1、LOGO基因工程的基本技術(shù)主要有：LOGODNA/RNA提取技術(shù)電泳技術(shù)PCR技術(shù)分子雜交DNA序列分析基因突變技術(shù)等DNA和RNA的提取和純化LOGO一、DNA提取的基本原理和方法(一)DNA提取的基本原理1.DNA的性質(zhì)DNA是極性化合物，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑， DNA水溶液呈黏性膠體狀。在酸性溶液中易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。LOGO2.DNA提取的基本步驟(1)細(xì)胞裂解和DNA的溶解主要任務(wù)：破碎細(xì)胞并對(duì)DNA快速實(shí)施保護(hù)：利用液氮在超低溫下研磨，使酶失活；快速加入緩沖液并迅速混勻；LOGO(2)與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)及RNA等雜質(zhì)的去除。去除蛋白質(zhì)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB

2、)十二烷基硫酸鈉(SDS)或二甲苯酸鈉苯酚氯仿去除RNA可加入不含DNA酶的RNA酶LOGO(二)DNA提取的幾種方法1. 濃鹽法2. SDS法3. CTAB法4. 苯酚抽提法5. 水抽提法LOGO(三)質(zhì)粒的提取其中質(zhì)粒DNA的提取最常用的是堿抽提法。有時(shí)候也用煮沸法。LOGO（一）堿抽提法提取質(zhì)粒DNA變性強(qiáng)堿DNA雙鏈DNA單鏈中性復(fù)性閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會(huì)分離，復(fù)性快；LOGO1、原理染色體線性DNA和有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。變性LOGO（二）煮沸法提取質(zhì)粒原理：細(xì)胞壁、膜一經(jīng)破損后，

3、立即在100度煮沸40s，使L-DNA和cccDNA變性，然后迅速恢復(fù)中性，前者不復(fù)性，后者復(fù)性，離心去掉L-DNA、RNA、蛋白質(zhì)等大分子復(fù)合物，提純ccc。LOGO二、RNA提取的基本原理與方法LOGO自學(xué)三、DNA或RNA濃度、純度和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定（一）紫外光光度法測(cè)定DNA、RNA的濃度和純度原理：DNA（或 RNA）在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10ml）在紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定。LOGO1、濃度測(cè)定OD260不僅與總含量有關(guān)，也受構(gòu)型影響。1ugmL DNA的OD260=0.021ugmL DNA/RNA或ssDNA的OD260=0.022-0.024LO

4、GO即50ugmL dsDNA37ugmL ssDNA 40ugmL RNA 30ugmL 寡核苷酸1 OD260=可據(jù)公式來(lái)計(jì)算ssDNA、dsDNA、RNA的濃度： SSDNA=33(OD260-OD310)稀釋倍數(shù)dSDNA=50 (OD260-OD310)稀釋倍數(shù)SSRNA=40 (OD260-OD310)稀釋倍數(shù)LOGO純DNA：A260A280約1.8，大于1.9表明有RNA污染， 小于1.6表明有蛋白質(zhì)、苯酚等的污染；純RNA:A260A280在1.7和2.0之間，小于1.7表明有蛋白質(zhì)和苯酚污染，大于2.0表明有異硫酸胍殘存。LOGOLOGO（二） 瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)原理：溴化

5、乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā) 紅色（澄紅）色熒光。與已知濃度的DNA電泳帶熒光強(qiáng)度對(duì)比，就可以估計(jì)出DNA含量。LOGO一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對(duì)比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如lDNA的Hind酶切物等。MarkerMarkerLOGODNA MarkerDNAladder1000bp28kb 20kb 5000bp900bp 800bp 700bp600bp 500b400bp 300bp 200bp100bp2500bp 2300bp900bp 750bp 200bpLOGOp1.溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的

6、主要化學(xué)成分肽聚糖中的b-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH8）下有活性。2.葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。LOGO四、相關(guān)試劑及作用3.EDTAMg2+、Ca 2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性， 防止DNA被酶降解，并有助于容菌酶發(fā)揮作用。4.SDS十二烷基磺酸鈉，膜的強(qiáng)的去垢劑，蛋白質(zhì)變性劑， 小分子， 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。注意：膜的溫和去垢劑有：riton-100,作用原理同SDS。LOGO5.乙醇、異丙醇用于沉淀DNA。0.6倍體積的異丙醇。LOGODNA分子以水合狀態(tài)“溶

7、于”水里， 乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。6. RNase A降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。7.TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。LOGOTris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖業(yè)），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。8. 酚-氯仿選用蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。注意：還可以用酚或氯仿異戊來(lái)使蛋白質(zhì)變性LOGO以上試劑有商業(yè)試劑盒； 也可以自己配制。9. 蛋白酶K細(xì)胞裂解10.CTAB(十六烷基三甲基溴化銨

8、)：除去多糖11.液氮?jiǎng)又参锝M織粉碎L(zhǎng)OGOq 問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。原因?qū)Σ週OGO1. 重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見(jiàn)前）2. 重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3. 增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類(lèi)雜質(zhì)2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3. DNA中殘留有金屬離子五、DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題q 問(wèn)題二：DNA降解。原因?qū)Σ?. 材料不新鮮或反復(fù)凍融2. 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3. 提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷4. 外源核酸酶污染5. 反復(fù)凍融1. 盡量取新鮮材料，低溫保存材料

9、避免反復(fù)凍融2. 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液3. 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量4. 細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5. 所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6. 將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融LOGOq 問(wèn)題三：DNA提取量少。原因?qū)Σ?. 實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少2. 破壁或裂解不充分3. 沉淀不完全4. 洗滌時(shí)DNA丟失1. 盡量選用新鮮（ ）的材料2. 動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G 菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁3. 高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）4. 低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間5. 加輔助物

10、，促進(jìn)沉淀6. 洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒LOGO電泳技術(shù)2LOGO一、電泳的基本原理帶電荷的分子在電場(chǎng)中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱(chēng)為電泳遷移率。大小、形狀以及介質(zhì)的粘度LOGODNA、RNA的磷酸-糖骨架的磷酸基團(tuán)是電 離化的,因此是多聚陰離子鏈，由于磷酸-糖骨架的重復(fù)特性，單位質(zhì)量的單雙鏈以及長(zhǎng)的短的DNA所帶電荷相等。V QE / f如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同（電泳液和凝膠）：分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀。形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān): 分子量越大，移動(dòng)越慢。LOGOIncreasing deg

11、ree of supercoilingRelaxedsupercoiled相同分子量的DNA:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之，伸展開(kāi)環(huán)狀最慢。LOGOLOGOLOGO二 、瓊脂糖凝膠電泳(一)瓊脂糖凝膠1. 瓊脂糖2. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的的膠體“胨”。瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。濃度高空隙小LOGO是一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。3. 低熔點(diǎn)膠（1）低熔點(diǎn)（LMP）的瓊脂糖凝膠：昂貴，熔點(diǎn)為6265的瓊脂糖衍生物，一旦溶解，便可以在37下保持液體狀態(tài)達(dá)數(shù)小 時(shí)之久，而在25也可以保持液體狀態(tài)約10

12、min。LMP瓊脂糖可以不經(jīng)電洗脫或破壞凝膠劑 就可用來(lái)回收或進(jìn)一步處理DNA。（2）常熔點(diǎn)的瓊脂糖凝膠：便宜LOGO空隙大小決定其分辨分子大小的能力。LOGO瓊脂糖濃度0.30.60.70.91.21.52.0L-DNA5-60 1-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3大小/kb空隙小，分辨率高：小分子較易通過(guò)，而大分子難通過(guò)； 空隙大，分辨率低：大小分子幾乎以同等速率通過(guò)。4.瓊脂糖凝膠的分辨力v 基本過(guò)程：制膠放入電泳槽中并加入電泳緩沖液取出梳子點(diǎn)樣電泳取出凝膠進(jìn)行EB染色掃膠，分析結(jié)果注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套。LOGO5.瓊脂糖凝膠電泳的基本過(guò)程(二

13、)DNA電泳影響因素1. DNA分子大小2. DNA分子構(gòu)型超螺旋最快、線狀分子次之，開(kāi)環(huán)分子最慢。3. 凝膠濃度4. 電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度高(5V/cm)，電泳速度快，但分辨率低。在精確測(cè)定時(shí)降低電壓至1V/cm，分辨率高LOGO5.溴化乙錠(EB)EB具有扁平結(jié)構(gòu)，能嵌入到DNA堿基對(duì)間。 EB對(duì)線狀與開(kāi)環(huán)分子影響較小，對(duì)超螺旋態(tài)分子影響較大。當(dāng)嵌入的EB分子增多時(shí)，負(fù)超螺旋狀態(tài)向共價(jià)閉 合環(huán)狀轉(zhuǎn)變，遷移速度由快變慢；當(dāng)嵌入的EB分子進(jìn)一步增加時(shí)，DNA分子向正超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變，這時(shí)電泳遷移速率又由慢變快。6.電泳緩沖液LOGO三、瓊脂糖變性膠電泳RNA為單鏈，鏈內(nèi)容易配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。不同RN

14、A結(jié)構(gòu)不同，在未變性條件下，其相對(duì)分子質(zhì)量與電泳移動(dòng)距離沒(méi)有嚴(yán)格的相關(guān)性。須在變性條件下破壞RNA空間結(jié)構(gòu)后電泳，使RNA移動(dòng)距離與其相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成正比。LOGO三、瓊脂糖變性膠電泳常用的RNA變性膠：一種為含有乙二醛一二甲基 亞砜(DMSO)的凝膠，另一種是含有甲醛的凝膠。前者比后者更難電泳，因?yàn)殡娪揪徛倚枰娪?液循環(huán)，以避免形成高H+梯度。二者分辨率相近， 但后者的雜交帶更銳利，甲醛變性膠電泳操作更方便。LOGO1. 指示劑核酸電泳常用的指示劑有溴酚蘭和二甲苯青.溴酚蘭在堿 性液體中呈紫蘭色;二甲苯青的水溶液呈蘭色.溴酚蘭二甲苯青LOGO凝膠濃度1%1.4%遷移率kb21.6凝膠濃

15、度0.6%1%1.4%2%遷移率kb10.60.20.15四、核酸電泳的指示劑和染色劑指示劑的作用指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液. 載樣緩沖液的作用有:增加樣品密度，使其比重增加，以確保DNA均勻沉入 加樣孔內(nèi).在電泳中形成肉眼可見(jiàn)的指 示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置.使樣品呈色，使加樣操作更方便.LOGO一般加入量為樣品量的五分之一。2. 染色劑最常用的是EB染色法，其次是銀染色. (1)、溴化乙錠EB分子可嵌入dsDNA堿基對(duì)之間，在UV（300 nm波長(zhǎng)）激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。在凝膠電泳液中加入終濃度為0.5ug/ml的EB，有時(shí)亦可在電泳后用EB溶液浸 泡凝膠10

16、15min；肉眼可見(jiàn)DNA帶，DNA量一般5ng；當(dāng)EB太多，DNA帶看不清時(shí)，可將凝膠放入蒸餾水浸泡30min后再觀察。LOGOEthidium bromide（EB）LOGOLOGOLOGOUVP全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)LOGOOMEGA8-LOGO全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)LOGO（2）銀染色:銀染色液中的銀離子(Ag+)可與核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 然后用還原劑如甲醛使Ag+還原成銀顆粒，可把核酸電泳帶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝膠電泳染色， 也用于瓊脂糖凝膠染色，其靈敏度比EB高200倍。但銀染色后，DNA不宜回收.LOGO聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)2LOGOLOGO PCR 儀LOGO一、 P

17、CR技術(shù)的概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是Kary Mullis于1985年發(fā)明的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，是基因工程研究不可或缺的基本技術(shù)。LOGOLOGO（一）原理PCR的基本原理v PCR反應(yīng)條件9550v PCR過(guò)程vPCR的特點(diǎn)引物1引物2LOGODNA引物PCR的基本原理v PCR反應(yīng)條件5702v PCR過(guò)程vPCR的特點(diǎn)Taq酶引物1引物2Taq酶LOGODNA引物PCR的基本原理vPCR反應(yīng)條件7925vvPCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始LOGOPCR的基本原理v PCR反應(yīng)條件95720Taqv PCR過(guò)程v PCR的特點(diǎn)TaqTaqTaqLOGOPCR的基本原理vPCR反

18、應(yīng)條件72vPCR過(guò)程vPCR的特點(diǎn)第2輪結(jié)束LOGO模板DNAPCR的基本原理第1輪擴(kuò)增v 第PC2R輪反應(yīng)擴(kuò)條增件v PCR過(guò)程v PCR的特點(diǎn)第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增LOGO中溫延伸72oC 1-2minLOGO440-6572 10min低溫退火3772 1min95oC 5min高溫變性94oC 30sPCR三個(gè)階段注意：1. 變性：如模板的G+C含量較高，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。2. 退火：溫度取決于引物的Tm值，一般引物越短，退火溫度越低，反之則高。退火溫度越高，特異性越強(qiáng)，擴(kuò)增效率隨之降低。LOGO25-35cyclesTarget(起始模)3 X 1051.5 X

19、 104所需循環(huán)數(shù)25-30(1vg哺乳動(dòng)物DNA)30-3535-4040-451X 10350擴(kuò)增效率：Nf=N0(1+Y)nLOGO3、循環(huán)次數(shù)PCR 后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。(一般已經(jīng)積累0.3-1 pmol產(chǎn)物)原因隨著引物、dNTP濃度降低，摻入速度減慢；隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降；DNA 聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低 ;產(chǎn)物的再結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物 變性不徹底。非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物的競(jìng)爭(zhēng)；LOGO4、平臺(tái)效應(yīng) plateaueffectPCR使用專(zhuān)門(mén)合成的DNA引物。延伸過(guò)程是在高溫下進(jìn)行。這就避免了一般DNA聚合酶污染和非

20、引物延伸形成的DNA。需要的模板量極低。理論上只要一條模板鏈，32次循環(huán)就可合成約109條！LOGO（二）敏感性高（一）特異性強(qiáng)三、PCR的特點(diǎn)整個(gè)PCR過(guò)程約2.5-4小時(shí)即可完成。對(duì)模板的純度要求低。RT-PCR：先用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。LOGO（五）可以擴(kuò)增mRNA不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。（四） 簡(jiǎn)便（三）快速四、PCR的反應(yīng)體系（一）緩沖液buffer(1X)LOGO50m MKCl引物退火annealing10m MTris-HClpH8.3-9.0（室溫）延伸溫度（72 ）下，pH 值接近

21、7.2 。1.5m MMgCl2激活DNA聚合酶的活性中心，特異性和(0.5-2.5)產(chǎn)率，-20度保效,Mg2+不含有沉淀析出0.01%明膠(0.1%Triton-100)有時(shí)還加入一些添加劑和共溶劑可降低錯(cuò)配率，提高富含 G+C模板的擴(kuò)增效率。Taq DNA聚合酶要求有游離的Mg2+ 。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性（雜帶） 。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2終濃度。LOGOMg 2+ 的濃度（二）模板（template) 純度：PC

22、R對(duì)模板DNA的純度要求不高。 模板的量：一般104-107個(gè)模板分子可達(dá)到滿(mǎn)意的效果，一般 宜用ng級(jí)的克隆DNA、ug水平的染色體DNA或10-10拷貝待擴(kuò)增的DN段作為起始材料。LOGO不能太多，100ml反應(yīng)體系中100ng足夠。但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA酶、Mg2+的螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。（三）dNTPsdNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的總稱(chēng)。貯備液為pH 7.0左右，其濃度一般為20mM，- 20保存，體系中為200M即可，過(guò)低則反應(yīng)速度下降，濃度過(guò)高會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加錯(cuò)配率,即特異性下降。LOGO4種dNTPs 應(yīng)平衡,提高忠

23、實(shí)性使用時(shí),應(yīng)考慮Mg2+、引物和產(chǎn)量之間的關(guān)系如序列分析和制備探針時(shí)，用20-40uM（1）特點(diǎn) 熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性， 耐高溫。 最適溫度高75-80 oC約35-150nt/s酶分子最適溫度：延伸速度：最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：6.7kbLOGO1. Taq DNA聚合酶（四） DNA聚合酶 Taq酶的功能缺點(diǎn)具53方向的聚合活性、5 3方向的外切酶活性以及逆轉(zhuǎn)錄酶活性，但沒(méi)有3 5外切酶活性，不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì)！而且聚合完成后在3端引入非模板互補(bǔ)核苷酸A，從而克隆時(shí)須用T-vector。合成超過(guò)600bp長(zhǎng)度的DNA就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。LOGO

24、TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)10080604020酶活性401005060708090溫度()LOGO(%)2.Tth DNA聚合酶在Mg2+存在下可以以DNA為模板合成DNA，而在Mn2+存在下以RNA為模板合成cDNA。因此可在高溫下催化RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄和引物延伸反應(yīng)。無(wú)3 5DNA外切酶活性。3.VENT DNA聚合酶有35外切酶活性，能夠校正堿基的錯(cuò)配。能耐受100oC高溫。LOGO有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。LOGOTaq的PCR產(chǎn)物3端往往帶有一個(gè)A。5.Taq Plus DNA Polymeras

25、e但PCR產(chǎn)物為平端！是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯(cuò)率最低的。4. Pfu DNA Polymerase（五）引物（primer)1.定義：引物是指在PCR反應(yīng)中與待擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段兩翼互補(bǔ)的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是單鏈DN段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及擴(kuò)增的靶序列在基因組中的位置是由引物限定的。LOGO（1）引物的長(zhǎng)度(1)長(zhǎng)度一般為1630bp為宜，最佳為2024bp更短的引物一般會(huì)降低擴(kuò)增特異性，但會(huì)提高有效性，擴(kuò)增的產(chǎn)物種類(lèi)會(huì)增多。LOGO2.引物應(yīng)該滿(mǎn)足的條件(2)G+C含量一般為40-60為佳，兩條引物G+C含量應(yīng)盡量相似，Tm最好接近，差異最好在1以?xún)?nèi)，最多不超過(guò)5。LO

26、GO適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合 的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。(3)兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別應(yīng)避免形成“引物二聚體，如果無(wú)法避免，其3端互補(bǔ)不 應(yīng)大于2個(gè)堿基。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列，避免同源序列(尤其6個(gè)堿基以上相同)。primer15GGTCTGCCAGTCTAC33CAGGACTTAGTCACT5primer2LOGO(4)引物內(nèi)部避免形成次級(jí)機(jī)構(gòu)，尤其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp,必要時(shí)應(yīng)通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3T CTGCCAGTCTAC3發(fā)卡結(jié)構(gòu)GACGG5LOGO(5)引物的延伸從

27、3端開(kāi)始，3端不能進(jìn)行任何修 飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能，3末端 最后1個(gè)堿基最好是G或C。LOGO(6)引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可被修飾而不影響擴(kuò) 增的特異性。5端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。LOGO3553限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列啟動(dòng)子序列定點(diǎn)突變探針標(biāo)記LOGO(7)引物3端不要終止于編碼區(qū)域子的第3位，因子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。LOGO3.引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專(zhuān)業(yè)軟件如Primer5.0等LOGO(六)PCR反應(yīng)的最佳條件1.2.3.Taq D

28、NA聚合酶的濃度為2.5U/100uldNTP的濃度為20-200uM, Mg2+濃度為0.52.5mM；200uM4.引物的濃度為0.21.0uM，一般使用終濃度各0.5mM。5.10X擴(kuò)增緩沖液：10ulLOGO（一）實(shí)時(shí)定量PCR（二）反向PCR（三）隨機(jī)引物PCR（AP-PCR）（四）多重PCR（五） LP-PCR（Labelled primers)（六）反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)錨定PCR RACE技術(shù)自學(xué)LOGO五、PCR技術(shù)的擴(kuò)展（PCR的應(yīng)用）（一）實(shí)時(shí)定量PCR1、概念在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積 累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)模板中特定基因進(jìn)行定

29、量分析的方法。LOGO2.熒光定量PCR特點(diǎn)光譜技術(shù)高精確性高靈敏性高特異性高精確性PCR高靈敏性DNA雜交高特異性LOGO3.熒光定量PCR常用技術(shù)Taqman 技術(shù)SYBR Green熒光染色法分子信標(biāo)技術(shù)FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù)LOGO（1）Taqman 技術(shù)v PE公司開(kāi)發(fā)v 原理：熒光探針:一個(gè)能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光標(biāo)記的基因探針，其 5 端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R）， 3 端標(biāo)記熒光抑制基團(tuán)（Quencher, Q）,在一定距離范圍內(nèi)，Q 基團(tuán)可吸收R 基團(tuán)發(fā)出的熒光，因此，只有探針被切斷后，R 基團(tuán)的熒光信號(hào)才能被檢測(cè)到當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物時(shí)，該探 針可與模

30、板的特異序列結(jié)合當(dāng)Taq酶靠近探針時(shí)， 激活了Taq酶的外切酶活性，將探針5 的R切下，R基團(tuán)發(fā)出熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算初始模板的數(shù)量LOGO 、Taqman 技術(shù)原理自動(dòng)化熒光檢測(cè)法 信號(hào)基因（Qeporter），單獨(dú)存在時(shí)可以發(fā)光 抑制基因（Quencher），其存在時(shí)可抑制信號(hào)基因的功能，不產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象LOGO特異性熒光雙標(biāo)記探針Taq酶53外切酶活性LOGOLOGO優(yōu)點(diǎn)準(zhǔn)確定量,定量范圍寬; 特異性強(qiáng); 操作快速,無(wú)須做梯度稀釋,無(wú)須PCR后處理; 技術(shù)簡(jiǎn)單,安全.缺點(diǎn)實(shí)際上探針較長(zhǎng)使兩端基團(tuán)距離較遠(yuǎn),導(dǎo)致熒光淬滅難以徹底;定量時(shí)受酶性能影響設(shè)備昂貴，難以普及LOGO方法學(xué)評(píng)價(jià)（2）

31、SYBR Green熒光染色原理SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料.當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因 此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。LOGO 原理SYBRGreen I 熒光染料與DNA雙 鏈 的結(jié)合LOGOSYBR Green DetectionLOGO 特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)成本低缺點(diǎn)結(jié)合到反應(yīng)體系的所有dsDNA上,所以特異性不如TaqMan探針。容易產(chǎn)生非特異信號(hào),本底光較大LOGO（二）反向PCR ，reverse PCR擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列3553（傳統(tǒng)PCR只擴(kuò)增兩個(gè)引物質(zhì)之間的已知序列）。

32、把線性DNA模板轉(zhuǎn)變成環(huán)形分子。LOGO2、技術(shù)關(guān)鍵templatetemplate1、特點(diǎn)是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DN段，對(duì)某個(gè)已知DN段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。已知序列未知序列未知序列LOGO3、原理限制酶限制酶未知序列已知序列未知序列LOGO連接酶使引物的外側(cè)序列 “轉(zhuǎn)變” 成內(nèi)側(cè)序列。LOGOLOGO可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DN段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。4、用途（三）隨機(jī)引物PCR，AP-PCR）1、概述：又稱(chēng)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（ Random amplified polimophic

33、 DNA ，縮寫(xiě)為 RAPD2、特點(diǎn)：（1） 引物長(zhǎng) 8-10 堿基，短；（2） 引物的序列隨機(jī)（3） RAPD 反應(yīng)的條件與普通 PCR 基本相同。但由于引物較短，一般退火所需溫度較低。（4） RAPD 不需知道模板 DNA 的序列，擴(kuò)增出來(lái)的片段也是非特異性的；而普通 PCR則必須知道待擴(kuò)增目的片段的序列，根據(jù)這一序列設(shè)計(jì)一對(duì)相應(yīng)的引物L(fēng)OGO3、特點(diǎn)用途：RAPD 技術(shù)一出現(xiàn)，便以它的簡(jiǎn)便、快捷和多態(tài)性撿出率高而引起科學(xué)工作者的極大興趣。目前這一技術(shù)已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、 DNA究領(lǐng)域分析和基因定位等不同研LOGO用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。引物電泳LOGO（

34、四）多重PCR根據(jù)要檢測(cè)的某一個(gè)DNA上的n個(gè)特定序列，分別設(shè)計(jì)n對(duì)引物，這些引物與膜板在統(tǒng)一個(gè)反映體系內(nèi)，若要檢測(cè)的特定序列存在，經(jīng)過(guò)PCR后，并可以通過(guò)相應(yīng)引物擴(kuò)增出來(lái)， 若不存在，就擴(kuò)不出來(lái)這樣，PCR后經(jīng)過(guò)凝膠電泳，便可以檢測(cè)出哪些特定基因存在， 那些不存在用途：一次檢測(cè)某個(gè)DNA 上的多個(gè)不同序列。LOGO利用同位素、熒光素等對(duì)引物的5端進(jìn)行標(biāo)記，用來(lái)檢測(cè)靶基因是否存在特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒4LOGO（五） LP-PCR標(biāo)記PCR（Labelled primers)LOGO觀察PCR產(chǎn)物標(biāo)記引物 六、 PCR技術(shù)的應(yīng)用在基因的某處引

35、入核苷酸突變（缺失、重復(fù)、插入、替換等）。LOGO2、基因的體外誘變1、擴(kuò)增某一段DNA技術(shù)關(guān)鍵：LOGO利用引物的5端序列不要求與模板嚴(yán)格配對(duì)，設(shè)計(jì)引物時(shí)引入突變序列。3、基因組的比較研究比較不同物種之間的基因組特征和相似性。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA)利用6bp長(zhǎng)度的隨機(jī)序列引物擴(kuò)增細(xì)胞中的總DNA，將會(huì)得到許多非特異性產(chǎn)物，反映了該引物序列在基因組中的分布狀況。類(lèi)似于限制性?xún)?nèi)切酶片斷長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析，因而也稱(chēng)為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）分析。LOGO核酸和蛋白質(zhì)的分子雜交3LOGO一、概述核酸分子雜交技術(shù)，是在1968

36、年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院的Roy Britten及其同事發(fā)明的。LOGO(一）分類(lèi)Southern印跡雜交:鑒別DNA靶分子的雜交Northern 印跡雜交:鑒別RNA靶分子的雜交Western 印跡雜交: 鑒別蛋白質(zhì)分子的雜交LOGO探針已與待測(cè)核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針?lè)肿语@示的位置及其量的多少，反 映出待測(cè)核酸分子中是否存在相應(yīng)的基因順序及其含量與大小。核酸分子雜交實(shí)質(zhì)上是雙鏈核酸分子變性和具同源序列的兩條單鏈復(fù)性的過(guò)程。雜種核酸分子：退火的核酸來(lái)自不同的生物有機(jī)體所形成的雙鏈分子。LOGO（二）原理：堿基互補(bǔ)配對(duì)二、常用分子雜交類(lèi)型（一）Southern blotting1.概

37、述1975年，英國(guó)Southern創(chuàng)建用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。LOGOSouthern blot 篩選結(jié)果LOGO待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)樣品的電泳分離凝膠中DNA的變性（堿變性）轉(zhuǎn)膜(印跡)(毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法)Southern雜交(預(yù)雜交、雜交、洗膜) 雜交結(jié)果的檢測(cè)LOGO2.Southern 雜交的流程（a）基因組DNA DNA限制片段（b）（c）（d）硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因（e）LOGOX光底片 DN段2.Souther

38、n雜交的流程LOGOLOGO(二) Northern blotting用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。LOGO主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。v 是指DNA-RNA分子雜交，應(yīng)用特異性基因探針?lè)治龌虻霓D(zhuǎn)錄水平。提取Cell總RNA提純分離mRNA瓊脂糖凝膠變性電泳分離RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜雜交檢測(cè)LOGO2. 步驟1. 原理及特點(diǎn)NorthernBlotLOGO(三)茵落原位雜交噬菌斑雜交、原位雜交菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到NC上溶菌、變性濾膜交聯(lián)或烤干與DNA或RNA探針雜交洗去未雜交的探針曝光分析結(jié)果挑選出含有插入序列的菌落或噬菌斑LOGOp48圖4-

39、6LOGO (六)Western blotting1.定義：通過(guò)抗原抗體的免疫反應(yīng)，從混合蛋白質(zhì)樣品中檢測(cè)出特異目的蛋白。LOGO2.實(shí)驗(yàn)步驟先將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳展開(kāi)，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到固相膜(硝酸纖維素濾膜或PVDF膜)上。點(diǎn)樣電泳方向LOGO聚偏乙烯膜 Western裝置LOGO Blotting原理與ELISA相同。HRPO或堿性磷酸酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光辣根過(guò)氧化物酶：HRPO底片曝光LOGO硝酸纖維素膜待測(cè)蛋白一抗二抗PAGE膠待測(cè)蛋白LOGODNA序列分析4LOGO DNA測(cè)序方法概述Maxam-Gilbert法（化學(xué)降解法）Sanger法（末端終止法）DNA自動(dòng)測(cè)序法LOGOSanger等1977年發(fā)明。Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化學(xué)獎(jiǎng)LOGO一、雙脫氧鏈終止法1. 原理v 采用核苷酸鏈終止劑ddNTP終止DNA的延長(zhǎng)。由于它缺少形成3/5/磷酸二