1、大腸菌群測(cè)定,小組成員：蔡川川 金思利 杜夢(mèng)嬌 葉岳成 鄭文龍,依據(jù)GB47893-2010，討論若進(jìn)行食品中大腸菌群的測(cè)定，需準(zhǔn)備好哪些材料，且如何進(jìn)行測(cè)定？,討論的問題,大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。 大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。 大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會(huì)

2、有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測(cè)該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對(duì)人體健康具有潛在的危險(xiǎn)性。,大腸菌群的概述,食品中查出大腸菌群超標(biāo),由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。因此大腸菌群的檢測(cè)一般都是按照它的定義進(jìn)行。 中國采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測(cè)方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測(cè)程序上略有不同。 國家標(biāo)準(zhǔn) 國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀

3、釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，361培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。 證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管361培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。 報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN最大可能數(shù)表，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。具體操作參見GB4789.394 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測(cè)定,檢驗(yàn)方法,原國家商檢局制定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 原國家商檢局制定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對(duì)出口食品中的大腸桿

4、菌進(jìn)行檢測(cè)。 推測(cè)試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報(bào)告1mL(g)樣品中大腸菌群的MPN值。 具體操作參見 SN016992 中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法,檢驗(yàn)流程,大腸菌群的測(cè)定的原理,大腸菌群之一群能在37經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生氣體，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量

5、，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時(shí)間結(jié)指出食品是否有腸道致病菌污染的可能。 三步法：（1）發(fā)酵乳糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸發(fā)酵試驗(yàn)；（2）初發(fā)酵陽性管通過伊紅美蘭平板進(jìn)行分離；（3）復(fù)發(fā)酵對(duì)分離菌做證實(shí)實(shí)驗(yàn)。 食品中大腸菌群數(shù)系以每100g（或100ml）檢樣內(nèi)大腸菌群最近數(shù)(themostprobablenumber簡稱MPN)表示。最近數(shù)MPN法是一種將樣品“多次（管）稀釋至無菌”的計(jì)數(shù)方法。將3個(gè)稀釋梯度的待檢驗(yàn)樣品稀釋液接種于9支或15支試管培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋梯度試液接種3或5支。經(jīng)過培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN檢索表，就可以得到原樣品中微生物的估計(jì)數(shù)量。MPN檢測(cè)方法尤其適用于

6、帶菌量、其他方法不能檢測(cè)的食品，如水、乳制品及其其他食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。,材料,3.1食品樣品：乳、肉、果汁、糕點(diǎn)、發(fā)酵調(diào)味品及其他食品。 3.2菌種陽性對(duì)照菌 大腸桿菌 3.3除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、 均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計(jì)數(shù)器等。 3.4培養(yǎng)基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯、 煌綠乳糖膽鹽（BGLB ）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ) 、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH ) 、 1mol/L 鹽酸（HCI ) 。,第一法大腸菌群MP

7、N 計(jì)數(shù)操作步驟6.1、樣品的稀釋6.1.1、 固體和半固體樣品：稱取25g 樣品，放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 00or/min-10 000r/min 均質(zhì)1 min-2 min ，或放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的樣品勻液。6.1.2、 液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品，置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10 的樣品勻液。6.1.3、 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.5-7.5 之間，必要時(shí)分別用1mol/L

8、 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸（HCI ）調(diào)節(jié)。6.1.4、 用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1ml，沿管壁緩緩注人9ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1ml無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。,6.1.5、 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10 倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1ml無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。6.2、 初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選

9、擇原液），每個(gè)稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1ml（如接種量超過1ml，則用雙料LST肉湯）, 361 培養(yǎng)24hZh ，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h 。記錄在24h 和48h 內(nèi)產(chǎn)氣的LST 肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。6.3、 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從所有48h2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB）肉湯管中，361 培養(yǎng)48h2h ，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽性管。6.4、 大腸菌群最可能數(shù)（MPN ）的報(bào)告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN 表（見附錄

10、B ) ，報(bào)告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN 值。,第二法大腸菌群平板計(jì)數(shù) 8、 操作步驟8.1、 樣品的稀釋按6.1 進(jìn)行。8.2、 平板計(jì)數(shù)8.2.1、 選取2 個(gè)3 個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)無菌平皿，每皿1ml。同時(shí)分別取1ml生理鹽水加人兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。8.2.2、 及時(shí)將15 mL-20ml冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）約傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36l 培養(yǎng)18h-24h 。8.3、 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30-150 之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。8.4、 證實(shí)試驗(yàn)從VRBA 平板上