12345 分類號： 單位代碼： 10389 密 級： (沒有不用寫 )學(xué) 號： (S/B) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士論文 香蕉內(nèi)生菌 群落結(jié)構(gòu) 多態(tài)性 及其枯萎病 生防 菌 篩選 學(xué) 科 門 類： 一級學(xué)科名稱： 二級學(xué)科名稱： 研 究 方 向：植物病理學(xué) 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 博士、 研究員 博士、 研究員 完 成 時 間：二 年四月 2 目 錄 中文摘要 . 1 英文摘要 . 2 第一章綜述 . 3 1 枯萎病的生物防治研究進(jìn)展 . 3 2 生防細(xì)菌的來源 . 4 植物內(nèi)生細(xì)菌 . 4 病機(jī)制 . 5 爭作用 . 5 抗作用 . 7 3 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題 . 9 4 生防細(xì)菌的定殖研究 . 10 . 10 5 宿主一內(nèi)生菌一內(nèi)生菌之間的關(guān)系 . 12 主與內(nèi)生茵關(guān)系 . 12 生菌之間相互關(guān)系 . 13 第二章香蕉內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性研究 . 14 . 14 驗(yàn)材料 . 14 生細(xì)菌的分離 . 14 . 15 2. 結(jié)果與分析 . 16 . 16 3 小結(jié)與討論 . 20 第三 章香蕉枯萎病內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定 . 21 1 材料與方法 . 21 . 21 . 21 2 結(jié)果與分析 . 23 3 . 23 . 25 綠假單孢菌的測定 . 26 第四章 不同培養(yǎng)條件對香蕉內(nèi)生生防菌生長的影響 . 31 1 材料與方法 . 31 . 31 . 31 . 31 . 31 . 32 . 32 . 32 . 33 46號銅綠假單胞菌株生長的 影響 . 34 . 34 . 35 第五章培養(yǎng)條件對 銅綠假單胞菌定殖香蕉組培苗的影響 . 37 1 材料與方法 . 37 試菌株 . 37 . 37 . 38 . 38 單胞菌定殖的影響 . 38 2 結(jié)果與分析 . 39 . 39 孢鐮刀菌回接香蕉盆栽苗致病性檢 測 . 40 . 40 液直接加入） . 41 根法） . 41 第六章 總結(jié)與展望 . 42 4 參考文獻(xiàn) . 43 致謝 . 47 1 中文摘要 枯萎病是一種毀滅性的土傳病害，該病的生物防治 已經(jīng)受到世界各國的極大關(guān)注，為獲得優(yōu)良性狀的生防菌直接為生產(chǎn)服務(wù)，本論文從菌種鑒定篩選鑒定，抑菌機(jī)理，發(fā)酵條件，定植狀況，等方面對香蕉枯萎病的生防細(xì)菌進(jìn)行了較系統(tǒng)的 研究 。 以香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌為靶標(biāo)菌， 對福建省漳浦縣的兩株香蕉植株和一株 米蕉植株進(jìn)行進(jìn)行了分離和 拮抗細(xì)菌的篩選。 同時對部分菌株 進(jìn)行了鑒定 。 另外，對本試驗(yàn) 室 的四株對枯萎病有拮抗 作用的銅綠假單孢 菌 進(jìn)行了篩選，選取 一種進(jìn)行了 生理生化實(shí)驗(yàn)，并對這株菌進(jìn)行了微生物試驗(yàn)，以及對其侵入組培苗的條件進(jìn)行了初步探索。 關(guān)鍵詞， 香蕉枯萎病 內(nèi)生細(xì)菌，內(nèi)生生防菌 2 英文摘要 is a of It to of by To in of f. by nd of 4 is nd in 3 第一章綜述 1 枯萎病的生物防治研究進(jìn)展 植物枯萎病是由鐮刀菌寄生引起的一種世界性的真菌土傳病害，其主要的致病菌是尖孢鐮刀菌（ ，病原菌從根部為害植物，引起維管束病害，造成植株枯死，在植株的全生育期均可發(fā)生。該病害在 3內(nèi)就會由零星點(diǎn)片發(fā)展為普遍流行性病害，以瓜類枯萎病為例，病田一般減產(chǎn) 20 嚴(yán)重田塊可達(dá) 50甚至絕產(chǎn)。目前，在世界范圍已報(bào)道的被嚴(yán)重為害的經(jīng)濟(jì)作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黃瓜、節(jié)瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆、甜瓜、絲瓜 、白瓜（越瓜）、苦瓜、葫蘆瓜、哈密瓜、四季豆、豇豆等。目前，對于該病的防治主要有抗病育種法、輪作換茬法以及最廣泛采用的藥劑防治法等。但抗病品種的抗病能力維持時間較短且目前品種的抗性與豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)還未達(dá)成有機(jī)的統(tǒng)一；由于土地資源有限，輪作方法也不易實(shí)施；一直以來，化學(xué)防治是控制土傳病害的主要手段，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，產(chǎn)生了環(huán)境污染、農(nóng)藥抗性及農(nóng)藥殘留等令人擔(dān)憂的問題，而且迄今為止還沒有一種化學(xué)農(nóng)藥可以有效地控制枯萎病的發(fā)生。因此，利用微生物及其代謝產(chǎn)物等生物農(nóng)藥進(jìn)行防治，使用對人體和生態(tài)環(huán)境無害的生防菌劑 替代化學(xué)農(nóng)藥已成為世界范圍內(nèi)的發(fā)展方向。 香蕉是我國南方的五大名果之一，是國內(nèi)消費(fèi)和出口創(chuàng)匯的一個重要資源。但是，隨著香蕉生產(chǎn)的發(fā)展，香蕉病害的危害也日益嚴(yán)重，尤其是香蕉枯萎病給我國香蕉生產(chǎn)帶來極大的威脅，加強(qiáng)香蕉枯萎病的防治迫在眉睫。香蕉枯萎病是一種毀滅性病害，一種靠土壤和苗木傳播的真菌性病害，通過灌溉水流動和染病吸芽繁殖材料傳播。雖然該病已經(jīng)受到國內(nèi)外的關(guān)注，但是到目前為止，對該病的防治方面仍不容樂觀。目前推廣的抗病品種 （舒肇蘇 (臺蕉 1 號、 2 號、 等 )，農(nóng)藝性狀不佳 (產(chǎn)量 低、植株太高 )，品質(zhì)較差。 4 采用土壤清潔 措施均無效果，生長期使用殺菌劑藥液灌溉法，防治效果也不理想 （林蘭穩(wěn)， 2003） ，而且長期使用化學(xué)農(nóng)藥容易引起抗藥性，影響 生態(tài)環(huán)境，對香蕉的品質(zhì)，生產(chǎn)，出口等方面也不利。因此無公害控制病害已成為植保工作者的目標(biāo)，而香蕉枯萎病生物防治 已經(jīng)成為各國研究的熱點(diǎn) ，國外研究者分離獲得 鏈霉菌 （ 熒光假單胞 （ ， 003） ，枯草芽孢桿菌（ 綠農(nóng)桿菌（ S Y， ， ， 香蕉枯萎病具有明顯的抑制作用； 2003？） 等研究報(bào)道，抗病品種的種植與生防菌的施用相結(jié)合，對香蕉枯萎病的防效達(dá) 95%以上（ ， ， ； 說明生物防治香蕉枯萎病是完全可行的。我國從事香蕉枯萎病生物防治的研究剛剛起步， 2003 年，曹理想等從香蕉組織內(nèi)分離到幾株內(nèi)生菌對該病有不用程度的抑制作用，但抑制效果不理想 （曹理想 ， 2003） 。 本 課題組從果園土壤中分離到幾株對香蕉枯萎病菌有及其顯著抑制作用的拮抗菌，并對這些拮抗抑制香蕉枯萎病菌的作用進(jìn)行了測定，為開發(fā)香蕉枯萎病的生防制劑打下基礎(chǔ)。 2 生防細(xì)菌的來源 高等植物在充滿微生物的環(huán)境中生長發(fā)育，由于其共同進(jìn)化產(chǎn)生不同類型的微生物 據(jù)生境不同，微生物可分為附生和內(nèi)生兩類。附生菌 （ 指在寄主體表生長的微生物，根 據(jù) 附 生 部 位 又 可 分 為 根 際 （ 微 生 物 和 體 圍（ 生物兩類 （王金生， 1999）。 植物內(nèi)生菌是指存在于植物體內(nèi) 對植物沒有危害的一類微生物，能夠定殖在植物細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)，并與寄主植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系。 植物內(nèi)生細(xì)菌 植物內(nèi)生細(xì)菌與寄主之間相互依存、互相制約的關(guān)系，是內(nèi)生細(xì) 5 菌應(yīng)用研究的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，植物內(nèi)生細(xì)菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中天然組成成分，它們可能促進(jìn)了寄主植物對環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)了系統(tǒng)的生態(tài)平衡。 1993）將 進(jìn)行玉米螟蟲生物防治。由于此實(shí)驗(yàn)的成功，許多研究者都認(rèn)為植物內(nèi)生細(xì) 菌是一個很好的外源基因載體。 目前對植物內(nèi)生細(xì)菌的研究主要涉及兩方面的內(nèi)容。一是內(nèi)生細(xì)菌是否是植物病害潛在的感染源。二是對內(nèi)生細(xì)菌的生態(tài)學(xué)、生物多樣性以及群落分析的生態(tài)學(xué)研究：把棲息于宿主組織內(nèi)的全部細(xì)菌群落包括病理學(xué)范圍的潛伏的或條件致病的一些病原細(xì)菌認(rèn)為是植物微生態(tài)系統(tǒng)的正常群落。整個植株是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。高等植物分為根、莖、葉、花及果實(shí)、種子。這些不同的部位都是植物正常微生物群的不同生境，其間存在著一系列不同的微生物群落。在健康植物微生態(tài)系統(tǒng)中，這些微生物群落通過相互作用建立了一種微生態(tài)平衡。 病機(jī)制 人們普遍認(rèn)為拮抗細(xì)菌的防病促生機(jī)制是幾種或多種機(jī)制協(xié)同起作用 （ et 1993）。 了解生防細(xì)菌的生防機(jī)制，以便有針對性地加以利用，有目的地改進(jìn)劑型及使用方法，使其生防潛力得到最大限度的發(fā)揮，對于成功、高效地利用生防細(xì)菌防治作物病害具有十分重要的意義。 細(xì)菌拮抗土壤有害微生物的機(jī)理涉及 競爭（ 1992； 2000） 、拮抗（ 2002） 、寄生（ 林茂松， 1993） （圖 1） ？ 、促進(jìn)植株生長（ 徐進(jìn)， 2004） 、誘導(dǎo)植物抗性（陳志誼， 2001）、致弱 （ 劉波， 2004）等方面。 爭作用 生防菌和病原菌之間的競爭包括營養(yǎng)物質(zhì)的爭奪、物理位點(diǎn)和生物學(xué)位點(diǎn)的搶占等。生防細(xì)菌對生態(tài)環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，再加 6 上其代謝迅速、繁殖快，在空間的占領(lǐng)及其它方面的競爭中處于有利地位，生防菌優(yōu)先占領(lǐng)一定的生存空間后，形成一層天然的物理屏障來抵御病原菌的侵染。生防菌可以通過營養(yǎng)如 C， 爭，使病原菌喪失充足的營養(yǎng)從而生長受到限制。另外， 生防細(xì)菌產(chǎn)生嗜鐵素（ 爭 制病原菌的生長也是一個重要的生防機(jī)制（ et 1986； 1985； et 1984）。生態(tài)位的排斥是生防細(xì)菌拮抗病原菌的另一重要機(jī)制（ 1982）。根上的特殊位點(diǎn)如細(xì)胞間隙和根伸長處，存有大量根分泌物，有利于 細(xì)菌定殖。 圖 1 拮抗菌與病原真菌的相互作用（ et 2003） 種混有生防細(xì)菌的肥料可以阻礙病原菌在這些位點(diǎn)的定殖。拮抗微生物與病原菌對植物寄主分泌的營養(yǎng) 的競爭是一個普遍的現(xiàn)象。如在棉花種子的分泌物中，含有亞油酸等長鏈脂肪酸，它們是 孢子萌發(fā)所必須的。而陰溝腸桿菌 轉(zhuǎn)座子插入到 . 生防作用也就隨之喪失了。但把野生型 變體的生防能力又得到恢復(fù)。這些結(jié)果證明， E. 肪酸的競爭性利用而抑制病原菌（ et 1997a； 1997b）。微生物在根部的實(shí)際密度與根表面積之比非常低，因此有人認(rèn)為生防菌空間位點(diǎn)的競爭 7 不是其主要的生防機(jī)制，比如 1988）認(rèn)為細(xì)菌在根圍定殖的過程中主要是競爭營養(yǎng)而不是競爭空間。 抗作用 拮抗作用是指生防菌能夠產(chǎn)生對病原菌具有拮抗作用的物質(zhì)，這些物質(zhì)包括： 毒素； 溶菌酶或蛋白酶等，如果膠酶、葡聚糖苷酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、磷脂酶等； 缺陷型噬菌體； 具有抗菌作用的代謝產(chǎn)物，如氨類、有機(jī)酸等初始代謝的副產(chǎn)品和 其它次生代謝物； 抗生素； 細(xì)菌素或細(xì)菌素類似物等（ 1990）。如幾丁質(zhì)酶、抗生素、細(xì)菌素等，這些物質(zhì)通過干擾敏感病原菌的代謝過程而限制、控制或影響病原菌的生存活動，甚至殺死病原菌。如放射土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素 擾其吸收作用（ 1980）；軟腐歐式桿菌的細(xì)菌素能引起敏感細(xì)胞中磷脂的降解（王金生， 1985）。通常在培養(yǎng)皿中看到的抑菌圈就是抗菌物質(zhì)作用的表現(xiàn)。一般所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)都是有機(jī)物質(zhì)，它們在低濃度下就能對其他微生物的生長和代謝產(chǎn)生抑制效應(yīng)，由 于從死亡的細(xì)胞還可以釋放出抗菌物質(zhì)，所以即使是產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的微生物已經(jīng)停止生長，但抗菌物質(zhì)所產(chǎn)生抗菌作用還在繼續(xù)發(fā)揮，抗菌作用是比較穩(wěn)定的。 幾丁質(zhì)是多數(shù)真菌細(xì)胞壁以及無脊椎動物體壁的主要結(jié)構(gòu)成分，許多細(xì)菌、真菌及受誘導(dǎo)后的植物，在合適的條件下，能產(chǎn)生一些水解酶，將病原菌細(xì)胞壁水解。目前，研究較多的水解酶為幾丁質(zhì)酶和3葡聚糖酶，人們己對這兩種酶的性質(zhì)及抑菌活性做了廣泛研究，這兩種酶的酶解活性和抑菌范圍各不相同，兩種酶混合作用時，可增加抑菌范圍 （ et 1993； 1991； et 991； et 1988；但漢鴻， 1998）。 細(xì)菌素是由細(xì)菌的某些菌系所產(chǎn)生的對該種細(xì)菌以外的一些菌株或關(guān)系較近的細(xì)菌有殺傷作用、非復(fù)制性的含蛋白的抗菌物質(zhì)。細(xì)菌素分為兩大類，一類是分子量較小，對胰蛋白酶敏感，耐熱；另一類是分子量較大，在電鏡下有一定的形狀，類似噬菌體或噬菌體的碎 8 片，對胰蛋白酶不敏感，也不耐熱。抗生素是微生物所產(chǎn)生的具有生物活性的物質(zhì)，它在低濃度下就能抑制或影響其它生物的機(jī)能，從而對敏感微生物產(chǎn)生抑制或致死作用。傳統(tǒng) 的生物防治主要是研究有益微生物的活體應(yīng)用，從現(xiàn)代植病觀點(diǎn)來看，應(yīng)用微生物有益代謝產(chǎn)物來進(jìn)行病害防治的方法也應(yīng)列入生物防治的范疇（黃大昉， 2001）。 生防細(xì)菌還可產(chǎn)生多肽類活性物質(zhì)。如在芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽中，多數(shù)抗細(xì)菌，少數(shù)抗真菌。 1984）等從蠟狀芽孢桿菌（ B 純化出一種抗真菌環(huán)狀多肽 抑菌譜廣，活力強(qiáng)，能同時對絲狀真菌和酵母起作用，且耐熱性和穩(wěn)定性好。裴炎等（ 1999）報(bào)道從蠟狀芽孢桿菌 中分離出抗真菌多肽 度為 2g/可抑制黑曲霉和瓜果腐霉。劉穎等（ 1999）從枯草芽孢桿菌中分離出抗真菌肽 一種廣譜抗真菌小肽，對瓜果腐霉病菌（ 玉蜀黍赤霉病菌（ 長柄鏈格孢（ 水稻稻梨孢（ 有很強(qiáng)的抑制作用。孔建等（ 1999）報(bào)道枯草芽孢桿菌 生一種耐高溫抗菌物質(zhì)，有廣泛的抑菌譜，包括土傳鐮刀菌（ 氣傳植物病原菌如蘋果輪紋病 （ 番茄早疫病（ 韌皮部病菌。近年來多肽類抗生素的研究日益受到重視，研究的進(jìn)一步發(fā)展可通過基因定點(diǎn)突變技術(shù)對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以提高其活性。如 （ 1988）采用該技術(shù)修飾抗菌肽 其活性提高了 100 倍，既方便，成本又低。 至今發(fā)現(xiàn) 的拮抗細(xì)菌能產(chǎn)生 100 多種抗菌物質(zhì)，其中絕大多數(shù)為肽類抗生素，分子量 300們可能含有 般能抵抗蛋白酶的降解。這些 抗菌物質(zhì)包括： 環(huán)狀肽或環(huán)狀脂肽，分子量 1000右： , 線狀肽： 氨基糖苷類抗 生 物 ： 5究證明 的拮抗細(xì)菌的防病作用與其產(chǎn)生的 9 抗生 素有很大的關(guān)系。 （ 1994）從土壤中分離到 株，該菌株可以抑制由卵菌引起的病害，如 起的苜蓿猝倒病。研究發(fā)現(xiàn)該菌可以產(chǎn)生兩種抗生素： 和 是一種氨基多元醇，化的 抑制 芽管的伸長而 起孢囊的膨脹。用轉(zhuǎn)座子絲裂霉素 C 誘變 獲得 5 個抗生素減少的突變體，這 5 個突變體的生防能力都顯著下降，而向突變體處理的苜蓿的根部再加入 或 蓿猝倒病又被明顯抑制，說明兩種抗生素在 制苜蓿猝倒病中起重要作用（ 1991； 1995）。 3 植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展及其存在的問題 植物內(nèi)生菌是一個多樣性十分豐富的微生物類群，分布于沒有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)，并與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，其存在和作用長期以來一直為人們所忽視 。隨著研究領(lǐng)域的不斷拓寬和研究方法的不斷深入，植物內(nèi)生菌的生態(tài)和生理作用及其作為潛在的生防資源和外源基因載體，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大應(yīng)用潛力，已逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn) 。 植物內(nèi)生菌的研究其始于 19世紀(jì)中葉， de 先提出植物內(nèi)生菌一詞 后在幾種牧草植物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌，對植物內(nèi)生菌并沒有進(jìn)行更深入的研究，直到 1977年 引起廣泛的關(guān)注，在其后的十幾年時間，側(cè)重與草本植物內(nèi)生菌研究，特別是對感染內(nèi)生菌的牧草對草食動物的影響 以及對食葉蟲的影響方面研究。 20世紀(jì)90年代以后，在植物內(nèi)生菌方面的研究范圍擴(kuò)大了，不僅僅局限于牧草植物內(nèi)生菌的研究，也從其他不同植物中分離內(nèi)生菌，研究其植物生物多樣性，生物學(xué)作用，侵染途徑以及與宿主之間的關(guān)系等，特別是 1993年 植物內(nèi)生菌又有了更深的了解，掀起了從植物內(nèi) 10 生菌中尋找心物質(zhì)的熱潮，一些心的抗腫瘤，抗菌，抗蟲物質(zhì)先后從內(nèi)生菌中分離出來，在研究植物內(nèi)生菌的過程中引入了現(xiàn)代分子生物技術(shù)，從而使對內(nèi)生菌的研究進(jìn)入了分子水平，植 物內(nèi)生菌的來源于外界環(huán)境微生物，以不同方式進(jìn)入植物組織中，通過水平和垂直方式進(jìn)行傳播，其遺傳與代謝都由于與宿主在長期共同進(jìn)化過程中相互作用而有別與外界環(huán)境微生物。幾乎所有的植物中都有生活的內(nèi)生菌，現(xiàn)在僅僅對極少數(shù)植物內(nèi)生菌進(jìn)行了完全的研究，因此從植物內(nèi)生菌尋找到新物質(zhì)的餓幾率是很大的，并且植物內(nèi)生菌本身作為新的微生物資源也具有廣泛的研究價值。 4 生防細(xì)菌的定殖研究 大多數(shù)研究者認(rèn)為（ et 1951），植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入植物體內(nèi)的方式和途徑與植物病原細(xì)菌相似，也主要是通 過自然孔口和傷口等進(jìn)入植物體內(nèi)。這些孔口主要包括氣孔、皮孔、水孔、蜜腺、胚根和次生根形成時的組織傷口、破裂毛狀體、根在土壤中伸展時造成的持續(xù)不斷的擦傷口，以及風(fēng)吹土粒、雨水造成的葉片損傷、或根部分生組織等。一般認(rèn)為，細(xì)菌沒有特殊的穿透結(jié)構(gòu)，它們不能主動穿透完整的表皮細(xì)胞。但有研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細(xì)菌除能通過上述自然孔口和傷口進(jìn)入植物體外，有的還能通過根毛細(xì)胞的入鞘作用、根毛與鄰近表皮細(xì)胞壁水解酶進(jìn)入植物組織體內(nèi)。另外內(nèi)生細(xì)菌還可以通過維管束系統(tǒng)進(jìn)入種子，或通過禾谷類花粉管通道、成熟種子的種臍、種皮的裂縫開口、 種莢、種皮背部索狀細(xì)胞進(jìn)入種子，或通過次生根進(jìn)入分生組織，或通過葉表吐水孔進(jìn)入葉內(nèi)等。 1996）報(bào)道，用處于根際的致金色假單胞桿菌（ 以從 16種單子葉和雙子葉植物的地上部組織中分離到該菌，在植株地上部細(xì)菌可通過莖表和葉表侵入植物。研究還發(fā)現(xiàn)，根部接種后，莖部經(jīng)消毒處理，仍可以從地上部植物組織中分離到該細(xì)菌。這表明，細(xì)菌可以通過植物維管束組織從根部傳導(dǎo) 11 至莖部。 內(nèi)生細(xì)菌可以隨植株的生長而繁殖運(yùn)轉(zhuǎn)。在植株生長的各個不 同階段，其中的細(xì)菌群體的數(shù)量有較大變化。除了由種子傳播的內(nèi)生細(xì)菌外，在內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入植物內(nèi)部之前必須首先在根部表面定殖。這些細(xì)菌由于趨化性（ 向電性（ 者偶然的碰撞而與宿主相接觸。研究 者胞外蛋白（ 泌不足或者是過量表達(dá)的 現(xiàn)這一過程可以分為三個階段：細(xì)菌吸附到根部表面（快速但是是一種細(xì)菌與宿主之間弱的相互作用）；錨定在根部表面（強(qiáng)的相互作用）；定殖在 根表面的同時，一些細(xì)菌進(jìn)入根內(nèi)（ et 1989）。 與根圍細(xì)菌相同，內(nèi)生細(xì)菌在植物組織中的定殖也受多種生物和非生物因子影響。植物相關(guān)內(nèi)生細(xì)菌與其它植物內(nèi)部定殖微生物如其它細(xì)菌、真菌、病毒等共同存在。由于它們的生存需要的空間和營養(yǎng)都由寄主植物提供。因此，它們之間必然存在著競爭、拮抗、共生和（或）互利共生等關(guān)系。在玉米根部接種絲核菌（ 促進(jìn)一種腸桿菌（ 一種假單胞菌（ 89定殖（ et 1997）。另外，內(nèi)生細(xì)菌在植物根和莖的較低部位占優(yōu)勢，而內(nèi)生真菌在莖的中段占優(yōu)勢。內(nèi)生真菌和細(xì)菌的這種關(guān)系或許可在實(shí)踐中用來作為控制根和維管束病原菌的生防因子組合。內(nèi)生細(xì)菌之間也有類似關(guān)系。一種系統(tǒng)定殖菌（ 一種根際定殖菌（ 同應(yīng)用與 一應(yīng)用相比， 種群密度沒有受到影響。然而，當(dāng) 另一種內(nèi)生細(xì)菌（ 同應(yīng)用，與各自單一應(yīng)用相比，這種共存導(dǎo)致了兩者的種群密度下降 （ 關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌與病毒之間的互作了解較少。不過有報(bào)道表明馬鈴薯 X 病毒沒有對莖和塊莖中的內(nèi)生細(xì)菌種群表現(xiàn)出影響（ et 1974） 。 目前用于檢測內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)定殖的方法，主要有抗生素標(biāo)記，膠體金熒光免疫電鏡觀測法、血清學(xué)方法、熒光標(biāo)記等，其中以抗生 12 素標(biāo)記法較多。在抗生素標(biāo)記法中又以抗利福平標(biāo)記為主，大部分內(nèi)生定殖動態(tài)研究均以抗利福平為標(biāo)記。一旦進(jìn)入植物組織，有的內(nèi)生細(xì)菌在專一 性植物組織如根皮層成為局部定殖者。有的通過輸導(dǎo)組織轉(zhuǎn)運(yùn)或主動遷移而成為系統(tǒng)定殖者。 到達(dá)未開的花和棉鈴中。不同的植物細(xì)胞組織定殖的內(nèi)生細(xì)菌類群存在差別。一般說來，內(nèi)生細(xì)菌主要定殖于植物細(xì)胞間隙，也有一些研究表明內(nèi)生細(xì)菌也可定殖于細(xì)胞內(nèi)。在維管束系統(tǒng)也廣泛存在內(nèi)生細(xì)菌，但是，至于維管束系統(tǒng)只是提供一個轉(zhuǎn)運(yùn)通道還是確實(shí)是一個繁殖場所還不太清楚。如果后者具有可能，那么大量的細(xì)菌將導(dǎo)致堵塞而致病。這或許可以解釋為什么在維管束系統(tǒng)中內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量較低。一般情況下，內(nèi)生細(xì)菌的 種群數(shù)量級最高為 106g 新鮮組織，而病原細(xì)菌的最低數(shù)量級為 107g 新鮮組織。據(jù)推測，空間限制或許是內(nèi)生細(xì)菌的一個特性。同時或許也是內(nèi)生細(xì)菌與植物病原細(xì)菌之間不同的一個主要因素 5 宿主一內(nèi)生菌一內(nèi)生菌之間的關(guān)系 主與內(nèi)生茵關(guān)系 在宿主與內(nèi)生菌的長期進(jìn)化過程中，形成一種共生或互生的關(guān)系，不同的植物其內(nèi)生菌的種類、基因型是不相同的，內(nèi)生菌對宿主也具有選擇，其相互作用還受到環(huán)境因子的影響，環(huán)境條件和宿主基因型決定內(nèi)生菌的遺傳多樣性，環(huán)境與宿主基因型的相互作用可能使宿主對某一種特殊內(nèi)生菌基因 型敏感性會隨環(huán)境的改變而改變，一種特殊的內(nèi)生菌基因型需要找到正確的宿主基因型才能成功感染(Ahet 2002)，在宿主的影響下，內(nèi)生菌的不同亞群會在不同的環(huán)境中形成，當(dāng)宿主植物在環(huán)境惡化的情況下，它會選擇那些增強(qiáng)其抵抗惡劣環(huán)境的內(nèi)生菌亞群的侵染 (， 2001) 。在宿主與內(nèi)生菌的相互作用過程中，內(nèi)生菌的生長代謝行為會受到宿主基因型的影響，有的物質(zhì)代謝會受到制約，但宿主植物對內(nèi)生菌的選擇性調(diào)控更為有利內(nèi)生菌代謝 (S， Pt 2002) ， 13 001) 等也在研究黑麥草內(nèi)生真菌在宿主的生長情況發(fā)現(xiàn)，任一段 中的內(nèi)生菌菌絲的平均數(shù)量在整個葉片的生長期是保持不變的，隨葉片的生長而生長，葉片生長停止菌絲也停止生長。內(nèi)生菌的代謝行為也影響宿主的生長，內(nèi)生菌的固氮作用、產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以促進(jìn)宿主植物的生長，對無機(jī)磷的溶解可增加宿主營養(yǎng)，誘導(dǎo)宿主植物病蟲害防御體系。 生菌之間相互關(guān)系 在宿主植物中，內(nèi)生菌是相互作用，共同起作用促進(jìn)植物的生長( et 2002 ，但內(nèi)生菌之間是相互制約的，一種內(nèi)生菌可能抑制 其中一些其它內(nèi)生菌而促進(jìn)另外一些內(nèi)生菌的生長，使內(nèi)生菌之間在宿主植物中達(dá)到一種動態(tài)平衡 (L， et 2001) 14 第二章 香蕉 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性研究 驗(yàn)材料 本采集： 從漳州采集兩個品種， 一株帶病植株得香蕉，一株健康的香蕉，都處于成果期。一株 健康的米蕉。 養(yǎng)基 普通細(xì)菌分離用 養(yǎng)基， 養(yǎng)基 。 養(yǎng)基：牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 1g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000mL，養(yǎng)基：馬鈴薯 200g 蔗糖（或者葡萄糖） 20g 瓊脂 17g。蒸餾水 自然 。 酸堿度調(diào)節(jié)到要求，分裝，滅菌（ 121 ） 20養(yǎng)基購自美國 司 生細(xì)菌的分離 將采回的健康香蕉植株葉子分 3 個部位，計(jì)為葉上部，葉中部，葉基部，每個葉子處理分為葉 基部 ，葉 中部 ，葉 尖部 。莖部分 5 個處理，計(jì)為，莖部 1，莖部 2，莖部 3，莖部 4 莖部 5（根莖交接處） ，根部分 2 個處理 ，計(jì)為根尖，和根基 ，計(jì)為根尖部和根基部，稱重。消毒：將各部位樣品分別在 75%酒精中浸泡 2s，然后用 汞 溶液消毒 2菌水沖洗 3 次。用滅菌的濾紙吸干水分，加 1菌水于研缽中研磨成勻漿。記為梯度 1。移取研磨液采用系列濃度梯度稀釋法進(jìn)行稀釋， 取每個稀釋度的菌液 勻地涂布于 板上，其中 養(yǎng)基的平板于 30 人工氣候箱中培養(yǎng)。每個處理涂三個梯度，每個梯度作三個重復(fù)。 15 自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定（劉志輝等， 2005；張國賞等，2000） 。 肪酸的提取 （ 1）細(xì)菌培養(yǎng)條件： 板培養(yǎng)基，四線劃線線法，培養(yǎng)溫度（ 281） ，培養(yǎng) 時間（ 242） h；（ 2）獲菌：用接種環(huán)挑取 35 環(huán)（約 40重的菌落進(jìn)入一個干凈、干燥的 1300螺旋蓋的試管中（最佳的獲菌區(qū)域?yàn)榈谌齾^(qū)）；（ 3）皂化：加入（ .1）試劑 1，擰緊蓋子，振蕩 5 10 s，放入 95 100 的沸水中 5溫冷卻，振蕩 5 10 s，再