1、,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)。 通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因為生物產(chǎn)品都是從細(xì)胞得來，所以細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。,什么是細(xì)胞培養(yǎng)？,主要內(nèi)容,實驗設(shè)備 試劑及耗材 清洗及滅菌 細(xì)胞培養(yǎng) （細(xì)胞生長過程，細(xì)胞來源，細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存，細(xì)胞計數(shù)，活力測定，細(xì)胞污染）,一實驗設(shè)備,超凈工作臺，生物安全柜 CO2培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 離心機(jī) 電熱恒溫水槽 液氮罐 純水儀 壓力蒸汽消毒器 電熱干燥箱,超凈臺 生物安全柜,酒精燈（），離開要熄滅 ！ 酒精燈（）,CO2培養(yǎng)箱,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37，5CO2 。,倒置顯微鏡,離心機(jī),電熱恒溫水槽,液氮

2、：-196 ,液氮罐,配平,純水儀 壓力蒸汽滅菌器 電熱干燥箱,由工作人員操作，注意安全！,小結(jié)一實驗設(shè)備及功能,超凈工作臺，生物安全柜-操作平臺 CO2培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的空間 倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞 離心機(jī)-離心收集細(xì)胞 電熱恒溫水槽-加熱 液氮罐-凍存細(xì)胞 純水儀-制備一級水 壓力蒸汽消毒器-滅菌 電熱干燥箱 -烘干器皿,（酒精燈安全）,二試劑及耗材,培養(yǎng)基 緩沖液 消化液 血清 其他,耗材,培養(yǎng)基,供給細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。 成分及作用： 氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位 碳水化合物：能量來源 無機(jī)鹽：幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡 維生素：維持細(xì)胞生長的

3、生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用,培養(yǎng)基分類,DMEM（高糖，葡萄糖4500 mg/L ）：成纖維、上皮細(xì)胞（293），一些實體瘤（Panc-1），原代神經(jīng)元 DMEM（低糖，葡萄糖1000 mg/L ）：間充質(zhì)干細(xì)胞，單抗細(xì)胞融合 RPMI 1640： 血液細(xì)胞（HL60）、一些實體瘤細(xì)胞（BT474）,酚紅：PH指示劑（黃色過酸、紫色過堿）； 酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素），涉及到激素和誘導(dǎo)的實驗，建議選用無酚紅培養(yǎng)基。,ATCC,/,美國模式培養(yǎng)物集存庫,緩沖液（洗滌細(xì)胞）,PBS：磷酸緩沖鹽溶液具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液

4、（常規(guī)實驗皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl） D-PBS：杜氏磷酸緩沖液，磷酸鹽含量稍低，含有鈣鎂離子，用于胚胎學(xué)方面的研究。 Hanks：平衡鹽溶液無機(jī)鹽和葡萄糖濃度接近大部分動植物細(xì)胞的水平，可作為動植物細(xì)胞短期培養(yǎng)(幾個小時)。 D-Hanks：不含鈣離子、鎂離子、葡萄糖（使用消化液時） 。,消化液,胰蛋白酶溶液 使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解、細(xì)胞離散。使用濃度0.25%。 配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清（對胰酶產(chǎn)生抑制作 用）的平衡鹽溶液（如PBS、D-Hanks）。 EDTA溶液 一般用其鈉鹽，可溶性較好。有些組織需要Ca2+、Mg2+來保持其完整性，EDTA

5、可以螯合這些離子，可使細(xì)胞之間裂解。其作用比胰蛋白酶緩和。使用濃度為0.02%，以無鈣、鎂的平衡鹽溶液配制 。 膠原酶溶液 主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分（用胰蛋白酶效果較差），使用Hanks溶液配置，常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）。,提供基本營養(yǎng)物質(zhì)、激素和各種生長因子、提供結(jié)合蛋白、提供促接觸和伸展因子使細(xì)胞貼壁免受機(jī)械損傷、對培養(yǎng)中的細(xì)胞的起到某些保護(hù)作用。 保存血清最好的方法？ 建議血清保存在-20。解凍后存放于4時，請勿超過一個月。 （分裝） 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損? 建議從冷凍箱取出后，置于28冰箱使之緩慢解凍、融解。使用時，必須將解凍的血清充分混勻

6、，并且勿將血清置于37太久。,血清,青霉素-鏈霉素溶液,青霉素的工作濃度為100 U/ml， 鏈霉素的工作濃度為0.1 mg/ml。 分別阻止細(xì)菌細(xì)胞壁合成及細(xì)菌蛋白質(zhì)的組成，達(dá)到抑制細(xì)菌生長的作用，防止污染，對真菌和支原體無效。 其他實驗所需的試劑： 藥物（如ATRA）、檢測試劑（如MTT）、細(xì)胞因子（如SCF）等,試劑標(biāo)注規(guī)范,試劑名稱 NaCl 配制濃度 0.5 mM 配制人 張三 配制日期 2016.10.21,耗材,培養(yǎng)皿、瓶、孔板 離心管、移液管 槍尖 其他,小結(jié)二試劑及耗材的分類及用途,培養(yǎng)基（成分、分類） 緩沖液 （PBS、Hanks等） 消化液（分類及應(yīng)用） 血清（作用、存儲

7、及解凍方法） 試劑標(biāo)簽要規(guī)范,耗材（分類、用途）,在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長 微生物產(chǎn)品附帶雜物 上次細(xì)胞殘留物 非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì) 需要清洗的培養(yǎng)用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 （包括：浸泡（潔消精）、超聲波清洗、沖洗、烘干四個步驟）,三清洗及滅菌,消毒滅菌方法,物理消毒滅菌法 Co60輻射（射線）：破壞生物大分子（塑料制品） 紫外線（200-300 nm）：30min，阻止細(xì)菌、病毒核酸合成。（細(xì)胞室：用于空氣，操作臺表面等） 濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121，20min，破壞微生物孢子、蛋白變性。（用于大量液體、玻璃器皿、部分塑料

8、耗材、手術(shù)器械等，由工作人員操作） 干熱：160, 2 小時，高熱作用下的氧化作用破壞微生物（耐高溫的玻璃和金屬制品） 過濾：0.22m濾膜過濾除菌（少量試劑）,消毒滅菌方法,化學(xué)消毒滅菌法 75%酒精 主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理（蛋白凝固）（不能擦拭有機(jī)玻璃） 1新潔爾滅 主要用于器械的浸泡，皮膚和操作室壁面的擦試消毒（陽離子表面活性劑，能破壞細(xì)胞膜，改變其通透性而起殺菌作用）,需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。 清洗的步驟 滅菌的方法： -紫外線（超凈臺、生物安全柜） -高壓蒸汽滅菌（準(zhǔn)備好放在準(zhǔn)備室502） -75%酒精（表面消毒，小心酒精燈明火

9、）,小結(jié)三清洗及滅菌,四細(xì)胞培養(yǎng),生長類型 細(xì)胞來源 細(xì)胞復(fù)蘇 細(xì)胞傳代,細(xì)胞凍存 細(xì)胞計數(shù) 活力測定 污染種類,細(xì)胞的生長類型,粘附型細(xì)胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。（絕大多數(shù)正常細(xì)胞及實體瘤細(xì)胞） 懸浮型細(xì)胞：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。（主要是白血病細(xì)胞等）,小鼠單核巨噬細(xì)胞,白血病細(xì)胞,細(xì)胞貼壁過程,每代貼壁細(xì)胞的生長過程,游離期（接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞體圓球形） 貼壁期（細(xì)胞平均在10分鐘4小時貼壁，底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等） 潛伏期（有生長活動，而無細(xì)胞分裂，一般為624小時 對數(shù)生長期（細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍

10、增長，活力最佳。 最適合進(jìn)行實驗研究） 停止期（平臺期）（細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性） （懸浮細(xì)胞沒有貼壁過程）,國內(nèi)可以買到細(xì)胞株的地方有哪些？ ATCC（美國模式培養(yǎng)物集存庫）國內(nèi)代理 ECACC（歐洲細(xì)胞株、微生物保藏中心）國內(nèi)代理、sigma 中國科學(xué)院細(xì)胞研究所 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院（協(xié)和醫(yī)科大學(xué)）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 武漢大學(xué)冷藏中心等,細(xì)胞來源,確定細(xì)胞株的培養(yǎng)信息（ATCC） 配制培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+雙抗）、胰酶、PBS 無菌培養(yǎng)瓶、吸管、離心管的準(zhǔn)備,準(zhǔn)備工作,細(xì)胞復(fù)蘇（快融）,（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37水浴中，使其融化（1

11、分鐘左右）。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。 （2）用培養(yǎng)液稀釋后低速離心10分鐘。 （3）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。 （4）隔天換液，但貼壁細(xì)胞若未貼壁則勿需處理。,復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶而損傷細(xì)胞。,細(xì)胞傳代,細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，就必須進(jìn)行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。,細(xì)胞傳代,1 懸浮細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶底時，將

12、上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 2 半貼壁細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。,離心 新鮮培養(yǎng)基懸浮 鋪板,細(xì)胞傳代,3 貼壁細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的0.25的胰酶。 吸掉上清，加入PBS緩沖液洗滌，棄掉洗液，加入適量胰酶消化液，37消化1分鐘左右，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，并離心去上清，重新稀釋后接種。 注意： 開放式操作，小心謹(jǐn)慎、謹(jǐn)防污染！,細(xì)胞凍存（慢凍）,1 細(xì)胞凍存液（1ml/管） 基礎(chǔ)培養(yǎng)基70 胎牛血清20 DMSO 10 （二甲基亞砜，一種滲透性保護(hù)劑，

13、可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶對細(xì)胞的損傷。） 2 細(xì)胞欲冷凍保存時， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1-8x106 cells/ml,緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。,細(xì)胞凍存,3 慢凍程序 傳統(tǒng)方法：4 10分鐘 -20 30 分鐘 -80 1618 小時（或過夜）液氮長期保存。 程序降溫盒：利用異丙醇實現(xiàn)梯度降溫（易揮發(fā)，并且易吸收空氣中的水分，冷凍過程中可以輔助實現(xiàn)緩慢降溫，每十分鐘降一度）。,細(xì)胞凍存,小結(jié)四 細(xì)胞培養(yǎng)過程,細(xì)胞生長類型及傳代方法

14、細(xì)胞培養(yǎng)過程 注意無菌操作（全程）,細(xì)胞信息、 方法 凍存液成分、 培養(yǎng)基、耗材 程序,細(xì)胞計數(shù),血細(xì)胞計數(shù)器：手工計數(shù)細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù),計算公式：細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4稀釋倍數(shù) 104,細(xì)胞計數(shù),注意事項 記上不記下，記左不記右。 吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡。 鏡下偶見由兩個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個細(xì)胞計算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。,培養(yǎng)細(xì)胞活力測定,細(xì)胞活力測定是體外實驗研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。,培養(yǎng)細(xì)胞活力測定

15、,1 細(xì)胞克隆形成率實驗單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力。 克隆形成率（克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)）100% 優(yōu)點：精確、可靠，適于貼壁細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞活力測定,2 臺盼藍(lán)法（0.4%） 細(xì)胞損傷或死亡時，臺盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，與解體的DNA 結(jié)合，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。故活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。 用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活性。,培養(yǎng)細(xì)胞活力測定,3 四唑鹽（MTT）比色法 四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。 原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)

16、胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值。 MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。,細(xì)胞培養(yǎng)的污染類型,細(xì)菌污染 真菌污染 支原體污染 病毒污染 非同種細(xì)胞污染 化學(xué)污染,細(xì)菌污染,小鼠胃癌細(xì)胞的球菌感染,念珠菌污染,真菌污染,絲狀菌污染,真菌污染,典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團(tuán)塊或白點，鏡下呈絲狀。400倍圖片,支原體污染,支原體污染電鏡照片(X30k)，煎蛋狀和其他形狀,細(xì)菌和真菌污染多發(fā)生在傳代、換液、加樣等開放性操作之后。原代操作尤其注意

17、！因此，細(xì)胞培養(yǎng)切記： “無菌”理念貫穿始終，包括：器皿、器械、耗材、培養(yǎng)基、試劑、操作習(xí)慣。（一旦污染、立即棄用?。?如何避免污染？,細(xì)節(jié)決定成?。?小結(jié)五 實驗方法,細(xì)胞計數(shù)的方法 細(xì)胞活力測定的方法分類、原理及應(yīng)用 注意防止細(xì)胞污染,總結(jié),細(xì)胞實驗所需設(shè)備的類型及功能 試劑及耗材的分類及各自用途 清洗物品的過程及滅菌的方法 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞生長過程，細(xì)胞來源 細(xì)胞培養(yǎng)過程（復(fù)蘇、傳代及凍存） 細(xì)胞計數(shù)及活力測定方法 注意無菌操作，防止細(xì)胞污染,實驗中心細(xì)胞培養(yǎng)室規(guī)章制度,細(xì)胞實驗室是進(jìn)行各種細(xì)胞培養(yǎng)的凈化實驗室，研究人員經(jīng)申請準(zhǔn)入、培訓(xùn)合格后方可進(jìn)入細(xì)胞室；所有人員必須遵守實驗室規(guī)章制度，接受工作人員的管理。 進(jìn)入細(xì)胞室前必須穿工作服、換鞋，非實驗物品不得帶入室內(nèi)。嚴(yán)禁帶入易燃、易爆及其他有毒、有害或有刺激氣味的物品。注意消防安全，杜絕一切可能導(dǎo)致火災(zāi)的行為。 不得在細(xì)胞室內(nèi)進(jìn)行病原性微生物等易傳染物的操作；進(jìn)行病毒感染細(xì)胞的操作須報管理人員備案，在指定的生物安全柜內(nèi)（8室）進(jìn)行，使用一次性耗材，并遵守生物安全操作規(guī)范。 實驗室公用物品在使用后必須放回原處，不得外借或帶到其它實驗室；不得擅自更改儀器程序；儀器發(fā)生異常時，應(yīng)立即向管理人員報告。若因不按操作