血清堿性磷酸酶活性測定,磷酸苯二鈉法,1,主要內(nèi)容：,實驗?zāi)康膶嶒炘韺嶒炂鞑呐c試劑實驗操作計算臨床意義注意事項,2,酶活力：也稱酶活性，是表示催化某一特定反應(yīng)的能力?？梢杂迷谝欢l件下所催化的某一特定化學(xué)速度表示。酶催化反應(yīng)速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。底物減少量或生成物增加量酶促反應(yīng)速度=單位時間,基本概念,3,實驗?zāi)康?掌握酶活力測定的一般方法掌握血清中ALP活力測定方法與臨床意義,4,思考,如何測定酶活力的大??？,酶活力：,酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，其衡量的標(biāo)準(zhǔn)是酶促反應(yīng)速度的大小。,酶促反應(yīng)的速度：,常用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。,5,酶活力測定方法,終止測定法（或定時法）：*本次實驗的方法通常是酶作用一段時間后，加入強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測定這段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計算酶促反應(yīng)的平均速度。連續(xù)監(jiān)測法：連續(xù)監(jiān)測法是指每隔一定時間（260s），連續(xù)多次測定酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物量隨時間變化的數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計算酶活性濃度的方法。適用于自動生化分析儀目前已取代固定時間法而成為臨床實驗室測,6,堿性磷酸酶（ALP）是一組在堿性環(huán)境中水解磷酸酯的酶類。來源：廣泛分布于人體的骨、腎、肝、腸、血清、膽汁等部位，但骨骼、牙齒、腎和肝臟中含量較多。正常人血清中ALP主要來源于肝臟。是一種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團的過程稱為去磷酸化或脫磷酸化。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中有最大活力。,什么是ALP？,7,實驗原理,堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二鈉，使之水解生成酚和磷酸。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化形成紅色醌類化合物，其顏色深淺與ALP活性成正比。磷酸苯二鈉+H2O苯酚+磷酸氫二鈉苯酚+4-氨基安替比林紅色醌亞胺衍生物,ALP,pH=10,鐵氰化鉀,8,試劑與儀器,器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可調(diào)式移液器，721E分光光度計，1cm比色皿，37恒溫水浴試劑：10.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH10.0)無水碳酸鈉6.36g，碳酸氫鈉3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800mL蒸餾水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。220mmol/L磷酸苯二鈉溶液先將500ml蒸餾水煮沸，迅速加入磷酸苯二鈉2.18g(磷酸苯二鈉如含2分子結(jié)晶水，則應(yīng)稱取2.54g)，冷卻后加氯仿2ml防腐，在4冰箱保存。（用剩的溶液不應(yīng)再倒回瓶中）3顯色液（鐵氰化鉀的硼酸溶液）稱取鐵氰化鉀2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸餾水400ml中，兩液混合后，加蒸餾水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出現(xiàn)藍綠色即棄去)。4酚標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.05mg/ml）購買合格的二級標(biāo)準(zhǔn)品。,9,實驗操作,取4支試管，如下操作：,立即混勻。用510nm波長（紅色醌物質(zhì)的最大吸收波長）比色，以蒸餾水調(diào)零點，讀取各管吸光度。*保持反應(yīng)時溫度是均衡的，37C,10,計算公式:,參考值:,成人：313Kings單位，兒童：528Kings單位。,ALP活力=,（A測定A對照）,（A標(biāo)準(zhǔn)A空白）,X,0.05,X,100（kings單位）,11,臨床意義,在臨床上，血清ALP測定常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標(biāo)。1.血清ALP活性升高肝膽疾病：阻塞性黃疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的損傷或疾病使成骨細胞內(nèi)所含高濃度的ALP釋放進入血液中，引起血清ALP活性增高，如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等。2.血清ALP活性降低:比較少見，主要見于呆小癥，重癥慢性腎炎、乳糜瀉、貧血、惡病質(zhì)等。,12,注意事項,酚標(biāo)準(zhǔn)液開后不能久置。底物液不能含有酚，若含酚則顯紅色，說明磷酸苯二鈉已分解，不宜使用。加入鐵氰化鉀后必須迅速混勻(為了改變PH來終止酶促反應(yīng)），否則有影響，偏大。鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩(wěn)定最后所顯色的作用。此液應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍綠色即作廢。,13,思考題,1.本次實驗是用的什么方法？終止劑是什么？為什么加入鐵氰化鉀硼酸液后必須迅速混勻？有何影響？答：終止法；終止劑是鐵氰化鉀硼酸液；硼酸改變了PH，使其不再處于最適PH。,B管與C管在實驗中有