1、注射用重組人促卵泡激素申報(bào)臨床研究資料 No. 13注射用重組人促卵泡激素制造及檢定暫行規(guī)程本品系由含有高效表達(dá)人促卵泡激素基因的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，分離和高度純化后凍干制成。含有維持其穩(wěn)定性作用的保護(hù)劑，不含防腐劑和抗生素。適應(yīng)癥為不排卵（包括多囊卵巢綜合癥PCOD）且對(duì)枸櫞酸克羅米酚治療無(wú)反應(yīng)的婦女。對(duì)于進(jìn)行超排卵期或輔助生育技術(shù)，如體外受精胚胎移植（IVF）、配子輸卵管內(nèi)移植（GIFT）和合子輸卵管內(nèi)移植（ZIFT）D的患者，本品可刺激多卵泡發(fā)育。1基本要求1.1設(shè)施與生產(chǎn)質(zhì)量管理按中國(guó)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范要求實(shí)施。1.2原料及輔料應(yīng)符合現(xiàn)行中華人民共和國(guó)藥典200

2、5版二部或中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的要求。未納入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于化學(xué)純。1.3生產(chǎn)用水生產(chǎn)用水源水應(yīng)符合飲用水標(biāo)準(zhǔn)，純化水及注射用水應(yīng)符合現(xiàn)行中華人民共和國(guó)藥典2005版二部標(biāo)準(zhǔn)。1.4生產(chǎn)用器具直接用于生產(chǎn)的金屬或玻璃等器具，應(yīng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格清洗及去熱原質(zhì)處理或滅菌處理。2制造2.1工程細(xì)胞2.1.1名稱及來(lái)源重組人促卵泡激素工程細(xì)胞系由帶有人促卵泡激素和鏈基因的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的CHO-K1細(xì)胞系。2.1.2 種子庫(kù)建立、傳代及保存從原始細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞傳代，擴(kuò)增后凍存于液氮中，作為主細(xì)胞庫(kù)；從主細(xì)胞庫(kù)傳代，擴(kuò)增后凍存于液氮中，建立工作細(xì)胞庫(kù)。每次傳代不超過(guò)批準(zhǔn)的代次。細(xì)胞系凍存于

3、液氮中，檢定合格后方可用于生產(chǎn)。2.1.3主細(xì)胞庫(kù)及工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞的檢定應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。2.1.3.1外源因子檢查細(xì)菌和真菌（附錄XII A）、支原體（附錄XII B）、病毒檢查（附錄XII C）。2.1.3.2細(xì)胞鑒別實(shí)驗(yàn)應(yīng)用同工酶分析、生物化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)標(biāo)記物等任一方法進(jìn)行鑒別，應(yīng)為典型CHO細(xì)胞。2.1.3.3重組人促卵泡激素表達(dá)量應(yīng)不低于原始細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞表達(dá)量。2.2原液2.2.1細(xì)胞的復(fù)蘇與擴(kuò)增從工作細(xì)胞庫(kù)來(lái)源的細(xì)胞復(fù)蘇后，于無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代和擴(kuò)增，供轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)罐接種用。2.2.2細(xì)胞培養(yǎng)液生產(chǎn)用培養(yǎng)液應(yīng)不含血清、

4、蛋白質(zhì)。2.2.3細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定。2.2.4分離純化收集的培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)超慮法進(jìn)行濃縮，經(jīng)多步色譜純化后得到高純度的重組人促卵泡激素，即為重組人促卵泡激素原液。除菌過(guò)濾后保存于適宜溫度，并規(guī)定其有效期。2.2.5原液檢定按照3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3半成品2.3.1配置與除菌原液加入適宜的穩(wěn)定劑，并用緩沖液稀釋。除菌過(guò)濾后即成半成品。2.3.2半成品檢定按照3.2項(xiàng)進(jìn)行。2.4成品2.4.1分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。2.4.2分裝及凍干應(yīng)符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。半成品應(yīng)及時(shí)分裝、冷凍，凍干的全過(guò)程中，制品的溫度應(yīng)不高于30

5、。2.4.3規(guī)格75IU/瓶。2.4.4包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3檢定3.1原液檢定3.1.1性狀應(yīng)為無(wú)色澄明液體3.1.2鑒別3.1.2.1在氧化亞基項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品一致。3.1.2.2在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品一致。3.1.2.3肽圖（至少每半年測(cè)定一次）取本品，照附錄1測(cè)定，肽圖譜應(yīng)與對(duì)照品一致。3.1.2.4 N末端氨基酸序列（至少每一年測(cè)定一次）：將本品烷基化處理，再經(jīng)HPLC分離純化得到a、b鏈后，通過(guò)Edman降解法測(cè)序，兩條鏈N末端15個(gè)氨基酸序列分別為：a鏈：A-P-D-V-Q-D-C-P-E-C-

6、T-L-Q-E-N，b鏈：N-S-C-E-L-T-X-I-T-I-A-I-E-K-E，其中X代表未測(cè)出氨基酸，可能有修飾？。3.1.3檢查3.1.3.1等電點(diǎn)取本品，照附錄2測(cè)定，等電點(diǎn)主區(qū)帶應(yīng)在3.5-5.5之間，供試品主區(qū)帶應(yīng)與對(duì)照品一致？。3.1.3.2解離亞基 取本品（1.0 mg/ml）50ul，加2非還原上樣緩沖液50ul，混勻即得供試品溶液；取上述供試品溶液10ul，加入190ul 1非還原上樣緩沖液，混勻后100加熱5分鐘，放冷即得對(duì)照溶液（供試品溶液5%）。依法（藥典2005版三部，附錄IV C，考馬斯亮藍(lán)法），用非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)，分離膠濃度為12.5%

7、，供試品溶液和對(duì)照溶液各取20ul；考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果。供試品中解離亞基條帶顯色應(yīng)不深于對(duì)照溶液中的解離亞基條帶（5%）。3.1.3.3氧化亞基 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2005年版三部，附錄III B）測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用Vydac Protein and Peptide C4柱（25cm4.6mm，5um，或同等產(chǎn)品），以0.1mol/L TEAP緩沖液（取85磷酸6.75ml，加水950ml，用三乙胺調(diào)pH值至6.000.05，加水至1000ml，0.45um濾膜濾過(guò)，放置24小時(shí)后使用）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，0.1%三氟乙酸的80乙腈溶液為流動(dòng)

8、相C（洗柱液）；流速為1.0ml/min；柱溫為40；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。梯度程序?yàn)椋簳r(shí)間（min）ABC0861405672280570010072001007386140取本品（0.5mg/ml）200l，加入1雙氧水溶液4l，反應(yīng)30分鐘即為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用樣品溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。相對(duì)亞基保留時(shí)間約為0.86的雜質(zhì)峰即為氧化亞基峰。 測(cè)定法：取本品（0.5mg/ml）？20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計(jì)算，氧化亞基含量不得高于總蛋白量的10%。3.1.3.4聚合體取本品原液濃度不定？（0.1mg/ml）？80l，加入5非還原樣品緩沖液20l，混勻

9、作為供試品溶液；取供試品溶液適量，用1非還原樣品緩沖液稀釋為供試品溶液的2%，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液與對(duì)照溶液各25l，依法檢查（藥典2005版三部，附錄IV C 銀染法），分離膠濃度為12.5。對(duì)照品條帶應(yīng)顯色，供試品中聚合物帶的顯色應(yīng)不深于對(duì)照品的主帶（2%）。3.1.3.5唾液酸含量精密配制濃度分別為0ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、120ug/ml、160ug/ml、200ug/ml的唾液酸對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線；取本品，依法測(cè)定（藥典2005版三部，附錄VI E），唾液酸含量應(yīng)為1.41-12.84%？范圍太大？。3.1.3.6紫外光譜掃描 取本品適量，用原液空白溶劑（1

10、0mM PB 0.1M NaCl）稀釋為200ug/ml，以空白溶劑為參比，在波長(zhǎng)230330nm范圍，依法（藥典2005版三部，附錄II A）檢查。最大吸收波長(zhǎng)應(yīng)在2763nm處。3.1.3.7宿主DNA殘留量 取本品，依法測(cè)定（藥典2005版三部，附錄IX B），每劑量重組人促卵泡激素應(yīng)不高于100pg。3.1.3.8 CHO細(xì)胞蛋白殘留取本品，照CHO宿主細(xì)胞蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒（Cygnus）方法測(cè)定，分別用樣品稀釋液稀釋至1mg/ml作為供試品溶液；取200ng/ml CHO宿主蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液50ul，并加入200ul供試品溶液，作為回收率實(shí)驗(yàn)溶液。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每1

11、mg重組人促卵泡激素中CHO宿主蛋白殘留不得過(guò)25ng。3.1.3.9鼠IgG殘留量測(cè)定取本品，依法測(cè)定（藥典2005版三部，附錄IX L），每劑量重組人促卵泡激素中鼠IgG殘留應(yīng)不高于10ng。3.1.3.10細(xì)菌內(nèi)毒素依法測(cè)定（藥典2005版三部，附錄XII E 凝膠限量試驗(yàn))，每1mg重組人促卵泡激素應(yīng)不高于10EU。3.1.4含量測(cè)定取重組人促卵泡激素對(duì)照品適量，用水制成每1ml含有0.1mg的溶液作為對(duì)照品溶液。照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2005版三部，附錄III B）測(cè)定。用TSK gel G-2000SWXL（30cm7.8mm I.D.）或其它相應(yīng)的色譜柱；以磷酸鹽緩沖液（取8

12、5% H3PO4 6.74ml，加水800ml，再加Na2SO4 14.2g，用50NaOH調(diào)pH至6.700.05，用水定溶為1000ml后抽濾）為流動(dòng)相；流速為1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。取對(duì)照品20l，注入液相色譜儀,記錄色譜圖，以人促卵泡激素峰計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不小于1000；另取供試品適量注入液相色譜儀,記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算，即得。3.1.5生物活性測(cè)定取本品依法檢定（中國(guó)藥典2005版二部，附錄XII M 卵泡刺激素生物測(cè)定法檢定），每1mg重組人促卵泡激素生物活性應(yīng)不低于9000IU。3.2半成品檢定3.2.1細(xì)菌內(nèi)毒素檢查依法（藥典2005版三部，附錄XII E

13、 凝膠限量試驗(yàn)）檢查，每6g？重組人促卵泡激素不得過(guò)2EU？3.2.2含量測(cè)定按照成品含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行，根據(jù)結(jié)果對(duì)半成品分裝體積進(jìn)行微調(diào)，保證成品蛋白含量。3.3成品檢定3.3.1性狀本品為白色疏松體。復(fù)溶后為無(wú)色澄明液體。3.3.2 鑒別試驗(yàn)3.3.2.1在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品峰的保留時(shí)間一致。3.3.2.2供試品、抗體如何配制？依法檢定（藥典2005版三部，附錄VIII B，免疫斑點(diǎn)法），應(yīng)符合規(guī)定？。3.3.3.檢查3.3.3.1復(fù)溶時(shí)間取本品，每支加注射用水0.5ml溶解，溶解時(shí)間不得過(guò)2分鐘。3.3.3.2不溶性微粒 取本品，用注射用水溶解后

14、，依法（中國(guó)藥典2005年版二部附錄IX C）檢查，每瓶中10mm以上的微粒不得過(guò)6000粒；25mm以上的微粒不得過(guò)600粒。3.3.3.3水分取本品，依法（藥典2005版三部，附錄VII D第一法 B 庫(kù)侖滴定法）檢查，含水分不得過(guò)3.0。3.3.3.4酸堿度取本品，每支加附帶注射用水？0.5ml溶解，依法（藥典2005版三部，附錄V A)）檢查，pH應(yīng)為6.57.5。3.3.4聚合體取本品，每瓶加入80l注射用水溶解，加入5非還原樣品緩沖液20l，混勻作為供試品溶液；取供試品溶液10l，加1非還原樣品緩沖液490l作為對(duì)照溶液。取供試品溶液與對(duì)照溶液各25l，依法檢查（藥典2005版三部

15、，附錄IV C 銀染法）對(duì)照溶液條帶應(yīng)顯色，供試品中聚合物帶的顯色應(yīng)不深于對(duì)照溶液的主帶顏色（2%）。3.3.5氧化亞基色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2005年版三部，附錄III B）測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用Vydac Protein and Peptide C4柱（25cm4.6mm，5um，或同等產(chǎn)品），以0.1mol/L TEAP緩沖液（取85磷酸6.75ml，加水950ml，用三乙胺調(diào)pH值至6.000.05，加水至1000ml，0.45um濾膜濾過(guò)，放置24小時(shí)后使用）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，0.1%三氟乙酸的80乙腈溶液為流動(dòng)相C（洗柱液）；流速

16、為1ml/min；柱溫為40；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。梯度程序?yàn)椋簳r(shí)間（min）ABC0861405672280570010072001007386140取本品（0.5mg/ml）?200l，加入1雙氧水溶液4l，反應(yīng)30分鐘即為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用樣品溶液，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。相對(duì)亞基保留時(shí)間約為0.86的雜質(zhì)峰即為氧化亞基峰。需確認(rèn)！ 測(cè)定法 取本品適量，每瓶加水100l溶解，合并，混勻作為供試品溶液，取供試品溶液200l注入液相色譜儀,記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計(jì)算，氧化亞基不得過(guò)10%。3.3.6含量測(cè)定取重組人促卵泡激素對(duì)照品適量，用水制成每1ml含有0.03mg的溶液作

17、為對(duì)照溶液。取本品，每瓶加水250l溶解作為供試品溶液，照高效液相色譜法（中國(guó)藥典2005版三部，附錄III B）測(cè)定。用TSK gel G-2000SWXL（30cm7.8mm I.D.）或其它相應(yīng)的色譜柱；以磷酸鹽緩沖液（取85% H3PO4 6.74ml，加水800ml，再加Na2SO4 14.2g，用50NaOH調(diào)pH至6.700.05，用水定溶為1000ml后抽濾）為流動(dòng)相；流速為1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm。分別取對(duì)照品和供試品100l，注入液相色譜儀,記錄色譜圖，以人促卵泡激素峰計(jì)，理論塔板數(shù)應(yīng)不小于1000；按外標(biāo)法計(jì)算，即得。重組人促卵泡激素含量應(yīng)為標(biāo)示量的90%

18、110%。3.3.7生物活性測(cè)定 取本品，供試品、標(biāo)準(zhǔn)品如何配制？依法（藥典2005版二部，附錄XII M 卵泡刺激素生物測(cè)定法檢定），重組人促卵泡激素的生物活性應(yīng)為標(biāo)示量的80%150%。 3.3.8無(wú)菌檢查取本品，用注射用水溶解，依法（藥典2005版三部，附錄XII A 膜過(guò)濾法）檢查，應(yīng)符合規(guī)定。3.3.9細(xì)菌內(nèi)毒素取本品，用注射用水溶解后，依法（藥典2005版三部，附錄XII E 凝膠限量試驗(yàn)）檢查，每支成品含細(xì)菌內(nèi)毒素不得過(guò)5EU。3.3.10異常毒性 取本品，用注射用水溶解，依法（藥典2005版三部，附錄VII F 小鼠實(shí)驗(yàn)法）檢查，應(yīng)符合規(guī)定。4保存、運(yùn)輸及有效期低于室溫下保存及

19、運(yùn)輸，有效期暫定2年。5使用說(shuō)明應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。6附錄6.1肽圖檢測(cè)方法6.1.1儀器及耗材恒溫水浴、磁力攪拌器、小型凍干機(jī)、氮?dú)馄俊⑴_(tái)式離心機(jī)、透析袋（3-10kd）、超濾離心管（5kd孔徑，4ml）、通風(fēng)櫥。6.1.2試劑和溶液6.1.2.1 鹽酸胍溶液（6mol/L）稱取鹽酸胍14.3g至25.0ml容量瓶，加水溶解并定容，即得。6.1.2.2 TE緩沖液（Tris，0.2mol/L；EDTA，1mmol/L，pH8.3）稱取Tris 1.2g，EDTA 18.6mg加40ml水溶解，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.3，移入50ml容量瓶，用水定容。6.1.2.3 還原及

20、酰化試劑鹽酸胍緩沖液：取鹽酸胍溶液1.2ml，TE緩沖液0.4ml，混勻即得（用前配制）。DTT溶液（9.0mg/ml）：稱取DTT約9mg，加入1.0ml鹽酸胍緩沖液，28保存。碘乙酸溶液（130mg/ml）：稱取碘乙酸65mg，加入0.5ml鹽酸胍緩沖液溶解，用鋁箔避光保存，氮?dú)獬浞夂蟠嬗?20。6.1.2.4 0.1% TFA溶液取100ul TFA，加入100ml水中，室溫1月。6.1.2.5 含0.1% TFA的45%乙腈溶液，28保存1月。6.1.2.6 V8蛋白酶緩沖液（Tris-HCl 50mM，pH7.8）稱取Tris 0.6g，溶于80ml水，2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至

21、7.8，定容至100ml，28保存1月。6.1.2.7 流動(dòng)相A：5%乙腈，0.1%TFA的水溶液。6.1.2.8 流動(dòng)相B：90%乙腈，0.1%TFA的水溶液。6.1.3 樣品溶液制備：6.1.3.1 對(duì)照品溶液制備：取果那芬對(duì)照品適量，用水透析后離心濃縮至濃度約為3mg/ml。6.1.3.2 供試品溶液制備：取原液，同法制備。6.1.4 去糖基化6.1.4.1 取對(duì)照品和供試品各150ul，加入20ul 10PNGaseF緩沖液，按照說(shuō)明書(shū)要求分別加入6ul SDS/b-巰基乙醇溶液和6ul NP-40溶液，混勻后加入5ulPNGaseF酶，30保溫24小時(shí)。6.1.4.2 100處理10

22、分鐘滅活糖苷酶。6.1.4.3 加水稀釋至4ml，用4ml超濾離心管離心除鹽，并縮小體積至200ul并干燥樣品。6.1.5 還原烷基化6.1.5.1 還原：將干燥樣品回溶于200ul鹽酸胍緩沖液中，加入100ul DTT溶液，氮?dú)饬魈幚?，封口?7反應(yīng)1小時(shí)。6.1.5.2 烷基化：在上述樣品管中加入20ul碘乙酸溶液，氮?dú)饬魈幚?，封口?7反應(yīng)1小時(shí)，加入300ul 0.1%TFA溶液終止反應(yīng)。再加入30ul b-巰基乙醇，通風(fēng)櫥內(nèi)操作,室溫反應(yīng)15min。6.1.5.3用水透析脫鹽后凍干樣品。6.1.6 V8蛋白酶切6.1.6.1 蛋白酶溶液制備：取酶適量，用水溶解制備為1mg/ml。6.

23、1.6.2 取凍干樣品，每管加入300ul蛋白酶緩沖液（Tris-HCl 50mM，pH7.8）回溶,加入15ul蛋白酶溶液，37反應(yīng)16小時(shí)。6.1.7 RP-HPLC分析色譜柱：C18，300、5mm、4.6250mm。色譜條件：波長(zhǎng)：214nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30，進(jìn)樣量：180ul/針。洗脫條件：T（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B(%)0 10003 100015 802045653560 40606101007001007110006.1.8觀察結(jié)果。6.2等電點(diǎn)測(cè)定6.2.1 主要儀器：Pharmacia平板電泳儀（或者同等產(chǎn)品）、電泳冷卻板、制膠模具。6.2.2

24、 主要試劑：丙烯酰胺、N甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過(guò)硫酸氨（AP）、TEMED、pI等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker、載體兩性電解質(zhì)pH310、甲基紅。6.2.3 溶液配制6.2.3.1 10%丙烯酰胺貯液稱取丙烯酰胺5.0g，甲叉雙丙烯酰胺0.15g，加水溶解，定容至50ml，濾紙過(guò)濾。6.2.3.2電極液陽(yáng)極液:1mol/L 磷酸溶液（取濃磷酸3.2ml，加水至50ml）；陰極液:1mol/L NaOH溶液。6.2.3.3 50%甘油稱取甘油50g加水混合均勻后定容至100ml。6.2.3.4 甲基紅指示劑稱取甲基紅0.1g，加入7.4ml NaOH(0.05mol/L)使之溶解

25、，加水定容至200ml。6.2.3.5 固定液（10%TCA）稱取三氯乙酸10g，加水溶解，用水定容至100ml。6.2.3.6 脫色液取甲醇25ml，乙酸5ml，加水至100ml。6.2.3.7 染色液稱取考馬氏亮藍(lán)R-250 0.1g，用脫色液定容至100ml6.2.3.8 0.025mol/L磷酸緩沖液pH7.0溶液A：Na2HPO412H2O18.81g，加水溶解并定溶于100ml。溶液B：檸檬酸鈉2H2O 2.39g，加水溶解并定溶于100ml。取溶液A 82.4ml，溶液B 17.6ml，混勻，取25ml加水至1000ml即得。6.2.4 操作步驟6.2.4.1凝膠制備：按照下表進(jìn)

26、行配制10%丙烯酰胺貯液2.5ml載體兩性電解質(zhì)0.35ml50%甘油0.5ml水1.25ml10%APS25mlTEMED6ml6.2.4.2樣品制備處理依具體情況而定，如果供試品和對(duì)照品溶液鹽濃度過(guò)高，應(yīng)先透析或過(guò)濾除鹽。樣品濃度制成0.52.0mg/ml。分別取供試品及對(duì)照品溶液各10ml，加入兩性電解質(zhì)2ml，加入甲基紅試液0.5ml。6.2.4.3 電泳6.2.4.3.1 點(diǎn)樣：將濾紙片剪成0.5cm0.5cm大小，排放在凝膠上，分別將樣品、對(duì)照品及等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液各10ml點(diǎn)在濾紙上。6.2.4.3.2預(yù)電泳：開(kāi)機(jī)預(yù)冷電泳槽冷卻板，在冷卻板中央滴加石蠟油，將載膠的支持膜鋪在油上，6預(yù)冷

27、30min；將電極條分別用陰、陽(yáng)極電極液充分濕潤(rùn)，吸去多余電極液后平行置于凝膠兩端。將電極壓在電極條上，200V 預(yù)電泳20min。6.2.4.3.3電泳：200V恒壓20min，然后根據(jù)情況調(diào)整電壓，直至電流不再降低為止。6.2.4.4 顯色膠片于固定液中固定3060min；于脫色液中平衡20min；于染色液中染色2060min。最后于脫色液中脫色至本底無(wú)色。6.2.5 觀察結(jié)果根據(jù)等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白判斷樣品等電點(diǎn)。二類嚴(yán)選#18長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司注射用重組人促卵泡激素制造及檢定規(guī)程起草說(shuō)明我公司研制生產(chǎn)的注射用重組人促卵泡激素（rhFSH），是利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞分泌型表達(dá)技術(shù)

28、，使目的蛋白直接分泌于培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)一系列的下游純化及凍干等工藝步驟和嚴(yán)格的質(zhì)量檢驗(yàn)而獲得的真核基因工程產(chǎn)品。為了獲得高質(zhì)量的基因工程重組人FSH產(chǎn)品，在制備和檢定過(guò)程中，我們按中華人民共和國(guó)藥典（2005版）和中國(guó)生物制品規(guī)程（2000版）對(duì)生物制品質(zhì)量控制要點(diǎn)的要求，結(jié)合連續(xù)中試生產(chǎn)的三批樣品（批號(hào)：20050701、20050702、20050703）的質(zhì)量研究結(jié)果，參照同類進(jìn)口產(chǎn)品果納芬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，起草了重組人促卵泡激素原液和成品的檢定規(guī)程，現(xiàn)說(shuō)明如下：1重組人促卵泡激素原液1.1性狀根據(jù)中試產(chǎn)品質(zhì)量研究結(jié)果，三批注射用重組人促卵泡激素原液均為無(wú)色澄清液體，無(wú)肉眼可見(jiàn)不溶物。由于本品為注

29、射劑，依據(jù)中華人民共和國(guó)藥典2005版二部對(duì)注射劑標(biāo)準(zhǔn)的要求，規(guī)定本品為無(wú)色澄清液體，不得含有肉眼可見(jiàn)不溶物。1.2鑒別本產(chǎn)品含量和氧化亞基項(xiàng)目的檢查都采用了HPLC的方法，在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)將待測(cè)樣品與對(duì)照品保留時(shí)間的對(duì)比，清晰的反應(yīng)出了蛋白質(zhì)的性質(zhì)，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行了可靠的鑒別，三批注射用重組人促卵泡激素原液的主峰保留時(shí)間與對(duì)照品主峰保留時(shí)間均一致1.3肽圖為了確證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的正確性，我們規(guī)定至少每半年進(jìn)行一次產(chǎn)品的肽圖譜分析。由于重組人促卵泡激素是一種真核細(xì)胞為宿主表達(dá)的經(jīng)糖基化修飾的蛋白，我們通過(guò)糖酶和TPCK處理的胰蛋白酶先后作用待測(cè)樣品和對(duì)照品，將其蛋白鏈分解成若干肽段，然后利用RPHP

30、LC進(jìn)行了有效地分離，結(jié)果表明三批注射用重組人促卵泡激素原液肽圖譜與果納芬？對(duì)照品完全一致。1.4 等電點(diǎn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道（1），重組人促卵泡激素的等電點(diǎn)主區(qū)帶應(yīng)在4.0-5.2之間。而在我們建立的等電聚焦電泳系統(tǒng)結(jié)果分析表明，三批注射用重組人促卵泡激素原液與果納芬對(duì)照品的主區(qū)帶分布一致，均在3.5-5.5之間1.5 N末端氨基酸序列為了確證產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的正確性，我們規(guī)定至少每年測(cè)定一次產(chǎn)品的N末端15個(gè)氨基酸序列。將本品烷基化處理，再經(jīng)HPLC分離純化得到a、b鏈后，通過(guò)Edman降解法測(cè)序，兩條鏈N末端15個(gè)氨基酸序列分別為：a鏈：A-P-D-V-Q-D-C-P-E-C-T-L-Q-E-N，b鏈：

31、N-S-C-E-L-T-X-I-T-I-A-I-E-K-E，其中X代表未測(cè)出氨基酸，可能有修飾。這與文獻(xiàn)報(bào)道的理論序列是相同的1.6解離亞基依法（藥典2005版三部，附錄IV C，考馬斯亮藍(lán)法），用非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像儀掃描記錄結(jié)果，同法參考果納芬的檢定標(biāo)準(zhǔn)，將解離亞基的含量定為小于5。1.7氧化亞基重組人促卵泡激素的氨基酸結(jié)構(gòu)中含有六個(gè)甲硫氨酸殘基，容易受到氧化，產(chǎn)生無(wú)活性的氧化產(chǎn)物。實(shí)測(cè)三批原液氧化亞基的含量都在15之間，我們參考果納芬對(duì)此項(xiàng)的要求為不得高于總蛋白量的10%，所以起草標(biāo)準(zhǔn)同果納芬進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。1.8聚合體重組人促卵泡激素由兩條鏈以

32、非共價(jià)連接的形式構(gòu)成，很容易形成高分子聚合物。我們參考果納芬對(duì)此項(xiàng)的檢定方法，結(jié)合三批原液高分子含量檢定結(jié)果，將聚合體含量的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為不得高于總蛋白量的2%。1.9唾液酸含量根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，重組人促卵泡激素唾液酸含量能夠直接的反應(yīng)其糖基化修飾的程度，而糖基化修飾又與蛋白的活性密切相關(guān)。我們建立了C18 RP-HPLC分析唾液酸含量的方法，對(duì)三批原液進(jìn)行的檢定，結(jié)果分別為：7.717、7.824、7.679，所以將重組人促卵泡激素原液唾液酸含量規(guī)定為515%1.10紫外光譜掃描依法（藥典2005版三部，附錄II A）檢查, 重組人促卵泡激素三批原液與果納芬對(duì)照品的吸收譜圖一致，最大吸收波長(zhǎng)應(yīng)在27

33、63nm處。1.11宿主DNA殘留量依法（藥典2005版三部，附錄IX B）測(cè)定，三批重組人促卵泡激素每劑量重組人促卵泡激素應(yīng)不高于100pg。1.12 CHO細(xì)胞蛋白殘留照CHO宿主細(xì)胞蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒（Cygnus）方法測(cè)定，三批重組人促卵泡激素原液的殘留量值分別為：1.650ng/mg、1.114ng/mg、1.194ng/mg。所以規(guī)定每mg重組人促卵泡激素中CHO宿主蛋白殘留不得過(guò)25ng。1.13鼠IgG殘留量測(cè)定本產(chǎn)品的生產(chǎn)純化工藝中，有針對(duì)重組人促卵泡激素的單克隆抗體親和層析，所以產(chǎn)品中不可避免會(huì)有一些鼠源IgG殘留。依法（藥典2005版三部，附錄IX L）測(cè)定，三批重

34、組人促卵泡激素原液的鼠源IgG殘留量分別為0.602 ng/劑量、0.750 ng/劑量、0.869ng/劑量，所以規(guī)定每劑量重組人促卵泡激素應(yīng)不高于10ng。1.14細(xì)菌內(nèi)毒素依法（藥典2005版三部，附錄XII E 凝膠限量試驗(yàn)) 測(cè)定，三批重組人促卵泡激素原液的細(xì)菌內(nèi)毒素都小于5EU/mg，所以規(guī)定每1mg重組人促卵泡激素應(yīng)不高于10EU。1.15比活測(cè)定參考果納芬的含量檢測(cè)方法進(jìn)行定量，按照藥典2005版二部，附錄XII M 卵泡刺激素生物測(cè)定法檢定生物活性，三批重組人促卵泡激素原液的比活性都在1200013000IU/mg之間，所以規(guī)定每1mg重組人促卵泡激素生物活性應(yīng)不低于9000IU10000IU/mg？2.注射用重組人促卵泡激素2.1鑒別試驗(yàn)結(jié)合含量檢定項(xiàng)下保留時(shí)間與免疫學(xué)性質(zhì)分析，提供了穩(wěn)定可靠的鑒別實(shí)驗(yàn)方法，三批重組人促卵泡激素成品與果納芬的SEC-HPLC保留時(shí)間一致，而且免疫斑點(diǎn)法結(jié)果都呈陽(yáng)性。2.2檢查2.2.1外觀隨機(jī)抽取三批重組人促卵泡激素成品觀察，外觀都為白色凍疏松體，且復(fù)溶后都為無(wú)色澄明液體。2.2.2復(fù)溶時(shí)間隨機(jī)抽