭電泳）,ELISA等,（十一）甲胎蛋白(AFP),33,功能：胎兒血漿主要蛋白質，調節(jié)肝細胞生長和腦細胞發(fā)育；抑制細胞和體液的免疫反應；維持正常妊娠，防止母嬰排斥。 臨床意義：胎兒產前監(jiān)測（羊水或母血） 增高：原發(fā)性肝癌患者診斷和鑒別（80%原

14、發(fā)增高）， 其他癌癥也可見增高。 參考值：20-100g/L(成人) 5g/L(新生兒),34,三、疾病時的血漿蛋白質,：在急性炎癥或某些組織損傷時，有些血漿蛋白質含量會增高，有些會降低，這種現(xiàn)象稱為急性時相反應。而這些血漿蛋白質被稱為急性時相反應蛋白。,（一）急性時相反應與急性時相反應蛋白,35,急性時相反應蛋白分類：,升高：其他多種蛋白質。,降低：前白蛋白、白蛋白、轉鐵蛋白,36,急性時相反應機制： 當機體受到損傷或炎癥時釋放小分子蛋白質導致肝細胞 中上述蛋白質的合成增加或減少。,急性時相反應的應用： 急性時相反應時,血漿蛋白質的變化和創(chuàng)傷的時間進程有關，可用于鑒別急性、亞急性和慢性病理狀

15、態(tài)。,37,38,（二）肝臟疾?。?（三）腎臟疾病：,腎病早期,嚴重腎臟,選擇性蛋白質丟失,非選擇性蛋白質丟失,（四）風濕?。好庖咔虻鞍?，1-酸性糖蛋白，結合珠蛋白及升高,（五）遺傳性缺陷：多由于編碼相應蛋白質的基因發(fā)生突變或缺失。,非典型的急性時相反應，,急性肝炎,慢性肝硬化 見表8-3,39,40,第二節(jié) 體液蛋白質測定,總蛋白測定,個別蛋白質的測定,蛋白分離測定技術,發(fā)展趨勢:,測定體液標本:,血漿：普遍,尿液，腦脊液和胸腹水等：有選擇性的組織病變檢查,41,免疫化學法特異定量個別蛋白質,體液蛋白質的測定方法概括：,常規(guī)：免疫濁度法、免疫擴散法，免疫電泳法， 微量：放射免疫測定（RIA）

16、，酶免疫測定法（ELA/ELISA）,42,電泳測定：,定量化學測定TPr，Alb,電泳 組成圖譜 半定量 定量,染料結合法，UV法，折光法等,43,（一）血清總蛋白測定,假設：,、 純多肽鏈，含氮量平均為16 % 、各種蛋白質與化學試劑反應性一致，僅為相對定量,44,測定依據(jù)：蛋白質測定一般利用蛋白質以下的結構或性質,1、元素組成測定：含N穩(wěn)定； 2、重復的肽鏈結構：具有多個肽鍵； 3、酪氨酸和色氨酸與Folin-酚試劑反應顯色或UV 吸收； 4、與色素結合的能力：與染料以離子鍵或共價鍵連接； 5、沉淀后借濁度測定：光度計測定； 6、光折射測定：折射儀測定。,45,方法：,1.凱氏定氮法參考

17、方法2.雙縮脲法( 推薦) 3.酚試劑法4.散射比濁法 5.染料結合法6. UV 法 .折光測定法,46,1.凱氏定氮法參考標準方法(0.05mg N 0.3g pro),消化用濃硫酸將蛋白質消化為硫酸銨；（耗時） 蒸餾用堿性溶液堿化消化液并蒸餾揮發(fā)； 吸收用酸性溶液（硼酸）吸收氣態(tài)氨（使H+ ） 滴定用已標定的無機酸滴（使H+ 恢復），計算總氮量 定蛋白（總氮量-非蛋白氮）6.25=蛋白含量,納氏試劑：碘化汞和碘化鉀的堿性溶液與氨反應生成淡黃棕色膠態(tài)化合物，其色度與氨氮含 量成正比。,原理：,47,評價：,優(yōu)點：準確度高，精密度高，靈敏度高，是公認的參考方法。 缺點：操作復雜，費時，不適合常

18、規(guī)檢測，血清各蛋白含氮量會有所變化尤其是疾病時。,應用：標準蛋白的標定及校正其它常規(guī)方法,48,2.雙縮脲法,原理：,蛋白質中的肽鍵（-CONH-）在堿性溶液中能與Cu2+作用而產生紫紅色絡合物， 其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質的分子量及氨基酸成分無關。,條件：至少含兩個肽鍵（-CONH-）基團才能和Cu2+形成絡合物,氨基酸及二肽無反 應,三肽以上才能反應。,雙縮脲生成,49,評價：,優(yōu)點：簡便，準確，重復性好，10g-120g/L線性好，特異性與精密度好，批內CV%2%，顯色穩(wěn)定。 缺點：靈敏度較差，對蛋白質含量低的體液標本不適合。,應用：常規(guī)推薦方法。手工或上機使用。,50

19、,3.酚試劑法,原理：,蛋白質分子中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基能夠和酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸反應生成藍色化合物，,Lowry改良法：在酚試劑中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的靈敏度，為雙縮脲法的100倍左右。,Folin 1921 年首創(chuàng)，利用蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍色反應。1951 年，Lowry 對此法進行了改進，先于標本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應，提高了靈敏度。,51,評價及應用：,優(yōu)點：操作簡單，改良法靈敏度高（10g-60g），適合測定蛋白含量少的標本。 缺點：各種蛋白質酪氨酸和色氨酸比例不同，只適合測定單一蛋白質。受一些藥物干

20、擾。,52,4.比濁法,原理：,評價及應用：,優(yōu)點：簡便不需特殊儀器。 缺點：濁度形成的干擾因素多（加試劑方法，反應溫度，蛋白絮狀沉淀等）,某些酸類（磺基水楊酸等）和血清蛋白質結合產生沉淀，測其濁度，與標準對比，可求蛋白含量。,53,5.染料結合法,在酸性環(huán)境下，帶正電的蛋白質（-NH3+)與染料的陰離子產生顏色反應，使染料的吸收峰改變，可既而用分光光度法比色測定。,原理：,常用染料：氨基黑，考馬斯亮藍等,評價及應用：,優(yōu)點：操作簡便，重復性好，靈敏度高，且干擾因素少。 缺點：特異性不高；不同蛋白質和染料的結合力不一致，標準物不易確定。,54,6.紫外分光光度法,蛋白質分子中的酪氨酸和色氨酸等

21、芳香族氨基酸可使蛋白質溶液在280nm處有一吸收峰?？捎糜跍y定蛋白質但需避免核酸干擾。 （1）Lowry-Kalcker 公式 蛋白質濃度（mg/ml）=1.45 A 280 - 0.74 A 260 （2）Warburg-Christian 公式 蛋白質濃度（mg/ml）=1.55 A 280 - 0.76 A 260,原理：,55,評價及應用：,優(yōu)點：敏感而簡便，可保留蛋白生物活性，常用與較純的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度計及石英比色皿。 缺點：各種蛋白質中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm測定易受游離色aa和酪aa以及尿酸和膽紅素的干擾；導致準確性和特異性受影響。 措施：在220

22、-225nm波長區(qū)域，用0.15mol/l的NaCl稀釋1000-2000倍可消除干擾。,56,7.折光測定法,溶解在溶液中的固體可增加溶液的光折射率，在固定波長和溫度下，光折射率和血清中蛋白質含量成正比。,原理：,評價及應用：,優(yōu)點：簡便、快速，易掌握，重復性較好，適合臨床急診，體檢篩查和胸腹水蛋白質測定。 缺點：準確性較差，易受高血脂癥，高膽紅素血癥以及溶血等因素影響，會由于A/G比值變化而產生誤差。,57,參考范圍：成人6080g/L,臨床意義：,總蛋白升高：,總蛋白降低：丟失過多 消耗增加 白蛋白合成減少 水腫,真性升高：多發(fā)性骨髓瘤(MM)、巨球蛋白血癥、 自身免疫性疾病等,假性升高

23、：機體明顯失水，總蛋白含量相對升高， A/G幾乎不變,58,（二）血清白蛋白測定,方法：,1.染料結合法( 推薦) 2.鹽析法 3.電泳法4.免疫化學法,59,1.染料結合法( 推薦),原理: 血清ALB可通過離子鍵或疏水鍵與包括染料在內的各種有機離子結合,而GLB很少結合外源性染料,可在不分離ALB與GLB的情況下直接測定ALB。,染料,BCG,BCP,優(yōu)點,缺點,易于和非人源性白蛋白結合 與白蛋白結合特異性較差,與非人源性白蛋白結合力弱 與白蛋白結合特異性好,在30秒內測可提高特異性,BCG:溴甲酚綠，BCP：溴甲酚紫,60,應用及評價:,嚴格控制反應時間的BCG法既適合手工也適合自動 化

24、分析。臨床上推薦使用。,61,原理: 鹽析是由于加入大量的中性鹽破壞了蛋白質的水化膜、中和其所帶的電荷從而使蛋白質分子聚集而沉淀析出。 各種蛋白質的親水性和帶電荷不同，故鹽析時所需鹽濃度與pH不同。GLB在生理pH下帶電荷及水化膜比ALB少，可被較低濃度中性鹽沉淀。,2.鹽析法,中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉等,62,應及評價:,操作繁瑣， 不宜自動化，基本不用,63,3.電泳法,操作：,醋纖膜電泳,染色,晾干,透明,光密度儀掃描,洗脫,比色,染色,分離,測得蛋白組分百分比,計算得出各種蛋白質含量,半定量,定量,64,評價及應用：,優(yōu)點：電泳特異性好，可了解血清蛋白質全貌,缺點：電泳技術繁瑣，不易自動

25、化；白蛋白與染料 親和力高會導致結果偏高,65,4.免疫化學法,原理及特點:,應用：特異性高,但成本較高,費時,生化檢驗用的不多.,66,參考范圍:成人3555g/L.,臨床意義：,白蛋白升高：,白蛋白降低：丟失過多 消耗增加 白蛋白合成減少 水腫 先天性ALB缺乏病,真性升高：未見,假性升高：機體明顯失水，或治療輸入過多白蛋白,67,（三）血清球蛋白測定,方法：,間接法:TP-ALB=GLB,直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸遠大于ALB中的色氨酸含量),色氨酸+乙醛酸 紫色化合物,H+,Hopkins-Cole反應:,參考范圍: 成人2030g/L. A/G：1.52.5,68,臨床意

26、義：,球蛋白升高：,球蛋白降低：合成減少、低或無-球蛋白血癥,真性升高（常見）：自身免疫性疾病、感染反 應、MM、巨球蛋白血癥。,假性升高（少見）：機體明顯失水。,69,二、尿液蛋白質測定 （一）尿液總蛋白的測定,來源：,來自血漿蛋白，主要是,來自腎臟與尿路的組織蛋白。,臨床應用：正常兒童40mg24h，成30mg130mg/24h ； 異常：蛋白尿。,檢測：用于泌尿系統(tǒng)疾病及一些全身性疾病的篩查、療效觀察，詳見腎臟功能檢驗。,70,三、腦脊液蛋白質測定,腦脊液蛋白質來源:,外源:經脈絡膜的毛細血管壁超濾生成的低 分子量蛋白質,占血清蛋白質1%以下,內源:由中樞神經系統(tǒng)合成,腦脊液特有的蛋 白質.,71,檢測方法:,1、濁度法：蛋白質+磺基水楊酸-硫酸鈉 沉淀 比濁（