IL12+重組卡介苗對(duì)新生期小鼠脾臟T細(xì)胞功能亞群發(fā)育的影響作者：何云,劉恩梅*,楊錫強(qiáng),李欣,劉瑋【摘要】目的:研究IL12+重組BCG新生期接種對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞功能亞群發(fā)育的影響。方法:新生清潔級(jí)BALB/c小鼠24只,分對(duì)照組、BCG組和IL12+重組BCG組。新生期接種,4周后取脾細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD8+IFN+、CD3+CD8-IFN+、CD3+CD8+IL+、CD3+CD8-IL+、CD4+Foxp3+T細(xì)胞的比例,其分別代表Tc1、Th1、Tc2、Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。結(jié)果:BCG組、IL12+重組BCG組Th1、Tc1細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組（P<；0.05或P<；0.01）,BCG組與IL12+重組BCG組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Tc2、Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例各組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；二接種組Th1/Th2、Tc1/Tc2和總IFN/IL4比值明顯高于對(duì)照組（P<；0.05或P<；0.01）；CD4+Foxp3+T細(xì)胞比例各組間比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>；0.05)。結(jié)論:新生期BCG和IL12+重組BCG接種組接種均能促進(jìn)Th1、Tc1細(xì)胞亞群的發(fā)育,提高Th1/Th2、Tc1/Tc2比值,但不能影響CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞的比例?！娟P(guān)鍵詞】卡介苗白細(xì)胞介素12T細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞AbstractAIM:ToexploretheeffectsofrecombinantBalillusCalmetteGuerinsecretingIL12onthedevelopmentofspleenTcellsubsetsofneonatalBALB/cmice.METHODS:TwentyfourneonatalBALB/cmicesweredivided3groups:Control,BCG,rBCGgroups,whichinoculatedwithBCGandrBCGintraperiotoneallywithin2-3daysafterbirth.Fourweekslater,spleencellsofmicewereisolatedandthepercentageofCD3+CD8+IFN+/CD3+CD8IFN+/CD3+CD8+IL+/CD3+CD8-IL+/CD4+Foxp3+Tcells,whichrepresentTc1/Th1/Tc2/Th2/Tregcellsrespectivelyweredetectedbyflowcytometryatsinglecellslevel,andTh1/Th2,Tc1/Tc2ratiowerecalculated.RESULTS:ThepercentagesofTh1,Tc1cellofBCGvaccinatedmice,rBCGvaccinatedmiceweresignificanthigherthancontrolmice(P<；0.01),andtherewasnodifferencebetweenthetwovaccinatedgroups.TheratioofTh1/Th2,Tc1/Tc2andtotalIFN/ILoftwovaccinatedgroupswerehigherthancontrolgroup.ThepercentagesofTregcellswerenodifferenceamongthethreegroups(P>；0.05).CONCLUSION:NeonatalBCGandrBCGvaccinationcansignificantlyincreaseTc1andTh1cellsandTh1/Th2,Tc1/Tc2ratioinspleencells.NeonatalBCGandrBCGvaccinationmayhaveansameeffectsondevelopmentofTcellsubsetsinneonatalBALB/cmice.ThepercentageofCD4+Foxp3+Tcellsamongthreegroupswerenosignificantdifference.Keywordsbacilluscalmetteguerin；interleukin12；Tcellssubsets；regulatoryTcell卡介苗（bacilluscalmetteguerin,BCG）可通過(guò)誘導(dǎo)Th1/Tr免疫應(yīng)答而保護(hù)哮喘,我們前期研究發(fā)現(xiàn)呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV）能逆轉(zhuǎn)新生期BCG接種的抗哮喘作用,其機(jī)制尚不清楚1,2。IL12是Th1分化發(fā)育的關(guān)鍵細(xì)胞因子。皮下注射重組IL12能減少哮喘患者嗜酸性粒細(xì)胞水平,但降低氣道高反應(yīng)性的作用不明顯,也不能改善隨后的哮喘癥狀,并有嚴(yán)重的副作用3。我們將IL12與BCG重組后能避免直接使用重組IL12的副作用,又能增強(qiáng)BCG的Th1/Tr應(yīng)答,并分別以CD3+CD8+IFN+、CD3+CD8-IFN+、CD3+CD8+IL4+、CD3+CD8-IL+、CD4+Foxp3+T細(xì)胞代表Tc1、Th1、Tc2、Th2及T調(diào)節(jié)性細(xì)胞水平,在單細(xì)胞水平觀察IL12+重組BCG在新生期接種對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞亞群發(fā)育的影響。1材料和方法11材料清潔級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)于專用消毒飼養(yǎng)盒內(nèi),恒定室溫。過(guò)濾空氣,飼料、水皆經(jīng)消毒處理,更換飼料等操作在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。新生23d小鼠共24只,分為對(duì)照組、BCG組和IL12+重組BCG接種組,每組8只。BCG組給以BCG(上海生物制品研究所,批號(hào)2005030211,購(gòu)于重慶市渝中區(qū)疾控中心)1105CFU/只腹腔、皮下聯(lián)合注射；IL12+重組BCG以rBCG1105CFU/只腹腔、皮下聯(lián)合注射；生后滿4周無(wú)菌取脾臟進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.2方法121IL12+重組BCG的構(gòu)建及鑒定先構(gòu)建表達(dá)IL12的穿梭質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化入BCG(本部分實(shí)驗(yàn)由重慶醫(yī)科大學(xué)微生物教研室完成)。122胞內(nèi)細(xì)胞因子（IFN、IL）的流式檢測(cè)無(wú)菌取脾,在300目不銹鋼網(wǎng)上少量PBS沖洗下輕輕研磨制成單細(xì)胞懸液,RBC裂解液裂解紅細(xì)胞,PBS洗2次,細(xì)胞懸浮與RPMI1640（含100mL/LFBS）,調(diào)整細(xì)胞密度為2109/L,臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)在95%以上。取1mL脾細(xì)胞（2109/L加入7.5L1mg/L佛波酯(PMA)工作液、6L50mg/L離子霉素(Ionomycin)工作液、1000U/LBDGolgiStopTM蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（內(nèi)含Monensin2.0mol/L終濃度）,混勻,3750mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h,PBS洗2次,加入0.75gRatantimouseCD3:PECy5、1.5gRatantimouseCD8FITC(熒光抗體均為BDParmigen公司產(chǎn)品,下同),室溫避光孵育15min,分成3管,每管100L已染色的脾細(xì)胞,加入500LFixperm中的固定液室溫避光孵育15min,再加入100LFixperm中溶血破膜液,1200r/min,洗2次,加100L大鼠血清封閉30min,同時(shí)分別加入RatIgG1controlPE、RatantimouseIFNPE、RatantimouseIL4PE0.5g室溫避光孵育15min；PBS洗2次,0.5mLPBS重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)(流式細(xì)胞儀型號(hào)BectonDickinson,USA)。123胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3的流式檢測(cè)取1106細(xì)胞,分別加入RatantimouseCD4PECy5(BDParmigen),混勻避光孵育20min,用細(xì)胞染色緩沖液洗1次,加1mL1Foxp3Fix/Perm緩沖液(Biolegend)混勻,室溫避光孵育20min,離心棄上清,1Foxp3Perm緩沖液(Biolegend)洗2次,用1Foxp3Perm緩沖液重懸細(xì)胞,室溫避光孵育15min,離心棄上清,用1foxp3Perm緩沖液重懸,分成2管,分別加入5L(1g)AlexaFluor488RatantimouseFOXP3、AlexaFluor488RatantimouseIgG（作為對(duì)照抗體）(Biolegend)室溫避光孵育30min,用細(xì)胞染色緩沖液洗2次,用0.5mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞上機(jī)分析。124統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各組檢測(cè)結(jié)果均以xs表示,先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊者各組樣本均數(shù)間的比較采用LSDt檢驗(yàn),P<；0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果21脾細(xì)胞胞內(nèi)IFN的檢測(cè)BCG組、重組BCG組Th1、Tc1及總IFN明顯高于對(duì)照組（P<；0.05或P<；0.01,表1）,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但二組間比較沒(méi)有區(qū)別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>；0.05),表明BCG和重組BCG于新生期接種皆能誘導(dǎo)Th1、Tc1亞群發(fā)育。表1各組胞內(nèi)IFN檢測(cè)分析（略）Tab1AnalysisofintracellularIFNamongallgroupsaP<；0.05,bP<；0.01vscontrolgroup.2.2脾細(xì)胞胞內(nèi)IL4的檢測(cè)各組Th2、Tc2及總IL4水平之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>；0.05,表2）。表2各組胞內(nèi)IL4檢測(cè)分析（略）Tab2AnalysisofintracellularIL4amongallgroups2.3Th1/Th2、Tc1/Tc2及IFN/IL比值BCG組、rBCG組Th1/Th2、Tc1/Tc2及總IFN/IL比值明顯高于對(duì)照組（表3）。表3各組Th1/Th2、Tc1/Tc2及IFN/IL比值變化（略）Tab3ChangesoftheratioofTh1/Th2、Tc1/Tc2、totalIFN/ILamongallgroupsaP<；0.05,bP<；0.01vscontrolgroup.24CD4+FoxP3+T細(xì)胞在小鼠脾細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)照組、BCG組及rBCG組脾細(xì)胞中CD4+FoxP3+T細(xì)胞數(shù)分別為（8.32.4）%、（9.23.2）%和（9.73.4）%,各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>；0.05）。3討論BCG通過(guò)能誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答而防止哮喘的發(fā)生4,5,但對(duì)人類哮喘的預(yù)防作用存在爭(zhēng)議6。我們前期研究發(fā)現(xiàn),新生期皮下接種BCG后不僅能促進(jìn)Th1免疫功能成熟的作用,而且能通過(guò)誘導(dǎo)Tr1發(fā)揮抗哮喘作用1；早期接種BCG能抑制致敏原誘發(fā)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥、支氣管周圍炎癥和氣道高反應(yīng)性；但作為誘發(fā)或加重小兒哮喘最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素之一RSV能逆轉(zhuǎn)新生期BCG接種的抗哮喘作用2,其機(jī)制尚不清楚。如何增強(qiáng)BCG誘導(dǎo)Th1/Tr作用,使其能有效抵抗RSV干擾、預(yù)防哮喘發(fā)生,值得進(jìn)一步的研究。IL12主要由DC和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,能夠促進(jìn)Th1分化發(fā)育,誘導(dǎo)CD4+/CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等產(chǎn)生IFN,是銜接天然免疫和特異性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子。皮下注射重組IL12能減少哮喘患者嗜酸性粒細(xì)胞水平,但降低氣道高反應(yīng)性的作用不明顯,也不能改善隨后的哮喘癥狀,并有嚴(yán)重的副作用3。但I(xiàn)L12重組乳酸菌卻能明顯的逆轉(zhuǎn)哮喘小鼠Th1/Th2失衡,降低氣道高反應(yīng)性,減輕氣道炎癥7,8。提示將IL12與某些細(xì)菌載體重組,使其在免疫應(yīng)答的局部產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用且可避免其副作用。由此,我們將IL12與BCG重組以避免直接使用重組IL12的副作用又能增強(qiáng)BCG的Th1/Tr應(yīng)答。本研究中我們?cè)趩渭?xì)胞水平分析了rBCG新生期接種對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞亞群的影響,結(jié)果表明小鼠新生期接種BCG和rBCG均能引起明顯的Th1、Tc1細(xì)胞比例增加,表現(xiàn)為CD3+CD8-IFN+、CD3+CD8+IFN+T細(xì)胞比例的增加,說(shuō)明新生期接種BCG和rBCG均能促進(jìn)小鼠Th1、Tc1細(xì)胞亞群的發(fā)育。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞包括CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、以分泌高水平IL10為特征的Tr1和以分泌高水平TGF為特征的Th3細(xì)胞,其中FoxP3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育和功能中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,CD4+FoxP3+細(xì)胞可以代表絕大多數(shù)具有調(diào)節(jié)/抑制功能的T淋巴細(xì)胞9。與我們以前的結(jié)果相似10,本研究結(jié)果表明新生期接種BCG和rBCG并不能誘導(dǎo)脾臟產(chǎn)生更多的CD4+FoxP3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。由于沒(méi)有對(duì)CD4+FoxP3+T細(xì)胞的功能進(jìn)行深入的研究,并不排出新生期接種BCG后其功能有所變化。但BCG和rBCG組各個(gè)指標(biāo)沒(méi)有明顯差異,重組后的rBCG并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果。我們考慮與以下因素有關(guān):一是與IL12重組質(zhì)粒在體內(nèi)分泌IL12不足,不足以影響機(jī)體整體免疫應(yīng)答,二是目前檢測(cè)手段還不能區(qū)別二組差異。還需進(jìn)一步研究rBCG在體內(nèi)的功能。綜上所述,新生期接種rBCG能促進(jìn)小鼠脾臟Th1、Tc1細(xì)胞亞群的發(fā)育,提示在嬰幼兒早期階段接種rBCG能促進(jìn)個(gè)體免疫系統(tǒng)的成熟,向Th1、Tc1方向發(fā)育,為在嬰幼兒早期階段應(yīng)用rBCG來(lái)預(yù)防變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生提供一定的理論基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1李睿,劉恩梅,楊錫強(qiáng),等.卡介苗新生期接種和呼吸道合胞病毒感染對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性哮喘的聯(lián)合作用J.中華兒科雜志,2006,44(6):420-424.2LiR,YangX,WangL,etal.RespiratorysyncytialvirusinfectionreversedantiasthmaeffectofneonatalBacillusCalmetteGuerinvaccinationinBALB/cmiceJ.PediatrRes,2006,59(2):210-215.3BryanSA,OConnorBJ,MattiS,etal.Effectsofrecombinanthumaninterleukin12oneosinophils,airwayhyperresponsiveness,andthelateasthmaticresponseJ.Lancet,2000,356(9248):2149-2153.4SmitJJ,FolkertsG,NijkampFP.Mycobacteria,genesandthehygienehypothesisJ.CurrOpinAllergyClinImmunol,2004,4(1):57-62.5BarlanI,BahcecilerNN,AkdisM,etal.BacillusCalmetteGuerin,Mycobacteriumbovis,asanimmunomodulatorinatopicdiseasesJ.ImmunolAllergyClinNorthAm,2006,26(2):365-377.6OmarMT,AhmedSH,SarkisNN.Astudyoftheassociati