第6章 胚胎工程,本章重點(diǎn),體外受精,胚胎分割,胚胎移植,性別控制,6.1.1 胚胎發(fā)育的基本過程,1.生殖細(xì)胞的發(fā)生,1）卵細(xì)胞內(nèi)的生殖質(zhì)決定生殖細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn) 2) 生殖細(xì)胞向生殖腺的遷移：生殖細(xì)胞遷入生殖腺后先進(jìn)行幾次有絲分裂，然后開始分化為精子和卵子。 3) 生殖細(xì)胞的分化 卵子發(fā)生：有兩次停頓。 精子發(fā)生：精原細(xì)胞（胚胎）精母細(xì)胞四個(gè)精子。,2.受精,定義 : 精子和卵子自發(fā)融合成為受 精卵（合 子）的過程 地點(diǎn): 輸卵管壺腹部 時(shí)間: 排卵后24小時(shí)內(nèi) 準(zhǔn)備: 成熟的精子和卵子 （條件） 精子獲能及頂體反應(yīng),精子通過子宮和輸卵管時(shí), 覆蓋在其表面的精漿蛋白被去除，從而獲得使卵子受精的能力，稱為獲能。,在體外也能完成獲能，卵泡液、輸卵管分泌物、血清、房水等可使精子獲能。,（1）精子的成熟與獲能,2.卵子的成熟與排放,（1） 卵泡細(xì)胞的成熟：卵細(xì)胞的發(fā)育過程要依賴其它細(xì)胞的協(xié)助和營(yíng)養(yǎng)。 （2）卵子的排放與激素的影響： a. 排放：初級(jí)卵母細(xì)胞 次級(jí)卵卵細(xì)胞 +第一級(jí)體 卵細(xì)胞+第二級(jí)體 b.激素的影響：促性腺激素FSH+LH 卵泡成熟并排卵，形成黃體黃體分泌孕酮+雌激素受精卵著床,第一次減數(shù)分裂,第二次減數(shù)分裂,24h內(nèi)受精,3.頂體反應(yīng) 透明帶反應(yīng)：有精子受體蛋白。 頂體反應(yīng)：精子釋放頂體酶熔蝕放射冠和透明帶的過程。 4.多精受精的阻斷 透明帶反應(yīng)：精、卵結(jié)合后，透明帶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，阻止了其它精子穿越透明帶。保證了正常的單精受精。,受精過程三步曲：, 精子穿過放射冠； 精子穿過透明帶； 精、卵質(zhì)膜融合，細(xì)胞核融合。,3.卵裂,受精卵 卵裂 卵裂球 2 細(xì)胞期 16細(xì)胞期（桑椹胚） 30小時(shí)，輸卵管 72小時(shí)，近子宮腔 內(nèi)細(xì)胞群 胚泡 滋養(yǎng)層 第5天，子宮腔 胚泡腔,卵裂與胚泡形成（第1周）,內(nèi)細(xì)胞群,2. 雌原核與雄原核融合,3. 卵裂開始,4. 2細(xì)胞期,透明帶,極體,卵裂球,5. 4細(xì)胞期,6. 8細(xì)胞期,滋養(yǎng)層,7. 桑椹胚,胚泡腔,8. 胚泡,1. 雌原核與雄原核形成,4.囊胚的形成,卵裂的結(jié)果是分裂球形成中空的球狀胚。,排卵、早期胚發(fā)生,子宮內(nèi)膜,子宮肌層,子宮外膜,卵巢,發(fā)育中的卵泡,闊韌帶,受精, 受精卵進(jìn)行卵裂并逐漸向子宮運(yùn)行,胚泡開始脫離透明帶, 胚泡與子宮內(nèi)膜接觸準(zhǔn)備植入, 桑椹胚進(jìn)入子宮,輸卵管壺腹部,卵泡破裂排卵,輸卵管,子宮,著床定義 胚泡逐漸埋入子宮內(nèi)膜 的過程 著床時(shí)間 受精后6-7天開始， 11-12天完成 著床部位 子宮體、子宮底,5.原腸胚的形成,形成方式有：內(nèi)陷、內(nèi)移、分層、內(nèi)轉(zhuǎn)、外包,6.中胚層用體腔的形成,7.胚層分化,初級(jí)卵黃囊 胚外中胚層 胚盤 羊膜囊,體外受精是指哺乳動(dòng)物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)。它的基本原理是在人工模擬體內(nèi)環(huán)境，包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、濕度、氣體、滲透壓、PH等，使卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體的初級(jí)卵母細(xì)胞成熟，同時(shí)使精子獲能，完成受精。,6.2.1 體外受精的研究歷史,早在1878年，德國(guó)人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動(dòng)物的體外受精技術(shù)，但一直沒有獲得成功。 直到1951年，美籍華人張明覺和澳大利亞人Austin同時(shí)發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的精子獲能現(xiàn)象，這一領(lǐng)域的研究才獲得突破性進(jìn)展。 現(xiàn)在試管小鼠、嬰兒、牛、山羊、等相繼出生。,6.2.2 體外受精技術(shù),1、卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng),主要包括以下幾個(gè)過程： （1）卵母細(xì)胞的采集 （2）卵母細(xì)胞的選擇 （3）卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng),掌握超數(shù)排卵和體外受精的的定義,附加說明,（1）卵母細(xì)胞的采集 1）超數(shù)排卵：是指人為注射外源促性腺激素，促使卵巢排出較正常情況下更多的成熟卵子。 a.超數(shù)排卵所用激素： 對(duì)卵巢產(chǎn)生作用并能引起卵的成熟和排卵的激素主要有：孕酮、雌二醇（F2），促卵泡激素（FSH）、促黃體激素（LH）、促性腺激素釋放激素（GnRH）,所用的外源激素除上述幾種外，近年來最常用的有前列腺素（PG）及其類似物和孕馬清促性腺激素（PMSG）。,PG是一類有生理活性的不飽和脂肪酸，不僅可引起子宮強(qiáng)烈收縮，而且還有溶解黃體的作用，黃體退化前，卵泡的發(fā)育被抑制，因此，PG可通過促進(jìn)黃體消退而引起下一輪卵泡的發(fā)育和排卵。,b.超數(shù)排卵的方法： 各類激素搭配使用，F(xiàn)SH在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期比較短，必須每日注射1到2次，連續(xù)應(yīng)用5天，以后用PMSG，在發(fā)情周期的卵泡期皮下或肌肉注射一次即可。 FSH+其它激素：采用小劑量多次注射的方法，每天注射2次，連續(xù)注射3到4次。 PMSG+其它激素：由于PMSG的生物半衰期較長(zhǎng)，因而只需注射一次。,c.影響超數(shù)排卵的因素有： 供體的年齡例如產(chǎn)奶年齡在3-8歲，超排效果好，超過10歲，超排的卵明顯下降。 供體品種差異 激素處理的劑量：一般說來，激素劑量越大。排卵越多，但同樣也要看到，過劑量的激素反應(yīng)可能抑制排卵，或者影響卵的質(zhì)量。 營(yíng)養(yǎng)、季節(jié)、地域、藥物質(zhì)量等。,2）從活體卵巢中采集卵母細(xì)胞：借助超聲波探測(cè)儀、內(nèi)鏡或腹腔鏡直接從活體動(dòng)物的卵巢中吸取卵母細(xì)胞。 3）從屠宰后母畜卵巢上采集卵母細(xì)胞：直接摘出卵巢，放入30-37度滅菌生理鹽水中，快速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。,（2）卵母細(xì)胞的選擇：一般只培養(yǎng)A級(jí)和B級(jí)卵母細(xì)胞。 （3）卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)： 在成熟培養(yǎng)基里添加胎牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成分。COC經(jīng)成熟培養(yǎng)后,卵丘細(xì)胞層擴(kuò)散,靠近卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞呈放射狀排列,出現(xiàn)放射冠,通過染色體分析,卵母細(xì)胞處于第二次減數(shù)分裂中期.,2、精子的獲能處理,洗滌: 在選擇精子時(shí)可用上浮分離法，即在精液上面加入少量培養(yǎng)液，有活力的精子會(huì)游到培養(yǎng)液上部。收集培養(yǎng)液上部的精子，即可得到有活力的精子，這種方法叫做上浮法。,獲能: 1）鈣離子在精子獲能時(shí)起關(guān)鍵作用，誘發(fā)頂體反應(yīng)。 2）氨基多糖（GAG）來誘導(dǎo)精子獲能，肝素是高度硫酸化的GAG，咖啡因能增強(qiáng)肝素的誘導(dǎo)作用。 3）在精子獲能過程中，BSA可以降低精子頂體膜中膽固醇的濃度，有利于頂體反應(yīng)。精子獲能后，BSA可促進(jìn)迅速穿透卵子。,3、體外受精,4、受精卵的體外培養(yǎng),5、胚胎移植,選擇繁殖性能強(qiáng)、體格健壯的母畜作為受體，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法將體外受精并發(fā)育優(yōu)良的胚胎移植入受體的母畜的子宮中，使其懷孕產(chǎn)仔。,不懂交配養(yǎng)仔 9成大熊貓需要人工授精組圖,開始研究大熊貓繁殖時(shí)，所有技術(shù)人員都傻眼了：由于生殖系統(tǒng)退化，100只大熊貓中只有78只有配種能力；即使配上種，只有3040的雌性大熊貓能成功受孕；而幼仔成活率不到40！ 不能自然交配，臥龍的飼養(yǎng)專家們最后只能選擇通過人工授精的方式來為大熊貓家族延續(xù)后代，飼養(yǎng)專家們會(huì)先取成年、健康的雄性大熊貓的精液放在冷庫里保存，然后通過針管注射到雌性大熊貓的陰道里，再通過體外促性腺激素的刺激，增加雌性大熊貓的受孕幾率。,2002年3月7日，成都大熊貓繁育基地的雌性大熊貓“蘇蘇”接受了科研人員為它進(jìn)行的人工授精。今年18歲的大熊貓“蘇蘇”已經(jīng)是大熊貓中的“高齡孕婦”。據(jù)了解，大熊貓懷孕的最高年齡為19歲。,2009年12月13日，Nature雜志刊登了由深圳華大基因研究院領(lǐng)銜，對(duì)大熊貓基因組測(cè)序完畢。樣品取自“晶晶”，大能貓有染色體21對(duì)，基因組大小為2G，重復(fù)序列含量36%，基因2萬多個(gè)，經(jīng)二倍體測(cè)序，證明大熊貓基因組仍然具備很高的雜合率，從而推斷具有較高的遺傳多態(tài)性，不會(huì)瀕臨滅絕。并發(fā)現(xiàn)大熊貓不喜歡吃肉主要是由于一個(gè)基因T1R1失活了，無法感覺到肉味的鮮味。,北京首例試管嬰兒.jpg,婦科教授張麗珠與試管嬰兒的母親鄭桂珍在一起.jpg,產(chǎn)科專家張麗珠教授懷抱剛出生的試管嬰兒鄭萌珠.jpg,1998年3月6日，中國(guó)第一例試管嬰兒鄭萌珠回到她的誕生地北京醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，喜度l0周歲生日。這是鄭萌珠與當(dāng)年主持這一尖端科研項(xiàng)目的張麗珠教授共切生日蛋糕。 唐師曾攝.jpg,湖北省武漢大學(xué)人民醫(yī)院第四代試管嬰兒出生唯一的右.jpg,徐望明教授欣喜地看著中國(guó)唯一的第四代試管嬰兒小寶寶.jpg,吸取精子,顯微注射,授精,移植,胚胎移植成功的羊,6.3.1 胚胎移植的概念及應(yīng)用,1、概念及應(yīng)用 胚胎移植（embryo transfer)也稱受精卵移植，是指一頭母畜（稱為“供體”）發(fā)情排卵并經(jīng)過配種后，在一定時(shí)間內(nèi)從其生殖道（輸卵管或子宮角）取出受精卵或胚胎，然后把它們移植到另外一頭與供體同時(shí)發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的母畜（稱為“受體”）的輸卵管或子宮角。這個(gè)來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代。 “借劣質(zhì)動(dòng)物之腹懷優(yōu)秀個(gè)體之胎”,2.胚胎移植的生理基礎(chǔ)及原則,（1）胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ) （2）胚胎移植的基本原則,（1）胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ),成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個(gè)卵泡，在外源激素作用下，每個(gè)發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)十?dāng)?shù)個(gè) 每個(gè)發(fā)情周期生殖器官都有一個(gè)孕向發(fā)育 早期胚胎處于游離狀態(tài) 胚胎發(fā)育不存在免疫問題 胚胎發(fā)育到一定階段會(huì)與子宮發(fā)生生理和組聯(lián)系 胚胎的遺傳性不受受體的影響,（2）胚胎移植的基本原則,胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性 供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性 動(dòng)物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性 動(dòng)物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性 胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi) 胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響,6.3.2 胚胎移植技術(shù),1.供體、受體的選擇 2.超數(shù)排卵 3 同步發(fā)情 4.人工受精 5.胚胎采集 6.胚胎的檢查與鑒定 7.胚胎移植,胚胎移植的技術(shù)程序,1.供體和受體的選擇,畜牧學(xué)選擇：胚胎移植的供體一般是需要加速繁殖的生產(chǎn)能力較高的優(yōu)良品種，供體應(yīng)具有相當(dāng)高的育種價(jià)值,供體生殖機(jī)能應(yīng)處于較高的狀態(tài)：產(chǎn)后60天以上，無生殖系統(tǒng)疾病，體質(zhì)強(qiáng)?。皇荏w則是繁殖性能較高的本地品種，對(duì)地方適應(yīng)性強(qiáng)，體型中上等，非優(yōu)良品種。 獸醫(yī)學(xué)選擇：主要任務(wù)是排除病毒，尤其是要把那些生殖器官患有疾病的個(gè)體清理出去。 生理學(xué)選擇：重點(diǎn)是檢查超排和同期發(fā)情處理前的卵巢活性，即卵泡發(fā)育和黃體功能。,2. 超數(shù)排卵處理,利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個(gè)過程就稱為超數(shù)排卵（superovulation） 意義：讓每個(gè)供體提供更多的胚胎,3.受體同期發(fā)情處理,1)前列腺素處理法：有溶黃體作用 產(chǎn)品：氯前列烯醇ClO、氨基丁三醇前列腺素F2 、美國(guó)普強(qiáng)公司的律胎素、英特威公司的保順產(chǎn) 用法： 肌肉注射：容易操作，用藥量較大 子宮內(nèi)注射：將激素注入到母畜子宮內(nèi)或陰道穹窿內(nèi)，用量約為肌注的半 陰道粘膜注射：從陰道內(nèi)壁刺入0.5cm左右，注入激素。用量約為肌注的半,2）孕激素處理法：對(duì)母畜施以孕酮激素類藥物，在血液中保持一定量，造成人為黃體期，使卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育和成熟受到抑制。給藥的方法可以是陰道海綿栓塞、注射、口服、皮下埋植等。 陰道栓法：可靠，但成本較高 口服法：方法簡(jiǎn)單，用量不可靠 注射法：量準(zhǔn)確，但非常麻煩 埋植法：較少應(yīng)用,3）促性腺釋放激素和促性腺激素類,促性腺釋放激素類：LHRHA3等 促性腺激素類：PMSG（eCG)、FSH，LH、HCG（hCG） 用法：一般為肌肉注射，HCG、LHRH、LH均可在發(fā)情時(shí)靜脈注射,CIDR和放栓槍,放栓,羊同期發(fā)情放栓,孕激素埋植槍,供體超排處理,4.人工受精 發(fā)情后12小時(shí)開始第一次輸精，時(shí)隔12小時(shí)進(jìn)行第二次輸精，輸精量是常規(guī)量的2倍。,5.胚胎的收集 胚胎沖洗液的配制：杜氏磷酸緩沖液PBS，布林斯特液SOF合成輸卵管液 手術(shù)法收集胚胎 輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚 子宮角沖胚 非手術(shù)法收集胚胎 二路法 三路法,移胚,配種后3天的供卵巢,供體羊胚胎收集,收集到的沖洗液靜置，沖洗液分離。 揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。 胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細(xì)胞、發(fā)育階段及細(xì)胞在透明帶中的比例確定胚胎級(jí)別。,6.胚胎的檢查,6天收集的胚胎（未揀）,二細(xì)胞至四細(xì)胞胚胎,手術(shù)法移植 非手術(shù)法移植,7.胚胎移植,8.供體和受體的術(shù)后觀察及處理,供體和受體的抗炎處理 健康狀況檢查 返情狀況檢查 妊娠檢查及妊娠確定,胚胎移植產(chǎn)出的犢牛,一次移入三枚胚全部成活,受體母羊與所生羔羊,所謂胚胎分割即是一枚胚胎用顯微手術(shù)的方法分割成二分、四分胚甚至八分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植入受體中，以得到同卵雙生或同卵多生后代的技術(shù)，也是胚胎克隆的一種方法。,6.4.1 胚胎分割方法,胚胎分割的原理 根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個(gè)個(gè)體的全能性的特點(diǎn)，人們就考慮用這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，生產(chǎn)同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。,6.4.2 分割胚胎的培養(yǎng),1.分割的胚胎一般用較晚期的胚胎，因?yàn)橥砥谂咛ヒ艳D(zhuǎn)運(yùn)到子宮內(nèi)，可非手術(shù)獲取，透明帶不需要軟化，可直接分割。 2.分割后的胚一般都要在體外做短暫培養(yǎng)后才移植。,6.4.3 胚胎分割目前存在產(chǎn)問題和發(fā)展前景,需要掌握：,1.發(fā)育阻滯的定義：在體外受精的早期胚胎在體外發(fā)育中，往往會(huì)停止在某一階段不再發(fā)育，這種現(xiàn)象稱為發(fā)育阻滯。 2.造成發(fā)育阻滯的原因：a 基因調(diào)控的轉(zhuǎn)換 b 對(duì)環(huán)境敏感；c 過氧化物。 3.克服發(fā)育阻滯的方法：通過改進(jìn)培養(yǎng)液萬分和建立體細(xì)胞共同培養(yǎng)體系。,動(dòng)物的性別控制是指通過人為干預(yù)，使動(dòng)