通心絡(luò)膠囊干預(yù)載脂蛋白E基因敲除小鼠MMP-1、MMP-9及TIMP1的研究StudyofTongxinluoCapsuleinInterventionofApolipoproteinEGeneKnockingOutMMP-1,MMP-9andTIMP1inMice韓旭李七一夏衛(wèi)軍賴仁勝陳小虎郭宏敏趙惠HanXu,LiQiyi,XiaWeijun,LaiRensheng,ChenXiaohu,GuoHongmin,ZhaoHui江蘇省中醫(yī)院（中國(guó)210029）TraditionalChineseMedicineHospitalinJiangsuProvince(China,210029)中圖分類號(hào)：R285.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：18180086（2010）04摘要：目的通過通心絡(luò)膠囊對(duì)載脂蛋白E基因敲除ApoE（-/-）模型組小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP1）水平等指標(biāo)的干預(yù)變化，探究其治療冠心病（CHD）的機(jī)理。方法將40只ApoE（-/-）小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，建立冠狀動(dòng)脈粥樣硬化（AS）模型，隨機(jī)分為模型組等5組，分別給予辛伐他汀及不同劑量的通心絡(luò)膠囊進(jìn)行干預(yù)，另選8只同系的小鼠作為正常對(duì)照組。通過對(duì)模型組小鼠血清MMP-1、MMP-9和TIMP1水平的觀察，比較分析通心絡(luò)膠囊對(duì)ApoE（-/-）小鼠冠狀A(yù)S的調(diào)節(jié)作用并探討其機(jī)理。結(jié)果通心絡(luò)膠囊高劑量組小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型組，而TIMP1水平高于模型組，與模型組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01）。通心絡(luò)膠囊中劑量組小鼠血清MMP-9水平低于模型組，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論通心絡(luò)膠囊具有抑制血管重構(gòu)和穩(wěn)定斑塊的作用。關(guān)鍵詞：通心絡(luò)膠囊；ApoE（-/-）小鼠；冠狀A(yù)S；MMP-1；MMP-9；TIMP1；干預(yù)AbstractObjectivesToinvestigatemechanismofTongxinluoCapsulemanagingcoronaryheartdisease(CHD)byobservingchangesresultingfrominterventionofapolipoproteinEgeneknockingoutApoE(-/-)MMP-1,MMP-9andTIMP1inmicemodel.Method40ApoE(-/-)mice,asexperimentalgroup,wereusedtoestablishcoronaryarteriosclerosis(AS)modelandthenwererandomlydividedinto5modelgroups.SimvastatinandTongxinluoCapsuleatdifferentdosagewereadministratedtomicerespectivelyasinterventionand8miceofsamekindwereselectedascontrolgroup.TongxinluoCapsuleseffectinregulatingcoronaryASinApoE(-/-)miceanditsmechanismwerecomparedandanalysedduringtheexperimentbyobservingserumMMP-1,MMP-9andTIMP1levelsinmodelmice.ResultsingroupadministratedhighdoseTongxinluoCapsule,serumMMP-1andMMP-9levelwerelowerthanthatinmodelgroupwithoutintervention,butTIMP1washigher.Thedifferenceissignificantstatistically(P0.05orP0.01).InthegroupadministratedmoderatedosageTongxinluoCapsule,theserumMMP-9waslowerthanthatinmodelgroupwithoutintervention,whichalsohasstatisticalsignificance(P0.05).ConclusionTongxinluoCapsuleisofsomeeffectintheinhibitionofvascularremodelingandstabilizationofplaques.KeywordsTongxinluoCapsule,ApoE(-/-)mice,coronaryAS,MMP-1,MMP-9,TIMP1,intervention1實(shí)驗(yàn)材料1.1藥品與試劑通心絡(luò)膠囊：石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每粒0.38克。批號(hào)：20060501。MMP-1、MMP-9、TIMP1測(cè)定試劑盒，購(gòu)自晶美生物工程有限公司，美國(guó)OrionoDiagostica公司生產(chǎn)，批號(hào)：00604。膽固醇，上海生化試劑廠，批號(hào)：051124。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ApoE（-/-）小鼠，40只，鼠齡8周齡，雌雄各半，體重18-22g。（品系C57BL/6J，購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室）由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。同遺傳背景C57BL/6J小鼠8只，鼠齡8周齡，雌雄各半，體重18-22g。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2002-0001。南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2002-0123。1.3實(shí)驗(yàn)儀器SYSMAX全自動(dòng)生化分析儀日本SYSMEX公司TGL16G臺(tái)式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠UN754分光光度計(jì)上海第三分析儀器廠JA2003分析天平上海天平儀器廠AUP-2-35G-01實(shí)驗(yàn)室級(jí)專用超純化水機(jī)重慶頤洋實(shí)業(yè)有限公司DKZ2型電熱恒溫振蕩水槽上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司LDZ52低速自動(dòng)平衡離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠LRB-12752計(jì)數(shù)器芬蘭1.4實(shí)驗(yàn)條件小鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫202。2實(shí)驗(yàn)方法2.1高脂飼料配制方法以5%膽固醇，10%豬油，0.1%丙基硫氧嘧啶，加入小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料粉中。飼料粉經(jīng)充分混合后由江蘇省青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)加工成顆粒飼料。2.2ApoE（-/-）小鼠冠狀動(dòng)脈粥樣硬化建立ApoE（-/-）小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后給予高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)12周。同時(shí)選取相同遺傳背景的8周齡正常C57BL/6J小鼠8只，雌雄各半作為正常對(duì)照組，2.3給藥方法和劑量2.3.1正常對(duì)照組喂普通顆粒小鼠飼料，同時(shí)給予等量蒸餾水。2.3.2模型組：喂高脂飼料，同時(shí)給予等量蒸餾水。2.3.3通心絡(luò)膠囊1組除與模型對(duì)照組相同外，給予通心絡(luò)膠囊2g（生藥）/kg體重。2.3.4通心絡(luò)膠囊2組除與模型對(duì)照組相同外，給予通心絡(luò)膠囊4g（生藥）/kg體重。2.3.5通心絡(luò)膠囊3組除與模型對(duì)照組相同外，給予通心絡(luò)膠囊8g（生藥）/kg體重。2.3.6辛伐他汀組除與模型對(duì)照組相同外，給予辛伐他汀0.05g/kg體重。2.4血清MMP-1、MMP-9、TIMP1濃度水平測(cè)定采用定量夾心酶免疫分析技術(shù)。3統(tǒng)計(jì)分析方法描述性統(tǒng)計(jì)分析，定性指標(biāo)以頻數(shù)表，百分率或構(gòu)成比描述；定量指標(biāo)以均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)差描述。兩組對(duì)比分析，定性資料采用卡方檢驗(yàn)，F(xiàn)isher精確概率法，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，CMH2檢驗(yàn)。定量資料符合正態(tài)分布用t檢驗(yàn)（組間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，以0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，方差不齊時(shí)選用Satterthwaite方法進(jìn)行校正的t檢驗(yàn)），不符合正態(tài)分布用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。假設(shè)檢驗(yàn)統(tǒng)一使用雙側(cè)檢驗(yàn)，給出檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量及其對(duì)應(yīng)的P值。以P0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P0.01作為有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上統(tǒng)計(jì)分析均用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果從表1中可見，ApoE（-/-）小鼠造模后12周，模型組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平顯著升高，而TIMP1水平顯著降低，與正常組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01）。通心絡(luò)膠囊高劑量組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型組，而TIMP1水平高于模型組，與模型組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01）。通心絡(luò)膠囊中劑量組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9水平低于模型組，與模型組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。表1通心絡(luò)膠囊對(duì)ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1、MMP-9及TIMP1水平的影響（g/L，XS）分組劑量（g/Kg）動(dòng)物數(shù)（n）MMP-1MMP-9TIMP1正常組8290.8815.36482.6347.65157.8821.56模型組-8330.6338.33805.63120.1463.3811.76低劑量組28308.8850.30656.6383.23*70.2522.63中劑量組48312.1338.68666.88137.89*87.2530.41高劑量組88283.6338.64*648.88112.15*93.8825.48*辛伐他汀組0.058293.7528.71*568.50104.49*88.7524.59*注：與正常組相比，P0.01，P0.05；與模型組比較，*P0.05，*P0.01。5討論AS的形成涉及脂質(zhì)代謝紊亂、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的遷移和增殖等。大量研究已證實(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成或降解失衡是AS形成過程中十分重要的環(huán)節(jié)，AS形成過程也是ECM重建即血管重構(gòu)的過程2?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一族可降解ECM膠原的重要蛋白酶類，在AS發(fā)生期可促進(jìn)VSMC向內(nèi)皮的移位，其在分解冠脈粥樣斑塊纖維帽ECM，使纖維帽變薄、易于破裂方面起著重要作用3。研究發(fā)現(xiàn)，粥樣斑塊組織中，尤其是纖維斑塊的肩部可檢出大量巨噬細(xì)胞及多種MMPs。在泡沫化過程中多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)其他細(xì)胞分泌大量MMPs進(jìn)一步降解ECM，促使脂質(zhì)條紋的形成并加速粥樣斑塊的發(fā)展4。MMP-1是MMPs家族重要的一員，主要降解間質(zhì)膠原、X型膠原和蛋白聚糖的核心蛋白。研究表明MMP-1的表達(dá)及活性增強(qiáng)與CHD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)5。Nikkari等6報(bào)道人類AS斑塊脂質(zhì)核心強(qiáng)烈表達(dá)MMP-1，通過降解型和型膠原蛋白，使纖維帽變薄，促進(jìn)粥樣斑塊進(jìn)入不穩(wěn)定狀態(tài)。另外，原位酶譜實(shí)驗(yàn)證明人的粥樣斑塊，尤其是機(jī)械張力最高之處，MMP-1表達(dá)增加7倍，而該處又是斑塊破裂常見之處，據(jù)此推測(cè)，在這些部位基質(zhì)降解過度同時(shí)又有機(jī)械張力過度而使纖維帽破裂7。MMP-9是MMPs家族中明膠酶的一種，研究表明8，MMP-9與AS關(guān)系密切，可以高效降解基底膜的主要成分IV型膠原。Brown等9報(bào)道MMP-9通常在新近斑塊破裂的冠狀動(dòng)脈旋切標(biāo)本中表達(dá)。Peterson等10研究發(fā)現(xiàn)MMP-9含量在不穩(wěn)定心絞痛病人斑塊組織中明顯高于穩(wěn)定型心絞痛病人，MMP-9的過表達(dá)，可使ECM降解活性增強(qiáng)，從而降低斑塊強(qiáng)度，促使斑塊破裂。冠狀動(dòng)脈內(nèi)徑狹窄程度也與MMP-9呈正相關(guān)。TIMP1為MMPs的組織抑制劑11，Inokubo等12.13.14認(rèn)為正常內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞有TIMP1和MMP9的表達(dá)，且兩者處于平衡狀態(tài)，以共同維持ECM合成與降解相對(duì)平衡，使斑塊趨向穩(wěn)定，不易破裂。MMP-9升高、TIMP1的降低預(yù)示著硬化斑塊的不穩(wěn)定或破裂。在急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生過程中，MMP-9表達(dá)增加大于TIMP1表達(dá)增加，使冠狀A(yù)S斑塊纖維帽的膠原降解大于合成，導(dǎo)致斑塊脆性增加并最終破裂15。George16研究證實(shí)用TIMP1或調(diào)節(jié)其與MMP-9之間的比例可起到治療AS的作用。我們既往研究提示：通心絡(luò)膠囊具有抑制ApoE(-/-)小鼠冠狀A(yù)S的作用17，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥還能通過抑制MMP-1、MMP-9和升高TIMP1血中濃度而具有抑制血管重構(gòu)和穩(wěn)定斑塊作用，且其強(qiáng)度與藥量的大小有關(guān)，推測(cè)其機(jī)制可能為：抑制VSMC的增殖和移行，調(diào)節(jié)ECM的合成和降解，穩(wěn)定斑塊纖維帽。參考文獻(xiàn)：1JnaLBreslwoMousemodelsofatheroselerosisJSeinece1996，V0L272：685-6882溫進(jìn)坤,韓美.基質(zhì)金屬蛋白酶與血管壁細(xì)胞外基質(zhì)重建J.生命的化學(xué),2002；22(5):461-463.3ShahPK,FalkE,BadimonJJ,etal.Humanmonocyte-derivedmacrophagesinducecollagenbreakdowninfibrouscapsofathero-scleroticplaque:potentialroleofmatrix-degradingmetal-oproteinasesandimplicationsforplaqueruptureJ.circulation,1995,92:1565-1569.4SmeglinA,FrishmanWH.Elastinolyticmatrixmetallopro-teinasesandtheirinhibitorsastherapeutictargetsinatheroscleroticplaqueinstabilityJ.CardiologyinReview,2004；12:141-150.5GalinaK,UweS,ElenaR,etalEvidenceforincreasedcollagenolysisbyinterstitialcollagenases-land-3invulnerablehumanathero-matousplaquesJcirculation,1999,99:25032509.6NikkariST,OBrienKD,FergusonM,HatsukamiT,WelgusHG,AlpersCE,etal.Interstitialcollagenase（MMP-1）expressioninhumancarotidatherosclerosisJ.Circulation,1995,92:1393-398.7LeeRT,LibbyPTheunstableatheromaJArteriosclerThrombVascBiol,1997,17:18591879.8PollanenPJ,KarhunenPJ,MikkelssonJetal.Coronaryarterycomplicatedlesionareaisrelatedtofunctionalpolymorphismofmatrixmetalloproteinase9gene:anautopsystudyJ.Arterios-clerThrombVascBiol.2001,21:1446-1450.9BrownDL,HibbsMS,KearneyM,etal.Identificationof92-KDgelatinaseinhumancoronaryatheroscleroticlesions,AssociationofactiveenzymesynthesiswithunstableanginaJ.Circulation,1995；91:2125-2131.10PetersonM,PorterKE,LoftusIM,etal.MarimastatinhibitsneointimalthickeninginamodelofhumanarterialintimalhyperplasiaJ.EurJVascEndovascSurg.2000,19:461-467.11CaiW,VosschulteR,Afsah-HedjriA,etal.AlteredbalancebetweenextracellularproteolysisandantiproteolysisisassociatedwithadaptivecoronaryarteriogenesisJ.JMolCellCardiol,2000,32:997-1011.12InokuboY,HanadaH,IshizakaH,etal.Plasmalevelsofmatrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1areincreasedinthecoronarycirculationinpatientswithacutecoronarysyndromeJ.AmHeartJ,2001,141:211-217.13DolleryCM,HumphriesSE,McClellandA,etal.Express