1、抗氧化活性研究方法,以酶標(biāo)法清除DPPH自由基為主,1,業(yè)界薈萃,目錄,一.檢測(cè)抗氧化活性的原因 二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性 三.檢測(cè)方法 四.DPPH法（原理，一般方法，酶標(biāo)法） 五.ABTS法 六.TBARS法 七.鐵離子還原能力(FRAP),2,一.檢測(cè)抗氧化活性的原因,1.天然植物中許多化學(xué)物質(zhì)具有抗氧化活性 2.抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來(lái)越受到人們關(guān)注 3.據(jù)文獻(xiàn)記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性 4.抗氧化活性測(cè)試簡(jiǎn)單，快捷，經(jīng)濟(jì),3,二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性,抗氧化劑,自由基對(duì)人體造成的傷害,天然植物,4,三.檢測(cè)方法,目前常用的抗氧化活性檢測(cè)方法主要基于以下機(jī)

2、理： (1)在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中脂類物質(zhì)的氧化抑制能力反映被測(cè)物的抗氧化活性；（TBARS法） (2)在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中自由基的清除能力反映被測(cè)物的抗氧化活性；（DPPH自由基的清除） (3)在特定條件下，測(cè)定樣品的還原能力反映被測(cè)物的抗氧化活性。（還原Fe3+）,5,四.DPPH法,1.原理 DPPH(二苯代苦味?；杂苫? 是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基。 特點(diǎn)：醇溶液呈紫色，波長(zhǎng)為517nm下具有最大吸收。 具有單一電子，故能接受一個(gè)電子或氫離子，有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長(zhǎng)處的吸光值下降,吸光度水平的降低表明抗氧化性的

3、增加，從而以評(píng)價(jià)試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率來(lái)表示，抑制率越大，抗氧化性越強(qiáng)。,6,實(shí)驗(yàn)步驟,2.實(shí)驗(yàn)步驟 （1）酶標(biāo)法檢測(cè)酶標(biāo)儀 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，各孔分別加入150molL- 1的DPPH溶液180L,各濃度梯度樣品溶液20L,終濃度分別為3.9 500molL- 1，反應(yīng)總體積200L,以溶劑作對(duì)照。加樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別在10120min時(shí)間范圍內(nèi)于517nm處測(cè)定各孔吸光度值。觀察樣品抗DPPH的時(shí)效量效變化過(guò)程，確定實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和最佳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間。 計(jì)算公式為:清除率()=A(溶劑)- A(樣品)/A（溶劑）x100,7,VitE清除D

4、PPH自由基抗氧化量效曲線,10-120min內(nèi),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)VitE抗DPPH作用增強(qiáng)，但在3.9- 31.2molL- 1范圍內(nèi)，各時(shí)間點(diǎn)的藥效變化不明顯，62.5-500molL-1濃度范圍，隨著濃度增加，各時(shí)間點(diǎn)的藥物作用曲線逐漸分離，并在500molL-1，各時(shí)間點(diǎn)量效趨于平穩(wěn)。從圖中可以看出，在這些時(shí)間點(diǎn)中，30min的量效曲線基本呈斜線上升。,30min,8,VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線,反應(yīng)時(shí)間t為30min的量效曲線,（相關(guān)系數(shù)）,9,實(shí)驗(yàn)步驟,（2）一般方法紫外分光光度計(jì)法 將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL樣品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液(

5、0.06 mmol/L)，混合30min后測(cè)定515 nm處吸光度。每份樣品平行操作3次。 計(jì)算公式為:清除率()=A(溶劑)- A(樣品)/A（溶劑）x100,10,酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì),3.酶標(biāo)法優(yōu)勢(shì) 抗氧化微孔板實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)勢(shì)：耗材量少，試劑量以微升計(jì)；試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；方法簡(jiǎn)便，耗時(shí)短；可重復(fù)性強(qiáng)，可以廣泛應(yīng)用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。,11,五.ABTS法,1.原理 以水溶性的ABTS+自由基引發(fā)劑為顯色劑。 特點(diǎn)：ABTS與過(guò)硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)/綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+，最大吸光波長(zhǎng)為734nm。 向ABTS+其中加入被測(cè)物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，

6、則該物質(zhì)會(huì)與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，然后在ABTS+這種自由基的734nm吸光波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度的變化來(lái)反映物質(zhì)的抗氧化能力。,12,實(shí)驗(yàn)步驟,2.實(shí)驗(yàn)步驟 將樣品用甲醇配制成一系列濃度,取0.15mL樣品加入2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min后,在734nm處測(cè)定吸光度。每份樣品平行操作3次。 計(jì)算公式為：清除率()=A(溶劑)- A(樣品) /A（溶劑） 100 A（溶劑）為2.85 mLABTS溶液與0.15mL甲醇混合后的吸度，A（樣品）為2.85mLABTS溶液與0.15mL樣品混合后的吸光度。,13,ABTS法優(yōu)缺點(diǎn),3.優(yōu)缺點(diǎn) 簡(jiǎn)便，快速，適合于大量

7、樣品的檢測(cè)。 ABTS在與氫原子供體的反應(yīng)中選擇性差是此法的一個(gè)不足，它可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng)，這與它們的實(shí)際抗氧化能力關(guān)，因此,TEAC值也包括對(duì)抗氧化不起作用的羥基。,14,六.TBARS法,簡(jiǎn)介 脂質(zhì)體系中氧化反應(yīng)抑制或中止的判斷主要通過(guò)測(cè)量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。因此，反應(yīng)物(不飽和脂肪酸，自由基等)的消失，氧化產(chǎn)物的定量可能是判斷氧化階段的最合適方法。通過(guò)直接或者間接檢測(cè)氧的消失和自由基的電子自旋光譜，適用于氧化過(guò)程的初始階段。通常采用TBARS法來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)的過(guò)氧化.,15,七.鐵離子還原能力(FRAP),原理 FRAP的原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法。在酸性條件下，F(xiàn)e3+一TPTA(Fe3+三吡啶三嗪)被抗氧化劑還原成Fe2