VEGF及CD147在單核細胞來源的泡沫細胞中表達動力學的研究作者：岳紅紅朱平吳振彪樊春梅趙清波鮑煒【摘要】目的：研究CD147,VEGF在單核細胞來源的泡沫細胞中的表達動力學的,探討CD147，VEGF與動脈粥樣硬化的關系.方法:以氧化型低密度脂蛋白誘導，建立人單核細胞系（U937細胞）分化的泡沫細胞模型,通過油紅O特殊染色的形態(tài)學鑒定.將U937細胞在不同濃度氧化型低密度脂蛋白（oxLDL,0，25，50，100，200mg/L）條件下培養(yǎng)48h；在100mg/LoxLDL條件下，在培養(yǎng)的不同時間點（0，6，12，24，48h）分別收集泡沫細胞和培養(yǎng)上清，采用流式細胞術檢測細胞膜表面CD147，ELISA檢測培養(yǎng)上清中VEGF的表達和RTPCR檢測mRNA表達水平.結果:CD147及VEGF表達出現最高峰時的oxLDL濃度分別為25mg/L和50mg/L；與100mg/L的氧化型低密度脂蛋白作用6,48h后，CD147，VEGF表達分別出現最高峰；VEGFmRNA水平出現最高峰時，oxLDL作用濃度及時間分別為200mg/L，48h.CD147mRNA水平出現最高峰時oxLDL作用濃度及時間分別為25mg/L，6h，此后，mRNA水平不變.結論:VEGF及CD147在單核細胞來源的泡沫細胞表達均升高；CD147表達上調早于VEGF，低濃度oxLDL促進CD147表達，高濃度促進VEGF的表達；U937泡沫細胞中VEGF的mRNA水平與oxLDL的作用濃度及時間成正相關，泡沫細胞中CD147的mRNA與oxLDL的作用濃度及時間無關.【關鍵詞】CD147；血管內皮生長因子類；泡沫細胞；動脈硬化0引言泡沫細胞（foamcells）是動脈粥樣硬化斑塊內出現的特征性病理細胞，其主要來源有兩個，一是血液單核細胞，二是血管中膜平滑肌細胞.一般認為在動脈粥樣硬化形成的早期，血液中單核細胞進入內皮下間隙，在內膜下被氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、炎性介質等激活后分化為巨噬細胞，后者通過其表面的清道夫受體吞噬oxLDL形成泡沫細胞，并逐漸演變成脂紋及粥樣斑塊1.動脈粥樣硬化不僅是脂代謝紊亂的過程，也是炎癥反應的過程.因此，泡沫細胞是粥樣斑塊中重要的炎癥細胞2.長期的慢性炎癥性疾病可導致機體內免疫分子、炎癥因子等炎性介質水平明顯升高3.不但可調節(jié)機體免疫反應，而且能夠作用于外周組織導致一系列致動脈粥樣硬化代謝功能改變4.研究表明,在泡沫細胞形成過程中CD147分子及VEGF的表達上調.此外，新近在動脈粥樣硬化斑塊中也檢測到CD147分子及血管內皮生長因子（VEGF）等炎癥介質,提示其可能參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生5-6.鑒于CD147分子及VEGF在炎性斑塊中的作用，且目前鮮有對其在泡沫細胞形成過程中表達變化的研究，我們建立人類單核細胞（U937）源性泡沫細胞模型7，進一步探討CD147，VEGF等炎性介質在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用.1材料和方法1.1材料低密度脂蛋白（LDL）及VEGF的ELISA檢測試劑盒（CHENICON，US）；硫代巴比妥酸（TBA）（南京建成生物工程研究所）；FITC標記小鼠抗人CD147（RD，US）.FACSCalibur(BectomDiekinson,FranklinLakes,NJ)流式細胞儀.1.2方法1.2.1oxLDL的制備將LDL置于含10mol/LCuSO4的磷酸緩沖液（PBS）中,37透析12h后,在1g/LEDTA的PBS中透析24h,0.2m微孔濾膜過濾除菌備用.用硫代巴比妥酸物質的含量鑒定oxLDL,氧化后每毫克膽固醇中丙二醛含量為38.7mol/g.1.2.2細胞株及泡沫細胞模型的建立U937細胞株系人類單核細胞系,由中國科學院上海細胞生物研究所提供，在含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中懸浮生長,置于50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).將細胞稀釋至51012/L，種于24孔板中每孔1mL，分別與不同濃度oxLDL（0,25,50,100,200mg/L）共孵育24h.將相同密度的U937細胞與oxLDL(100mg/L)共孵育不同時間（0,3,6,12,24,48h）.U937泡沫細胞形態(tài)通過新配制的3ml/L油紅O染色鑒定，胞質內出現紅染顆粒的為脂質染色陽性.1.2.3細胞膜表面CD147流式檢測將孵育后細胞懸液，經PBS洗滌2次后調整細胞密度為1109/L.取100L細胞懸液加FITC標記的小鼠抗人CD147mAb2.5L，充分震蕩混勻后室溫避光靜置20min.經PBS洗滌后,再加入300L的PBS.通過FACSCalibur流式細胞儀檢測，使用CellQuest（BectonDickinson）軟件分析.1.2.4ELISA檢測VEGF分泌含量按照試劑盒操作步驟,以RPMI1640培養(yǎng)基作為空白,將不同濃度的VEGF標準品在酶標儀（美國BIOIAD公司出品）中檢測并繪制VEGF標準曲線.將各組細胞離心，上清進行ELISA檢測,通過標準曲線查得相應VEGF含量.1.2.5CD147及VEGFmRNA水平檢測Trizol提取總RNA，以2LRNA作為模板進行逆轉錄，PCR擴增，以GAPDH作為內參照.VEGF引物序列：上游5CTGCTGTCTTGGGTGCATTG3，下游5GGCCTTGGTGAGGTTTGATCCG3，擴增產物為334bp；GAPDH引物序列上游5TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3，下游5AGATCCACAACGGATACTT3，擴增產物為360bP.PCR反應條件：94變性30s，55退火30s，72延伸30s，持續(xù)25個循環(huán).CD147引物序列:上游5ACATCAACGAGGGGGAGACG3,下游5GGCTTCAGACAGGCAGGACA3，擴增產物為480bp.PCR反應條件：94變性30s，57退火30s，72延伸90s，持續(xù)25個循環(huán).統(tǒng)計學處理：采用統(tǒng)計軟件包進行數據分析，計量數據用xs表示.組間均屬比較用方差分析及Dunnettt兩兩比較檢驗，P<；0.05有統(tǒng)計學意義.2結果2.1U937泡沫細胞的鑒定光鏡下對照組細胞（U937）內無紅染顆粒，而處理組細胞體積增大，細胞質內可見較多的紅染顆粒，提示細胞內脂質成分增加.2.2CD147分子在U937泡沫細胞膜表面表達的變化流式細胞術顯示,與對照組（U937細胞）相比，U937泡沫細胞膜表面CD147表達的平均熒光強度升高.濃度作用曲線顯示，當oxLDL作用濃度為25mg/L時，U937泡沫細胞膜表面CD147表達強度出現最高峰,較對照組升高約1.6倍（P<；0.01，n=3）,之后其表達強度逐漸下降（圖2）.時間曲線表明U937細胞與oxLDL80mg/L作用6h后膜表面CD147表達強度出現最高峰，較對照組升高約2.3倍（P<；0.01,n=3），之后其表達強度逐漸下降.2.3U937泡沫細胞中VEGF的表達ELISA檢測顯示，細胞培養(yǎng)上清中VEGF的蛋白分泌含量與oxLDL作用濃度成正比.濃度曲線表明U937細胞在與200mg/LoxLDL作用后，VEGF分泌水平達峰頂，較對照組升高約2.1倍（aP<；0.05，bP<；0.001,n=3，圖4）.時間曲線顯示，U937細胞與oxLDL100mg/L作用48h后VEGF分泌水平達峰頂，較對照組升高約2.43倍（aP<；0.05，bP<；0.01,n=3，圖5）.2.4CD147及VEGFmRNA的表達水平RTPCR結果顯示，當U937細胞與25mg/LoxLDL的作用后CD147mRNA表達水平最高，之后其水平保持不變.當oxLDL的作用濃度為200mg/L時VEGFmRNA表達水平最高（圖6）.U937細胞與oxLDL100mg/L作用6h后CD147mRNA表達最高，之后其水平保持不變.作用48h后VEGFmRNA表達最高（圖7）.3討論動脈粥樣硬化是一個以修飾的脂質、單核細胞及富含膽固醇酯的泡沫細胞聚集為特征的復雜的病理過程，目前認為動脈粥樣硬化也是一個慢性炎癥反應過程8.在粥樣斑塊中，泡沫細胞不僅是一種清道夫細胞，也是一種炎癥調節(jié)細胞.CD147及VEGF蛋白及mRNA水平在泡沫細胞中的上調,提示在在粥樣斑塊中，CD147及VEGF可能參與了泡沫細胞形成的炎癥反應過程9.CD147是一種新發(fā)現的細胞表面黏附分子,又稱為細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellularmatrixmetalloproteinaseinducerEMMPRIN),可以刺激成纖維細胞的幾種MMP的合成，參與基質的降解10.Young9等通過免疫組化在人動脈內膜粥樣硬化斑塊富含巨噬細胞的區(qū)域中檢測到CD147分子.在人心衰模型中，CD147與a31整合素形成復合體，通過外部信號及上調局部MT1，MMP的表達誘導MMP的產生從而降解基質，引發(fā)斑塊的破裂促進心衰的發(fā)生.這些研究提示，CD147分子可能在動脈粥樣硬化的發(fā)生中有著非常重要的作用9.是迄今為止發(fā)現的唯一具有特異性促進血管內皮細胞有絲分裂作用的生長因子,并具有增加血管通透性的作用.VEGF的增加促進了動脈粥樣硬化斑塊內的血管形成,由于在血管形成的過程中,細胞粘附分子等產生增加,且由此促進炎性細胞對血管壁的粘附,進而加重動脈粥樣硬化,并形成惡性循環(huán)11.我們建立人類單核細胞（U937）源性泡沫細胞模型6，采用流式細胞術、ELASA及RTPCR等方法檢測，分析CD147，VEGF在U937泡沫細胞中的表達變化.研究發(fā)現,CD147表達出現最高峰時的oxLDL濃度為25mg/L，作用時間為6h.這表明短時間低濃度oxLDL可能促進單核細胞中CD147的表達,之后CD147表達逐漸降低,表明CD147的上調可能是單核細胞對oxLDL刺激后短期的急性反應，CD147可能在早期的泡沫細胞形成過程中起到了重要的作用.與之相反,VEGF表達出現最高峰時的oxLDL濃度為200mg/L，作用時間為24h.相比CD147，VEGF表達出現最高峰時需要較高濃度的oxLDL及較長的作用時間.這表明VEGF的表達可能滯后于CD147，VEGF可能是在動脈粥樣硬化的發(fā)生中繼CD147上調之后持續(xù)發(fā)揮作用的炎癥因子.CD147，VEGF在單核細胞來源泡沫細胞中不同表達提示oxLDL可能是通過不同信號通路調節(jié)VEGF與CD147在單核/巨噬細胞中的表達.此外,我們還發(fā)現單核細胞與低濃度oxLDL（25mg/L）共孵育后CD147蛋白及mRNA表達上調，但此后隨著oxLDL濃度的增加，泡沫細胞表面CD147分子逐漸減少，而在此過程中其mRNA水平則保持不變.推測這可能是由于CD147分子從泡沫細胞膜表面脫落所致.這些假設還需要在今后的實驗中進一步研究.長期慢性炎癥可導致機體內一些免疫分子及細胞因子的水平明顯升高，不但可調節(jié)機體免疫反應，而且能夠作用于外周組織加速動脈粥樣硬化的發(fā)展2,12-13.如類風濕關節(jié)炎、紅斑狼瘡等.但免疫分子、炎癥因子等炎性介質促進動脈粥樣硬化發(fā)生的其機制目前尚不甚清楚.我們通過研究CD147，VEGF在單核細胞來源的泡沫細胞中的表達的變化，推測其表達可能通過與oxLDL的濃度時間依賴關系，從而發(fā)揮其生物學功能.充分認識這些機制將有助于進一步闡明炎性介質在動脈粥樣硬化中的發(fā)病機制.【參考文獻】1HanssonGK,RobertsonAK,SderbergNauclrC.InflammationandatherosclerosisJ.AnnuRevPathol,2006,1:297-3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