目 錄摘 要2前 言3材料與方法4結(jié) 果8附圖片14討 論17參考文獻(xiàn)25英文摘要29致 謝30附：綜述31耳針、中藥對(duì)急性肺損傷大鼠海馬CA2區(qū)FOS蛋白表達(dá)與血漿IL-1含量的影響專業(yè)： 針灸推拿學(xué)姓名： 姚麗君導(dǎo)師： 呂明莊 教授 師晶麗 教授 摘要: 目的 建立急性肺損傷（ALI）大鼠模型，觀察耳針、中藥復(fù)方銀花合劑對(duì)ALI大鼠海馬CA2區(qū)FOS蛋白表達(dá)和血漿IL-1含量的影響，探討了耳針、銀花合劑防治ALI的可能機(jī)理。方法 采用油酸加內(nèi)毒素“二次打擊”方法復(fù)制大鼠 ALI模型。將54只wister大鼠隨機(jī)分為六組，分別為對(duì)照組、模型組、耳針組、中藥組、耳針+中藥組和地塞米松組，每組9只，并給與相應(yīng)的防治措施。測(cè)定參數(shù)為：(1) 頸動(dòng)脈取血，做血?dú)夥治觯?2) 肺組織濕重/干重(W/D)比值（右肺）。（3）放免法檢測(cè)血漿IL-1含量；（4）免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠海馬內(nèi)c-fos表達(dá),并測(cè)海馬CA2區(qū)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度(OD)值；（5）肺組織病理形態(tài)學(xué)分析。 結(jié)果 在光鏡下，模型組肺組織HE可見(jiàn)灶性出血，肺泡和肺間質(zhì)水腫，肺泡壁明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等急性肺損傷的表現(xiàn)。氧分壓降低，肺組織W/D比值及病理形態(tài)學(xué)積分增高，與對(duì)照組和防治組比較有顯著差異（p0.01）。血漿IL-含量在造模后較對(duì)照組顯著升高（p0.01），而防治組大鼠以上肺功能各項(xiàng)指標(biāo)得以改善，肺損傷較輕時(shí)，其IL-1含量亦隨之下降，與模型組相比有顯著差異(p0.01)；模型組較對(duì)照組大鼠海馬CA23區(qū)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的OD值下降顯著（p0.01），防治組OD值增高，與模型組相比有顯著差異（p0.01），其中OD值與c-fos表達(dá)強(qiáng)弱呈反比。 結(jié)論 大鼠海馬CA23區(qū)通過(guò)c-fos途徑參與調(diào)節(jié)ALI免疫調(diào)節(jié)過(guò)程；耳針和銀花合劑具有防治ALI的作用，其作用的可能機(jī)制是耳針、銀花合劑通過(guò)拮抗IL-1，抑制c-fos表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì) AIL大鼠的防治。關(guān)鍵詞：急性肺損傷、耳針、銀花合劑、FOS蛋白、IL-1前 言急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是一種在多種原發(fā)病和誘因作用下發(fā)生的以進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥為特征的急性呼吸衰竭。ALI是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)的早期表現(xiàn)，ARDS晚期多誘發(fā)或合并多臟器功能障礙綜合癥(MODS)，是臨床上常見(jiàn)的危重急癥，病死率仍高達(dá)50% 90% 1。ALI是由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞介導(dǎo)的肺臟炎癥反應(yīng)和炎癥失控所致的肺毛細(xì)血管膜損傷，主要病理表現(xiàn)為由肺微血管通透性增加所引起的肺水腫。雖然ALI發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，但ALI/ARDS有相同的定義和內(nèi)涵。自1967 Ashbaugh等報(bào)道成人呼吸窘迫綜合征以來(lái)已有近40年的時(shí)間，隨著失控的炎癥反應(yīng)引發(fā)MODS理論的出現(xiàn)，使人們對(duì)ALI/ARDS認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)向?qū)ρ装Y發(fā)生與調(diào)控的認(rèn)識(shí)，參與炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)累及到細(xì)胞與體液兩部分，它們通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑2，調(diào)控著機(jī)體的免疫反應(yīng)，也與炎癥反應(yīng)的失控有關(guān)。其中參與炎癥的炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子則成為研究的熱點(diǎn)3。對(duì)ALI的防治迄今為止，尚無(wú)特效方法。目前對(duì)于ALI主要是治療原發(fā)疾病，根據(jù)其病理生理改變和臨床表現(xiàn)，進(jìn)行針對(duì)性或支持性治療等綜合手段4，5，但ALI/ARDS在救治中的危險(xiǎn)性、艱巨性和消耗性是眾所周知的，能否開展早期防治已成為救治的關(guān)鍵6。因此，尋求有效的防治手段是當(dāng)前臨床和基礎(chǔ)研究急待解決的重大課題。而中醫(yī)注重整體觀，講究辨證論治，注重于“免疫調(diào)理” 7, 對(duì)ALI/ARDS防治具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。雖然中醫(yī)藥在防治ALI/ARDS方面已初見(jiàn)成效，但經(jīng)檢索未有用針灸、中藥復(fù)方銀花合劑來(lái)防治ALI的有關(guān)報(bào)道，故本次實(shí)驗(yàn)研究我們選用針灸、銀花合劑來(lái)防治ALI模型大鼠。 本課題通過(guò)研究耳針、中藥對(duì)ALI大鼠海馬內(nèi)C-fos表達(dá)和血漿IL-1含量的影響，初步探討了耳針、中藥防治ALI/ARDS的可能途徑，從而為耳針、中藥防治ALI/ARDS提供新的研究思路和臨床依據(jù)。 材料與方法1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康Wistar大鼠54只，雄性，雙耳無(wú)缺損，3-4月齡，體重150 -200g；貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。2 主要器材 臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL16G，上海醫(yī)用分析儀器廠）電子天平（TYPE GB303，Japan）血?dú)夥治鰞x:（i-STAT型，美國(guó)）電熱真空干燥箱（ZK-82A型，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）電熱恒溫水溫箱（型號(hào)HHWZ1420，北京長(zhǎng)源試驗(yàn)設(shè)備廠）快速旋渦混勻器（江蘇姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）海爾微波爐（海爾，中國(guó)）Leica石蠟切片機(jī)（印度）Olympus光學(xué)顯微鏡（日本）SONY圖像采集系統(tǒng)，Biomias99圖像分析系統(tǒng)（四川大學(xué)圖象圖形研究所）3 主要試劑:油酸(Oleic Acid, OA)：化學(xué)純，上海試劑總廠大腸桿菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)：血清型O111:B4，美國(guó)Sigma公司IL-1放免藥盒：北京北方生物技術(shù)研究所C-fos抗體：美國(guó)Santa Cruz二步法（非生物素）檢測(cè)試劑盒；北京中山生物技術(shù)有限公司4 大腸桿菌脂多糖的配制在無(wú)菌條件下，用0.9%生理鹽水將大腸桿菌脂多糖25mg/1ml稀釋成1mg/ml的大腸脂多糖溶液，-20保存?zhèn)溆谩? 實(shí)驗(yàn)方法51動(dòng)物分組將Wistar雄性大鼠54只適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為6組：對(duì)照組、模型組、耳針組、中藥組、耳針+中藥組和地塞米松組，每組各9只。 上述各組置于避強(qiáng)光、安靜、溫暖的環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫控制在15-20之間，濕度75%左右，保持通風(fēng)，自由攝取大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供)，飲用干凈自來(lái)水。52動(dòng)物模型的建立 以上大鼠除對(duì)照組外均采用油酸和內(nèi)毒素“兩次打擊”致ALI大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.2.1致傷因素：第一次打擊：油酸(OA)，0.2m1/kg；第二次打擊：大腸桿菌脂多糖(LPS)，2mg/kg。5.2.2 給藥方法：將4保存的油酸37水溫?。灰蕴刂剖蠡\固定、消毒大鼠尾，并選擇一條尾靜脈用新的1ml注射器接5號(hào)輸液穿刺針穿刺，回抽血證實(shí)己進(jìn)入血管內(nèi)；根據(jù)大鼠體重按0.2m1/kg計(jì)算所用油酸，注入定量油酸，再推0.4ml生理鹽水沖洗針管；對(duì)照組注入0.5ml生理鹽水。第一次打擊后，大鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。按注入油酸4h后實(shí)施第二次打擊，兩次給藥選擇不同的大鼠尾靜脈，按上述辦法同樣選取另一尾靜脈按2mg/kg注入定量LPS，對(duì)照組注射生理鹽水0.5ml。5.2.3模型成功的標(biāo)志：造模后，氧合指數(shù)小于300mmHg可作為ALI模型成功的標(biāo)志之一，同時(shí)伴有肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，肺組織切片HE染色常規(guī)光鏡檢查可見(jiàn)：肺泡和肺間質(zhì)水腫，肺泡壁明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔增厚,肺不張，灶性出血、壞死等病變（見(jiàn)附圖2），以上均可說(shuō)明該模型建立成功。53 防治方法5.3.1耳針組：根據(jù)華興邦實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選用大鼠耳穴肺（心上、下、外三面，呈馬蹄形）、腎上腺（耳屏下部外側(cè)緣）、平喘（對(duì)耳屏的尖端）準(zhǔn)確定位，常規(guī)消毒后，用撳針兩耳交替針刺三穴，并將撳針留置1224，每日1次，造模前連續(xù)3d給于預(yù)防性治療，并于第三天針刺后將撳針留置直至取標(biāo)本。5.3.2 中藥組：所用中藥采取復(fù)方銀花合劑。中藥的制備：按銀花合劑（銀花15g、貫眾10g、魚腥草12g、貝母10g、款冬花10g、黃芩10g、杠板歸15g、甘草6g）藥方比例，采用傳統(tǒng)方法煎制，濃縮成含生藥0.75g/ml的藥液；造模前連續(xù)3d以中藥灌胃，2ml/次，2次/d，并于造模當(dāng)天注射油酸后半小時(shí)，再予以同樣劑量中藥灌胃一次，每日所用中藥當(dāng)日煎制。對(duì)照組與模型組以同等時(shí)間用相同體積的生理鹽水灌胃。 5.3.3耳針+中藥組：用上述方法以同樣時(shí)間，同時(shí)給于耳針和中藥進(jìn)行防治。5.3.4地塞米松組：于造模前半小時(shí)給以尾經(jīng)脈注射地塞米松5mg.kg-1 （ip dex5mg.kg-1），給藥后開始造模。54 標(biāo)本采集 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組大鼠死亡2只，模型組死亡3只，耳針組死亡2只，中藥組死亡3只，耳針+中藥組死亡2只，地塞米松組死亡2只，各組死亡大鼠均不列入標(biāo)本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中。5.4.1 血漿采集: 在注射LPS后2小時(shí)，以3%戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉后，行右頸總動(dòng)脈插管，肝素抗凝，在隔絕空氣條件下抽取肝素抗凝動(dòng)脈血1ml，立即送血?dú)夥治?；另外以新?ml注射器繼續(xù)抽取35ml動(dòng)脈血，放入0.5mol/L EDTA 20L和抑肽酶 40L的試管中搖勻，在 4下離心(3000r/m)20分鐘，吸取血漿0.5ml放入已標(biāo)記EPP管中-20下保存，待測(cè)IL-1。5.4.2 肺組織標(biāo)本采集：取動(dòng)脈血后立即結(jié)扎動(dòng)脈血管，迅速打開胸腔，暴露肺與心臟，經(jīng)升主動(dòng)脈以0.9%生理鹽水400ml灌注(壓力13.316kpa)，再用4%多聚甲醛(0.1mol.L-1，pH7.4)以先快后慢原則持續(xù)灌注固定20min，觀察到大鼠軀體變硬，停止灌注；取全肺，分離左右肺，測(cè)右肺濕重、干重，左側(cè)肺固定于4%多聚甲醛中，4保存。5.4.3 腦標(biāo)本采集：迅速剝離鼠腦并修塊，置同樣濃度多聚甲醛固定液中24h以上，石蠟包埋后，連續(xù)冠狀切片，再用涂有多聚賴氨酸防脫滑的載玻片撈片備用。55標(biāo)本檢測(cè)方法5.5.1 一般指標(biāo)觀察：從造模后開始觀察大鼠呼吸、行為、大便情況。5.5.2 氧分壓（PaO2）及計(jì)算氧合指數(shù)（OI）檢測(cè)：送貴醫(yī)附院作血?dú)夥治鰴z測(cè)。 5.5.3肺組織濕重、干重與肺組織濕重/干重(W/D)比值檢測(cè)：肺濕重測(cè)定：分離右肺后，立即置生理鹽水中輕輕蕩洗去血漬，濾紙吸干肺組織表面生理鹽水，用電子天平稱濕重并記錄；肺干重測(cè)定：待右肺組織標(biāo)本收集完畢后，統(tǒng)一置電熱真空干燥箱，以90烘干24脫水后秤干重并記錄；最后計(jì)算肺組織W/D值。5.5.4 肺組織HE染色：待左肺組織標(biāo)本收集完畢，經(jīng)4%多聚甲醛固定24小時(shí)后統(tǒng)一送貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科做石臘包埋，切片和HE染色。普通光學(xué)顯微鏡觀察肺組織的損傷程度，并參照文獻(xiàn)8的方法，做肺組織損傷病理形態(tài)學(xué)積分測(cè)定：主要依據(jù)肺間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡出血、透明膜形成及肺不張等肺組織病變程度按無(wú)(-)、輕(+)、中(+)、重(+)度分別積0、1、2、3分，然后累計(jì)總分。5.5.5 血漿IL-1含量檢測(cè)：送貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室用放免法完成對(duì)血漿IL-1含量的檢測(cè)（測(cè)量數(shù)據(jù)由中國(guó)科大中佳公司多探頭放免儀完成）。5.5.6 c-fos免疫組化檢測(cè)：按照試劑盒中規(guī)定的操作步驟，采用二步法測(cè)定。具體方法如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；0.3% H2O2室溫浸泡10分鐘，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗3次；用微波爐加熱8分鐘至沸，過(guò)10分鐘后再加熱至沸，自然冷卻，以充分暴露抗原結(jié)合點(diǎn)；滴加正常山羊血清封閉液，置室溫20分鐘，甩去多余液體，不洗；滴加適當(dāng)稀釋的一抗，置-4冰箱中過(guò)夜；0.1M PBS洗2分鐘3次，滴加試劑盒中二抗，20-37孵育20分鐘；0.1M PBS洗5分鐘4次；DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒，取1ml蒸餾水，加試劑盒中試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5-30分鐘之間；蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。在40X10倍光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)如圖所示海馬的分區(qū)標(biāo)準(zhǔn)，每只大鼠選取對(duì)應(yīng)斷面得海馬切片3張，通過(guò)SONY攝像頭將科研動(dòng)物組織免疫組化圖象采集并輸入BOImias99圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行圖象分析，檢測(cè)海馬CA23區(qū)單位面積內(nèi)c-fos免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的光密度(optical density，OD)值。每張切片（每例動(dòng)物標(biāo)本）隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域（視場(chǎng)），每個(gè)視場(chǎng)選取5個(gè)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域測(cè)量平均光密度。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值士標(biāo)準(zhǔn)差(XS)表示，經(jīng)SPSS10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件處理，進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P0.05為相差顯著，P0.01為相差非常顯著。結(jié) 果1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般表現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)的體重、反應(yīng)靈敏度、進(jìn)食均穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)造摸后，正常對(duì)照組動(dòng)物呼吸平穩(wěn)，呼吸頻率40-50次/分。模型組動(dòng)物在注入油酸后出現(xiàn)倦縮少動(dòng)、不進(jìn)食、呼吸加快，活動(dòng)減少，在第二次注射內(nèi)毒素后，大鼠出現(xiàn)呼吸更加急促并伴呼吸窘迫，口唇紫紺，10分鐘后呼吸頻率即達(dá)到90-110次/分，顯著高于損傷前，精神萎靡、對(duì)刺激反應(yīng)差、抓取時(shí)無(wú)力逃避，同時(shí)伴有不同程度全身鼠毛聳立、輕微顫動(dòng)，腹瀉。但觀察時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)大鼠死亡。接受防治的各組大鼠，以上表現(xiàn)癥狀均有不同程度的減輕，呼吸頻率波動(dòng)在70-100次/分，對(duì)刺激反應(yīng)較模型組靈敏。2、氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（OI）變化各組氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（oxygen index, OI = PaO2/FOI2, FOI2為吸入氣氧濃度）變化見(jiàn)表1和圖1。在ALI的診斷標(biāo)準(zhǔn)中，當(dāng)OI300mmHg可確認(rèn)為ALI。表中模型組PaO2均數(shù)為57.43，與對(duì)照組相比降低非常顯著(P0.01)，OI300mmHg，說(shuō)明造模成功。而防治組氧分壓和氧合指數(shù)都有不同程度的升高，但仍低于對(duì)照組，與模型組相比有顯著差異(P0.01)，防治組兩兩比較，耳針+中藥組高于耳針組、中藥組（p0.01，p0.05)。表1 各組大鼠氧分壓及氧合指數(shù)變化( 士s, mmHg)Tab 1 The change on rats PaO2 and OI in every group ( 士s, mmHg) 組別 例數(shù) PaO2 OI對(duì)照組 8 107.632.13 512.510.16模型組 757.437.68273.4736.56耳針組 865.866.94*313.6932.03*#中藥組 779.290.95*377.554.53*#耳針+中藥組 884.384.69*401.7922.33*地塞米松組 887.253.11* 415.4814.79*注：與對(duì)照組比p0.01，與模型組比*p0.01，與中藥+耳針組比#p0.01，#p0.05圖-1 各組大鼠氧分壓及氧合指數(shù)變化Graph-1 The change on rats PaO2 and OI in every group注：與對(duì)照組比p0.01，與模型組比*p0.01，與中藥+耳針組比#p0.01，#p0.053各組肺濕重、干重與肺組織W/D值從表2、圖2中可知，與對(duì)照組相比，模型組肺組織W/D值升高顯著（P0.01）；各防治組肺組織W/D值均有不同程度的下降，與模型組相比差異顯著（P0.01），其中以耳針+中藥組、地塞米松組肺組織W/D值下降明顯，耳針組、中藥組與耳針+中藥組相比有差異(p0.05)。表-2 各組大鼠肺濕重、干重及干濕重比的變化 ( 士s)Tab2 The weight change of the rats wet lung, the dry lung and W/D in every group( 士s)組別 例數(shù) 肺濕重(g) 肺干重(g) W/D對(duì)照組 8 0.9520.0760.098.0008 9.7290.42模型組 7 1.1180.127 0.0890.01312.6780.64耳針組8 0.8170.2330.0700.022 11.8410.48*#中藥組 7 1.5730.341 0.1370.03111.5530.30*#耳針+中藥組 8 1.3360.3050.1260.028 10.6030.24*地塞米松組8 1.0080.110 0.0970.09 10.4150.31*注：與模型組比*p0.01 與對(duì)照組比p0.01，與中藥+耳針組比#p0.05圖-2 各組大鼠肺濕重、干重及干濕重比的變化Graph-2 The weight change of the rats wet lung, the dry lung and W/D in every group4、血漿IL-1含量 “兩次打擊”打擊后致傷后，血漿IL-1含量均有不同程度增高，各組大鼠血漿IL-1含量及其變化見(jiàn)表3，圖3。模型組IL-1含量增高明顯，與對(duì)照組和防治組比較相差顯著(P0.01)。表-3 各組大鼠血漿IL-1的含量的變化 ( 士s，ng/ml)Tab-3 The change on the level of rats serum IL-1in every group ( 士s，ng/ml)組別 分組 IL-1 對(duì)照組80.2530.008 模型組 7 0.7490.033耳針組 8 0.5060.034* #中藥組 7 0.4210.011*# 耳針+中藥組 8 0.3890.018*地塞米松組 8 0.3800.037* 注：與對(duì)照組比p0.01，與模型組比*p0.01，與中藥+耳針組比#p0.05, #p0.05防治組大鼠血漿IL-1含量較模型組有顯著降低(P0.01)，其中防治各兩兩比較耳針+中藥組低于耳針組、中藥組 (P0.01或 P0.05），但仍高于對(duì)照組水平。圖-3 各組大鼠血漿IL-1的含量的變化Graph-3 The change on the level of rats serum IL-1in every group 注：與對(duì)照組比p0.01，與模型組比*p0.01，與中藥+耳針組比#p0.05, #p0.055、海馬內(nèi)c-fos表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示：各組大鼠海馬區(qū)FOS蛋白免疫反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀，沉積于胞核，用FOS免疫樣細(xì)胞(即FOS陽(yáng)性神經(jīng)元，F(xiàn)LI)活性表示c-fos陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，可以看到FOS陽(yáng)性神經(jīng)元胞核著棕色，胞漿和核仁均未著色。在Biomias99圖像分析系統(tǒng)上對(duì)FOS免疫陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)定量分析，其平均光密度（OD）值與表達(dá)強(qiáng)弱呈反比。從所得OD值的結(jié)果看，各組大鼠海馬CA23區(qū)均有不同程度的表達(dá)且表達(dá)強(qiáng)弱有差異（見(jiàn)附圖7-12）。表-4 各組大鼠海馬CA23區(qū)單位面積FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的OD值的變化 ( 士s)Tab-4 The OD values change of fos positive neurons in CA2-3 regoin of rats hippocampus in every group( 士s,)組別 組數(shù) c-fos 對(duì)照組 8 183.2716.52 模型組 7 93.1562.54耳針組 8 175.5883.58*中藥組 7 176.2361.47*耳針+中藥組 8 177.1208.86*地塞米松組 8 177.3961.48* 注：與對(duì)照組比p0.01，與模型組比*p0.05圖-4 各組大鼠海馬CA23區(qū)單位面積FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的OD值的變化Graph-4 The OD values change of fos positive neurons in CA2-3 regoin of rats hippocampus in every group各組大鼠海馬CA區(qū)c-fos表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表4、圖4。模型組OD值低于對(duì)照組及防治組（P0.01），說(shuō)明模型組c-fos表達(dá)較多，胞核著色較深且表達(dá)分布較密集。而防治組OD值均有大幅度得升高，以耳針+中藥組與地塞米松組為甚，胞核著色較模型組淺而較對(duì)照組深，較模型組有顯著差異（P0.05）。 6、肺組織病理學(xué)改變： 肉眼觀察；對(duì)照組肺呈粉紅色，柔軟有彈性，肺組織無(wú)充血、出血、水腫及壞死。模型組肺呈暗紅色、肺體積增大，明顯充血、水腫，并可見(jiàn)斑片狀壞死，彈性消失。而防治組肺表面充血較模型組減輕、斑片狀壞死消失。光鏡檢查：對(duì)照組肺組織正常（見(jiàn)附圖1）。模型組肺切片HE染色見(jiàn)肺組織彌漫性充血水腫，主要是血漿蛋白滲出增多，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔明顯增厚，部分切片可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺不張、灶狀壞死(見(jiàn)附圖2)。而防治組較模型組各有不同程度的減輕，其中，耳針組肺組織 (見(jiàn)附圖3)病變較模型組減輕，但水腫液、炎性細(xì)胞滲出、肺不張仍存在。中藥組滲出減輕，中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出減少（見(jiàn)附圖4）。耳針+中藥組、地塞米松組肺組織各種滲出明顯減少,炎性細(xì)胞滲出顯著減少，有少量的水腫液(見(jiàn)附圖5-6)。各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)積分變化見(jiàn)下表5，圖5。表5各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)積分變化( 士s)Graph5 The change of the rats pathomorphological score in every group( 士s)組別 組數(shù) 病理形態(tài)學(xué)積分 對(duì)照組 8 0 模型組 7 8.371.53耳針組 8 5.561.28*#中藥組 7 4.220.14*#耳針+中藥組 8 3.160.12*地塞米松組 8 2.991.19* 注：與對(duì)照組比p0.001，與模型組比*p0.01，與中藥+耳針組比#p0.01，#p0.05圖5各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)積分變化()Graph5 The change of the rats pathomorphological score in every group注：與對(duì)照組比p0.001，與模型組比*p0.01，與中藥+耳針組比#p0.01，#p0.05由表5、圖5可看出，模型組病理形態(tài)學(xué)積分最高，與對(duì)照組與防治組比有顯著差異（p中藥組耳針+中藥組地塞米松，防治組與模型組比較有顯著差異（p0.01），耳針組、中藥組較耳針+中藥組有顯著差異（p0.01或p0.05）。附 圖18肺血管、肺泡、間質(zhì)及支氣管均正常圖1 HE染色：對(duì)照組(200)Fig1 hematoxylin-eosin staining：control group(200)大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺明顯水腫并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)灶狀壞死。圖2 HE染色：模型組（200）Fig2 hematoxylin-eosin staining：model group（200）大鼠肺組織可見(jiàn)肺泡壁增厚、充血，肺泡腔內(nèi)滲出減少，炎性細(xì)胞侵潤(rùn)減輕。 圖3 HE染色：耳針組(200)Fig3 hematoxylin-eosin staining：ear acupuncture group（200）大鼠肺組織可見(jiàn)肺泡壁增厚、充血減輕，肺泡腔內(nèi)滲出及炎性細(xì)胞侵潤(rùn)明顯減少。圖4 HE染色：中藥組(200)Fig4 hematoxylin-eosin staining：YinHua agent group (200)可見(jiàn)肺泡壁增厚、充血明顯減輕，肺泡腔內(nèi)滲出及炎性細(xì)胞侵潤(rùn)顯著減輕。圖5 HE染色：耳針+中藥組 (100)Fig5 hematoxylin-eosin staining：ear acupuncture and YinHua agent group (100)可見(jiàn)肺泡壁增厚、充血明顯減輕，肺泡腔滲出顯著減少，有少量的炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。 圖6 HE染色：地塞米松組(100)Fig6 hematoxylin-eosin staining：Dexamethasone group (100)大鼠海馬CA23區(qū)有極少量FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)圖7 對(duì)照組大鼠海馬CA23區(qū)c-fos表達(dá)Fig7 control group of the fos positive neurons expression in CA2region of rat hippocampusin 大鼠海馬CA23區(qū)有大量的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)圖8 模型組大鼠海馬CA23區(qū)c-fos表達(dá)Fig8 model group of the fos positive neurons expression in CA2region of rat hippocampusin 大鼠海馬CA23區(qū)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)減少圖9 耳針組大鼠海馬CA23區(qū)c-fos表達(dá)Fig9 ear acupuncture group of the fos positive neurons expression in CA2region of rat hippocampusin 大鼠海馬CA23區(qū)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)明顯減少圖10 中藥組大鼠海馬CA23區(qū)c-fos表達(dá)Fig10 Yinhua agent group of the fos positive neurons expression in CA2region of rat hippocampusin 大鼠海馬CA23區(qū)有較少量FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)圖11 耳針+中藥組大鼠海馬CA23區(qū)c-fos表達(dá)Fig11 ear acupuncture and YinHua agent group of the fos positive neurons expression in CA2region of rat hippocampusin 大鼠海馬CA23區(qū)有少量FOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)圖12 地塞米松組大鼠海馬CA23區(qū)c-fos表達(dá)Fig12 Dexamethasone group group the expression fos positive neurons in CA2-3 region of hippocampusin討 論1 關(guān)于急性肺損傷動(dòng)物模型隨著對(duì)ALI/ARDS機(jī)理研究的深入，許多研究認(rèn)為機(jī)體受到創(chuàng)傷、感染、失血因素等打擊后，如再次受到即使很小程度的打擊，也很容易導(dǎo)致ALI/ARDS ，此即二次打擊理論 (two-hit)9。“兩次打擊”模式是解釋全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)怎樣發(fā)展成MODS的主要學(xué)說(shuō)之一10。國(guó)外采用的兩次打擊動(dòng)物模型，多以放血出現(xiàn)失血性休克，復(fù)蘇后靜脈注入大腸桿菌或盲腸結(jié)扎穿刺造成第二次打擊，但此種方法若使用小動(dòng)物，復(fù)蘇很困難，需要一定的專用設(shè)備。因此，張青等人對(duì)兩次打擊大鼠急性肺損傷動(dòng)物模型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)油酸致傷后4h，第二次小劑量脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)打擊引發(fā)外周血白細(xì)胞增多反應(yīng)和肺損傷效應(yīng)最大，該模型能較好地反映臨床嚴(yán)重急性肺損傷的病理變化11 。其中油酸致大鼠急性肺損傷是經(jīng)典急性肺損傷動(dòng)物模型之一，模擬臨床肺脂肪栓塞綜合征引起急性呼吸窘迫，但臨床上，肺損傷時(shí)常伴有革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素所引發(fā)的膿毒血癥較為常見(jiàn)且預(yù)后較差，而細(xì)菌內(nèi)毒素的主要致病成分是LPS，油酸和內(nèi)毒素先后兩次致傷建立大鼠急性肺損傷模型更能貼近臨床ALI/ARDS的發(fā)病、病理變化及預(yù)后。所以我們采用了以上這種成熟、簡(jiǎn)單的“兩次打擊”大鼠ALI模型。氧合指數(shù)（OI）、肺組織W/D值和肺病理形態(tài)學(xué)改變及積分可分別反映大鼠低氧血癥，肺水腫及肺損傷程度，以上指標(biāo)均可表明ALI模型的建立是否成功。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，PaO2、OI值模型組較對(duì)照組下降，并小于300mmHg，符合急性肺損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)；關(guān)于大鼠肺組織W/D值，模型組較對(duì)照組有顯著升高差，說(shuō)明模型組大鼠肺組織富含蛋白的水腫液形成；肺切片HE染色見(jiàn)肺組織充血，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出的大量水腫液，部分切片見(jiàn)灶狀肺不張、出血、壞死，此與ALI病理生理相符合12。從肺病理形態(tài)學(xué)積分可已看出模型組積分最高，反映了肺臟病變最重。以上這些充分說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)ALI模型的建立是成功的。2血漿IL-1與急性肺損傷IL-1是一種多功能內(nèi)分泌細(xì)胞因子(Cytokine，CK)，主要由單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。在未受任何刺激的情況下，通常是不表達(dá)的，唯有經(jīng)過(guò)誘生劑（毒素類、細(xì)胞毒類、抗原類、損傷、炎癥等）激活后才能產(chǎn)生。在ALI中，IL-1作為前炎癥細(xì)胞因子(proinflammatory cytokines)，為炎癥反應(yīng)啟動(dòng)物質(zhì)13，14，對(duì)急性肺損傷的影響可能主要有：促血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附白細(xì)胞，誘導(dǎo)其在肺內(nèi)聚集。刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌集落刺激因子（CSFs）、血小板激活因子(PAF)等炎性介質(zhì)。激活凝血系統(tǒng)，抑制纖溶反應(yīng)。增加血管通透性，可能與IL-1直接增加血管通透性和刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生成介質(zhì)間接作用有關(guān)15。協(xié)同腫瘤壞死因子-(TNF-),加重TNF-誘發(fā)的肺損傷。IL-1參與肺泡上皮細(xì)胞早期損害過(guò)程16。嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷及休克時(shí)，IL-1是在細(xì)菌和內(nèi)毒素侵入機(jī)體激活巨噬細(xì)胞后被釋放17，啟動(dòng)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激肺內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生各種趨化因子。同時(shí)多形核白細(xì)胞局部早期產(chǎn)生的IL-1和TNF-可激活內(nèi)皮細(xì)胞，使其上調(diào)表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)。ICAM-1升高啟動(dòng)黏附分子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生溶動(dòng)效應(yīng)，介導(dǎo)外周血炎癥細(xì)胞遷移到肺間質(zhì)和肺泡，被激活的多形核白細(xì)胞產(chǎn)生呼吸暴發(fā)釋放大量炎癥介質(zhì)、自由基和酶，導(dǎo)致肺損傷。此外，IL-1還可促進(jìn)受損肺泡上皮細(xì)胞損害18，特別是急性肺損傷早期，參與肺泡上皮細(xì)胞早期損害過(guò)程16。因此 IL-1在 ALI早期，對(duì)中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞聚集、介質(zhì)釋放等炎癥過(guò)程中起關(guān)鍵作用，啟動(dòng)了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與了ALI發(fā)病過(guò)程19。有研究表明20，體內(nèi)全身炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)物質(zhì)是IL-1而非TNF-，在臨床上能更好地反映ALI的嚴(yán)重程度21。本研究結(jié)果表明, ALI大鼠模型組血漿中的IL-1明顯增高，且肺損傷嚴(yán)重，證實(shí)IL-1參與了急性肺損傷的病理生理過(guò)程，與報(bào)道認(rèn)為的一致22。 IL-1等細(xì)胞因子除了導(dǎo)致對(duì)肺血管內(nèi)皮的損傷等外周作用，近來(lái)有學(xué)者提出可能進(jìn)入腦內(nèi)，通過(guò)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）內(nèi)神經(jīng)元的功能，進(jìn)而反饋調(diào)節(jié)外周組織的損傷與修復(fù)23-24。Chikanza等發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)釋放的前炎性細(xì)胞因子如IL-1, IL -6和TNF-均有啟動(dòng)HPA活性的效應(yīng)25，當(dāng)機(jī)體感染時(shí)海馬中的IL-1等細(xì)胞因子通過(guò)激活 HPA軸提高腎上腺皮質(zhì)激素的含量，對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生抑制性影響26。因此認(rèn)為在急性肺損傷中，IL-1啟動(dòng)HPA活性的效應(yīng)，可能是IL-1在急性肺損傷中作用的另一途徑。3. 海馬區(qū)c-fos表達(dá)與急性肺損傷自上世紀(jì)70年代，Besedovsky等學(xué)者相繼提出“神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)“學(xué)說(shuō)以來(lái)，1994年Blalock等提出神經(jīng)肽/神經(jīng)遞質(zhì)、激素及細(xì)胞因子是三大系統(tǒng)間相互調(diào)節(jié)的共用介質(zhì)27。病毒、毒素等刺激是神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)法感受的刺激，而免疫系統(tǒng)對(duì)它們十分敏感。通過(guò)免疫系統(tǒng)識(shí)別抗原，并發(fā)生應(yīng)答，產(chǎn)生生物活性分子向神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)傳遞信息，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)感受并加以整合，發(fā)出調(diào)節(jié)信息作用于免疫系統(tǒng)。其中，內(nèi)分泌器官對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)具有重要作用，可被視為神經(jīng)與免疫系統(tǒng)相互調(diào)節(jié)的橋梁。一般認(rèn)為, 免疫刺激可影響神經(jīng)內(nèi)分泌的各項(xiàng)機(jī)能28。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)通過(guò)自主神經(jīng)系統(tǒng)及HPA軸釋放多種神經(jīng)遞質(zhì)和激素，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。因此，以上三個(gè)系統(tǒng)相互作用及相互調(diào)節(jié)，是機(jī)體對(duì)各種刺激包括損害性刺激做出相應(yīng)反應(yīng)，以保持自身穩(wěn)定及正常的防御功能。c-fos基因是一種即刻早期基因，多種刺激可誘導(dǎo)FOS的迅速表達(dá)，故c-fos在刺激-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的信使傳遞中起著核內(nèi)第三信使的重要作用29，是神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要信使分子，參與調(diào)節(jié)其它多個(gè)免疫相關(guān)腦區(qū)的功能活動(dòng)30。有研究認(rèn)為背側(cè)海馬（主要是CA23區(qū)），對(duì)外周免疫的影響可能主要是通過(guò)海馬-下丘腦-垂體-腎上腺（海馬-HPA）軸進(jìn)行的，它主要參與應(yīng)激狀態(tài)下免疫抑制的調(diào)節(jié)31，32，其機(jī)制仍不明確。最近有研究認(rèn)為海馬CA23區(qū)可能通過(guò)c-fos途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)過(guò)程33，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在ALI過(guò)程中，海馬內(nèi)有大量FLI（FOS免疫陽(yáng)性反應(yīng)FOS-like-immun細(xì)胞）出現(xiàn)，并認(rèn)為海馬參與了ALI的調(diào)控，應(yīng)激（反應(yīng)）在急性肺損傷發(fā)生中具有重要意義，進(jìn)而影響與應(yīng)激有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)的改變34，在ALI過(guò)程中運(yùn)用抗應(yīng)激藥物可減輕肺損傷35。本實(shí)驗(yàn)觀察分析了在ALI過(guò)程中海馬CA2-3區(qū)FOS 蛋白的含量變化，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)明顯高于對(duì)照組，提示在ALI過(guò)程中，海馬CA2-3此特定區(qū)的神經(jīng)元功能活動(dòng)增強(qiáng)，也提示Fos陽(yáng)性細(xì)胞在海馬CA2-3區(qū)的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。因此我們可這樣推論：在ALI過(guò)程中，海馬CA2-3此特定區(qū)的神經(jīng)元功能活動(dòng)增強(qiáng)可引起一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，可能對(duì)某些神經(jīng)遞質(zhì)或激素（如乙酰膽堿、兒茶酚胺、腎上腺皮質(zhì)激素等）的調(diào)控起關(guān)鍵作用，進(jìn)而促使下丘腦 -垂體 -腎上腺軸功能亢進(jìn)36-37，提高腎上腺皮質(zhì)激素的含量，其中糖皮質(zhì)激素（GC）分泌的增加占有更為重要地位，而有研究38認(rèn)為大量的糖皮質(zhì)激素可能在許多方面介入肺損傷，因此在海馬CA2-3區(qū)C-fos表達(dá)增多可能在一定程度上加速了肺損傷過(guò)程。4祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)ALI認(rèn)識(shí)及進(jìn)展祖國(guó)醫(yī)學(xué)歷代醫(yī)籍記載的由損傷、產(chǎn)后、溫病、失血、癰疽等明確誘因所致喘證，原無(wú)明顯心肺疾患而以呼吸頻速為突出表現(xiàn)者，與現(xiàn)代概念的ALI/ARDS相似，病類診斷包括“喘促證”（早期）和“喘脫證”（晚期），臨證可概括為“喘”、“昏”、“滿”、“熱”四癥，尤以“喘”、“滿”為突出表現(xiàn)39。關(guān)于肺臟在人體病理生理活動(dòng)中的重要性，中醫(yī)學(xué)也早有論述?！胺沃骱粑畾?，亦主一身之氣”，故難經(jīng)八難指出：“氣者，人之根本也”。肺為先導(dǎo)，五臟之中“肺為嬌臟”，最易受邪，且感邪之后最易衰弱。肺氣衰敗必致各臟衰敗，而此又與ALI是全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的一部分，并貫穿其全過(guò)程一致。素問(wèn)玉機(jī)真臟論曰：“五臟相通，移皆有次”。這與ALI在MODS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)最早和發(fā)生率最高一致。由于導(dǎo)致ALI的病因病機(jī)復(fù)雜，所以中醫(yī)對(duì)ALI的認(rèn)識(shí)可從多個(gè)角度出發(fā)。不管是從正虛邪盛、氣滯血瘀、陽(yáng)明腑實(shí)等角度出發(fā)，還是把它歸為溫?zé)岵?，其基本病機(jī)關(guān)鍵在于熱、瘀、水(濕)、虛四個(gè)方面，正盛邪退則病愈，正虛邪盛則病進(jìn)，邪實(shí)內(nèi)閉，正氣耗竭，氣陰兩脫則病亡40。邪毒滯于肺，阻遏三焦氣機(jī)，灼傷氣陰，煎熬血液，則見(jiàn)肺毛細(xì)血管瘀血，血瘀則水停，瘀血、水邪阻滯氣機(jī)，導(dǎo)致肺氣不利，肺失宣降，可見(jiàn)肺間質(zhì)瘀血、滲出、水腫、肺泡透明膜形成、局灶性肺不張等，進(jìn)一步發(fā)展則內(nèi)閉外脫，甚至死亡。中醫(yī)藥防治ALI/ARDS的研究始于近十年，中醫(yī)藥在防治ALI/ARDS雖已初見(jiàn)成效，但到目前為止，對(duì)于此方面的研究還較少，并且目前的研究尚存在許多問(wèn)題，如：對(duì)該病沒(méi)有統(tǒng)一的中醫(yī)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，對(duì)藥物的作用機(jī)制尚未認(rèn)識(shí)清楚。鑒于上述存在的問(wèn)題，就需要我們加大對(duì)于中醫(yī)藥防治的研究廣度和深度，才能有望在中醫(yī)藥防治急性重癥方面產(chǎn)生新的突破41。5耳針、中藥對(duì)急性肺損傷作用分析“針灸與免疫的新概念”認(rèn)為經(jīng)絡(luò)-神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)是研究針灸調(diào)節(jié)免疫機(jī)理的理論基礎(chǔ)42。針灸作用經(jīng)絡(luò)腧穴 ,影響神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，三個(gè)系統(tǒng)相互作用及相互調(diào)節(jié)，對(duì)各種刺激包括損害性刺激做出相應(yīng)反應(yīng)，以保持自身穩(wěn)定及正常的防御功能。由此構(gòu)成了一條經(jīng)絡(luò)-神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、調(diào)節(jié)通道43。耳針作為針灸學(xué)的分支之一，耳針學(xué)的基本作用原理同針刺原理是一脈相承的。十二經(jīng)脈上行于耳，耳為宗脈之聚。耳廓的神經(jīng)很豐富，各神經(jīng)之間有豐富的吻合支，并有研究證實(shí)耳穴與內(nèi)臟在中樞神經(jīng)的投射區(qū)重疊44，所以內(nèi)臟發(fā)生疾病時(shí)出現(xiàn)耳部皮膚溫度，色澤，痛點(diǎn)和電阻變化，并且有相應(yīng)部位的反應(yīng)點(diǎn)。因此，耳針作用不是單純某一支神經(jīng)支配所起作用，而是支配某一區(qū)域的整個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)共同發(fā)揮的作用45。另外，大量的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，針灸能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，具有抗感染等免疫效應(yīng)。由此可見(jiàn)耳穴診治疾病的原理不是直接針對(duì)病因與病變組織起作用，而是通過(guò)多條途徑、在多個(gè)層次上進(jìn)行調(diào)整的綜合機(jī)能體系，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能或調(diào)節(jié)體內(nèi)失衡的免疫功能而實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)耳針可對(duì)穴位進(jìn)行持續(xù)性的刺激，調(diào)動(dòng)了相應(yīng)臟腑和部位的經(jīng)氣，起到了調(diào)節(jié)臟腑陰陽(yáng)氣血的作用，使機(jī)體產(chǎn)生出自身的抗病能力，機(jī)體各器官各系統(tǒng)之間達(dá)到了新的平衡。由于針灸作用受諸多因素影響，尤其受機(jī)體功能狀態(tài)的制約，所以針灸的免疫作用是有限度的。雖然針灸在急性疾病中亦具有獨(dú)特療效，但至今卻未見(jiàn)有針灸對(duì)ALI/ARDS防治。已臨床研究證明耳穴療法具有消炎、平喘作用，并且可改善患者的免疫功能46，47。因此本次研究嘗試用耳針對(duì)ALI大鼠進(jìn)行防治，分別采用肺、腎上腺、平喘三穴對(duì)ALI防治，肺位于心系上、下、外三面，呈馬蹄形，主治呼吸系統(tǒng)疾??；腎上腺位于耳屏下部外側(cè)緣，主治咳嗽、哮喘等病癥；平喘位于對(duì)耳屏的尖端，對(duì)哮喘、咳嗽亦有較好的療效。三穴合用具有消炎、平喘，改善免疫功能的作用。近幾年來(lái)，中藥在防治ALI/ARDS已初見(jiàn)成效，并初步揭示了作用機(jī)制。中醫(yī)藥對(duì)不同的原因病機(jī)所致急性肺損傷有不同防治方法，最終通過(guò)抑制、減弱或消除細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放所致的損傷而發(fā)揮對(duì)肺組織細(xì)胞的保護(hù)作用。此外，中藥與針灸同樣對(duì)機(jī)體免疫功能有影響，有的是直接作用于免疫系統(tǒng)或再通過(guò)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，有的則是作用于神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，并通過(guò)其間接影響免疫系統(tǒng)，發(fā)揮對(duì)機(jī)體的整體調(diào)節(jié)作用48。本次研究選取清熱解毒類銀花合劑對(duì)ALI進(jìn)行研究。以前我們?cè)鴮?duì)銀花合劑進(jìn)行過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床上的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該合劑對(duì)多種病毒有明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖引起的家兔發(fā)熱也有明顯的對(duì)抗作用49；用于臨床治療 50, 本合劑霧化吸入可使藥物直接到達(dá)呼吸道粘膜及分泌物中，迅速發(fā)揮治療作用，較快改善體內(nèi)缺氧及二氧化碳潴留的狀態(tài)。我們也曾對(duì)該方進(jìn)行了進(jìn)一步相關(guān)的藥理學(xué)研究及安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明銀花合劑無(wú)明顯毒副作用。以上結(jié)果表明，該方不僅解熱作用明顯，而且對(duì)今后防治肺部疾病具有潛在的價(jià)值。金銀花合劑（銀花15g、貫眾10g、魚腥草12g、貝母10g、款冬花10g、黃芩10g、杠板歸15g、甘草6g）具有清熱解毒、止咳平喘功效。方中銀花、貫眾、杠板歸清熱解毒；魚腥草、貝母、款冬花、黃芩止咳平喘，清熱化痰；甘草清熱解毒，潤(rùn)肺調(diào)中?，F(xiàn)代藥理研究證明，黃芩、銀花、貫眾有較強(qiáng)的抑菌、抗病毒作用；貝母舒張支氣管，并有較強(qiáng)的祛痰作用；杠板歸有消炎及利尿作用，體外實(shí)驗(yàn)對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌與綠膿桿菌均有抑制作用。甘草有中樞性止咳作用。魚腥草對(duì)病毒有較強(qiáng)的抑制作用，已有人對(duì)魚腥草在ALI中的作用進(jìn)行了研究51，認(rèn)為它可通過(guò)降低腫瘤壞死因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)對(duì)ALI的防治作用。黃芩含有黃芩素、黃芩甙，對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-1有明顯的抑制作用，抑制IL-1誘導(dǎo)的前列腺素E2和白三烯的合成42。在防治ALI復(fù)方報(bào)道中，熱毒清、毒素清52，53可阻止ALI發(fā)生發(fā)展，具有一定的保護(hù)作用，而這兩個(gè)復(fù)方均含有銀花和魚腥草。本實(shí)驗(yàn)表明此方對(duì)急性肺損傷具有明顯的防治作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，耳針組、中藥組、耳針+中藥組PaO2升高，肺組織W/D值和肺臟病理形態(tài)學(xué)積分降低，肺組織損傷減輕，說(shuō)明耳針、中藥可通過(guò)改善肺的通氣功能，減輕肺毛細(xì)血管滲漏，改善肺組織病理變化而達(dá)到對(duì)肺損傷防治作用。同時(shí)我們也觀察到防治組較模型組血漿IL-1含量降低，c-fos表達(dá)減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：（1）在急性肺損傷早期，耳針、銀花合劑能降低血漿IL-1含量，在一定程度上抑制了中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞聚集、介質(zhì)釋放，減弱了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少了大量自由基和酶釋放，從始動(dòng)環(huán)節(jié)上抑制ALI發(fā)生發(fā)展。（2）耳針、銀花合劑可通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌增強(qiáng)了免疫作用，從而對(duì)機(jī)體起到了調(diào)節(jié)臟腑陰陽(yáng)氣血的作用，產(chǎn)生出自身的抗病能力，使機(jī)體各器官各系統(tǒng)之間達(dá)到了新的平衡?？赡軝C(jī)制是耳針、銀花合劑通過(guò)拮抗IL-1、抑制c-fos表達(dá)參與了海馬對(duì) HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，產(chǎn)生免疫增強(qiáng)效應(yīng)而達(dá)到治療效果。此與可能與Fos陽(yáng)性細(xì)胞在海馬CA23區(qū)的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用有關(guān)，從而起到了對(duì)某些中樞神經(jīng)遞質(zhì)或激素產(chǎn)生調(diào)控作用，至于c-fos表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)何種途徑介導(dǎo)海馬CA23區(qū)對(duì) HPA的調(diào)控是以后進(jìn)一步探討的課題。并且課題結(jié)果也提示耳針+銀花合劑組優(yōu)于耳針組、銀花合劑組，其差異有顯著性，說(shuō)明耳針、銀花合劑合用有協(xié)同作用。這可能與耳針、銀花合劑共同發(fā)揮了減輕炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫等有關(guān)。同時(shí)，我們也注意到地塞米松組有較好的療效。地塞米松（GC）是人工合成糖皮質(zhì)類固醇激素，目前對(duì)其運(yùn)用仍受到爭(zhēng)議32，而且大量使用地塞米松存在許多副作用，如：易出血傾向、創(chuàng)口癒合不良，股骨頭缺血性壞死，消化性潰瘍或穿孔等并發(fā)癥，還可抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)并發(fā)感染，停藥后又易出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素停藥綜合征等。鑒于以上原因，我們認(rèn)為地塞米松并非可以替代其他藥物和治療手段，尋找更有效的治療方法仍是我們急需解決的重大課題。 結(jié) 論1. 在ALI過(guò)程中，海馬CA23區(qū)通過(guò)c-fos途徑參與了ALI免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，其途徑可能是海馬CA23此特定區(qū)的Fos陽(yáng)性神經(jīng)元功能活動(dòng)增強(qiáng)對(duì)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)起了關(guān)鍵的調(diào)控作用，進(jìn)而促使下丘腦-垂體-腎上腺軸功能亢進(jìn),抑制機(jī)體免疫功能。2耳針和銀花合劑具有防治ALI的作用，其作用的可能機(jī)制是耳針、銀花合劑通過(guò)拮抗IL-1，從始動(dòng)環(huán)節(jié)上抑制了ALI發(fā)生發(fā)展；同時(shí)耳針、中藥也通過(guò)抑制了海馬CA23區(qū)c-fos的表達(dá)，參與了海馬對(duì)丘腦-垂體-腎上腺軸應(yīng)激反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，產(chǎn)生免疫增強(qiáng)效應(yīng)而達(dá)到治療效果。. 耳針與中藥具有協(xié)同作用，兩者聯(lián)合效果更佳。參考文獻(xiàn)1錢桂生,急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征的臨床研究，中華燒傷雜志，2004,6,20，（3） 2錢桂生，急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征研究現(xiàn)狀與展望，解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2003,2,28（2）:973孫中吉，盧青，李銀平，急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病中的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2003,3,15（3）4趙建，丁日高，急性肺損傷治療藥物的研究進(jìn)展，國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，2001,8,28（4）5虞文魁，李維勤，急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征的治療進(jìn)展，中國(guó)實(shí)用外科雜志，2004，3，24(3)6耿 耘, 衛(wèi) 敏, 急性呼吸窘迫綜合征的中醫(yī)治療概況, 實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床, 2003,4,3(2)7陸峰. 急性呼吸窘迫綜合征炎癥反應(yīng)機(jī)制與中西醫(yī)結(jié)合免疫調(diào)理防治的探討,中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002， 22（6）：4738雷文章，韋靖江，沈文律，等實(shí)驗(yàn)性壞死性胰腺炎多器官損害與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1995，12：1311329MatthayMA, ZimmermanGA, EsmonC,etal. Future research directions in acute lung injury: summary of National Heart, Lung, and Blood institude working group.Am J Respir Crit Care Med,2003,167:1027-1035 10毛寶齡 .深入探討全身炎癥反應(yīng)的失控與調(diào)控J.中華內(nèi)科雜志,1997,36(1) :3-411張青,毛寶齡,錢桂生,陳正堂,徐劍鋮,李琦, 油酸和內(nèi)毒素兩次打擊大鼠急性肺損傷動(dòng)物模型研究, 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22,6(22)12張錫剛, 丁日高，急性肺損傷研究進(jìn)展，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1 999,9,2 3( 3)13 Goldblume S E，Jay M，Yoneda K，et al. Monoline-induced acute lung injury in rabbits. J Appl Physiol, 1987,63:2093-210014Goldblume S E. Cphen D A, Gillespie M N, et al. Interleukin-1 induced granulocytoperia and pulmonary leukostasis in rabbits. J Appl Physiol, 1987,62:1-715孫耕耘,毛寶齡,呂寶璋，白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子與炎癥，生理科學(xué)進(jìn)展, 1993,24:23 2616Geiser