密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 水稻矮稈 因的精細定位 F N F N y u A 要 植物中矮稈突變體不僅對于闡明植株生長與發(fā)育機制非常重要，對作物，特別是水稻，小麥等主要農(nóng)作物，育種改良也很有幫助。目前水稻中已報道有六十多個矮稈突變體，但真正分離到引起矮稈突變的基因并闡釋其突變的本質還是不多，調控植株高度發(fā)育的網(wǎng)絡機制遠未建成。因此發(fā)現(xiàn)新的矮稈突變體并理解其突變機制很重要。我們從秈稻品 種 9311 中發(fā)現(xiàn)一自發(fā)突變的矮稈水稻，該突變體與矮稈突變體 似：莖短而壯；葉片顏色深綠、寬而短，但葉片卷曲或扭曲，粒型變小， 將這個基因暫命名為 遺傳分析和等位性測驗表明該突變體的表型受隱性單基因控制，且不與 d1,d2,位。激素處理的結果顯示， 矮桿性狀表現(xiàn)為 敏感型。 為了研究 因的功能，我們從大約 6,500 株 500 個突變個體用作定位群體，用圖位克隆的方法精細定位了基因。首先將基因定位在水稻第 9 染色體 短臂上，最后將 點定位在約160基因組 域?；虻姆肿佣ㄎ粸橐院蟮幕蚩寺〖肮δ芊治龃蛳铝肆己玫幕A。 - 關鍵詞 ：水稻， 變體 ， 因，精細定位 in is in as 0 in a of in of is so is . A in a 311 . of We as of by to d1,d2,is to A, it is A To we - by a ,500 us to a it in a 160kb an to be by .), 錄 摘 要 . I . 一章 文獻綜述 . 1 1. 水稻矮稈性狀的遺傳研究 . 1 2水稻植株矮化機制研究 . 1 稻植株矮化與節(jié)間或細胞長度、數(shù)目的關系 . 1 稻植株矮化與溫度的關系 . 2 3 關的株高突變體的研究進展 . 2 A 反應的正向調節(jié)物 . 3 A 反應的負向調節(jié)物 . 5 4. 矮化植株與 系的研究 . 5 5. 水稻基因精細定位與克隆 . 6 位克隆的原理 . 6 圖位克隆的應用 . 7 物信息學的應用 . 7 變體資源的應用 . 7 - 6本論文研究內容提出 . 8 第二章 材料與方法 . 9 1 實驗材料 . 9 1 1 植物材料 . 9 1 2 常用分子生物學試劑 . 9 2 實驗方法 . 9 2 4 突變體的生理學分析 . 10 2 5 定位群體 . 10 2 6 水稻 取 . 10 2 7 通過 記定位 因 . 11 2 8 因的物理定位 . 11 第三章： 結果與分析 . 12 1. 水稻矮稈突變體 分離及遺傳分析 . 12 1 稻矮稈突變體 分離 . 12 稻矮稈突變體 遺傳分析 . 13 2. 水稻矮稈突變體 d1,d2,兩個新發(fā)現(xiàn) 等位性實驗 13 3. 生理學分析 . 14 4. 因的圖位克隆（ . 15 因的初步定位 . 15 因的精細定位 . 17 . 18 第四章 結論與討論 . 19 參考文獻 . 20 致 謝 . 27 作者簡歷 . 28 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 1 - 一章 文獻綜述 1. 水稻矮稈性狀的遺傳研究 從廣義上講，水稻的矮生性是指成熟期水稻株高比正常植株縮短的遺傳特性。同時，根據(jù)株高縮短的程度，又可將廣義的矮稈分成半矮稈、矮稈和極矮稈 3 種類型。矮稈（狹義）通常指成熟時植株高度等于或低于原正常植株高度 一半的矮稈突變系；半矮稈則是指株高介于矮稈和正常高度之間的類型。 經(jīng)典遺傳學表明水稻株高既屬于數(shù)量性狀，又表現(xiàn)為質量性狀遺傳。在秈稻中，矮稈遺傳主要受 1 個隱性半矮稈基因控制（ 遺傳力較高，與高稈品種雜交后代呈高稈和矮稈的雙峰分布，并且大多數(shù)半矮稈秈稻品種的半矮稈基因均為 復等位基因。在粳稻中，矮稈遺傳與秈稻相似，但根據(jù)控制矮稈的基因對數(shù)可以將粳稻矮稈品種分為兩類，一類由單個矮稈主效基因控制；另一類由多個矮稈微效基因控制，而且，控制粳稻矮稈的主效基因一般為非等位關系（顧銘洪等， 1980）。 20 世紀末，隨著分子生物學的發(fā)展，利用分子標記對控制水稻株高性狀進行 測，將對水稻矮稈性狀遺傳研究從經(jīng)典遺傳學的水平深入到分子水平，為最終闡明水稻矮稈的遺傳機制奠定了基礎（吳平 , 1996）。 1986 年日本的水稻基因符號、命名和連鎖群委員會（ 矮稈基因統(tǒng)一定名。具有強矮化效應、植株表現(xiàn)為矮稈（狹義）類型的基因定名為 d 系統(tǒng)，而具有較弱矮化效應、植株表現(xiàn)為半矮稈類型的基因 定名為 統(tǒng)，根據(jù)被鑒定的時間順序，從 1 往后排（ 1986）。目前，已分別注冊到 中部分矮稈（半矮稈）基因是相同的或等位的；例如， 16 ， 別是等位的（ , 2001）。 2水稻植株矮化機制研究 水稻植株矮化是矮稈主基因表達作用的結果，同時也受到修飾基因或抑制基因的影響（ , 1997）。一般認為矮稈基因的作 用能直接導致水稻植株形態(tài)學或細胞學的變化，如節(jié)間變短和細胞個數(shù)減少，從而使植株變矮；同時，基因的表達還受到外部環(huán)境和內源條件的影響。 稻植株矮化與節(jié)間或細胞長度、數(shù)目的關系 一般認為，水稻植株的矮化是由于節(jié)間長度縮短或節(jié)間數(shù)減少的結果，也可能是兩者共同作用的結果。 （ 1969）以節(jié)間長度占株高的比例為指數(shù)，將矮稈分為 種基本類型，而將節(jié)間比例正常的品種標定為 N 型。 的特征是節(jié)間比例與 N 型相同； 的特征是倒 2 節(jié)間特別短； 的特征是倒二節(jié)間 縮短； 的特征是有頸葉，倒 1 節(jié)間短而第 4 節(jié)間長，偶爾有第 6 伸長節(jié)間； 的特征是倒 1 節(jié)幾乎不伸長，穗子包藏中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 2 - 在劍葉葉鞘中。除 以外的所有矮稈類型都存在某一節(jié)間顯著縮短的特征。這表明不同的矮稈基因作用于水稻植株的不同伸長節(jié)間，換言之，矮稈基因對植株的矮化作用只是在某一特定生長時期發(fā)生，結果導致某些節(jié)間顯著縮短。 20 世紀 80 年代前，有關水稻矮稈機理的研究主要集中在外部形態(tài)。由于細胞的生長和功能決定植株器官的結構和功能，分析水稻植株的矮化機理有必要進行細胞學的研究。 （ 1981）通過對許 多等基因矮稈系的研究，發(fā)現(xiàn)節(jié)間長度與細胞數(shù)目呈高度正相關，而與細胞長度無顯著相關性，表明節(jié)間的縮短可能是細胞數(shù)目減少的結果。 稻植株矮化與溫度的關系 部分矮稈基因對水稻植株的矮稈作用與溫度存在相互作用。矮稈突變系“ 原品種“ 不同溫度下的節(jié)間長度差異存在明顯變異：在 25高溫條件下，株高只有 46為原品種的 56%；在 18低溫條件下，其株高達到 60是原品種的 84%。對細胞組織形態(tài)進行觀察發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下生長的 間薄壁細胞排列不規(guī)則，縱向細胞數(shù)減少，但橫向細胞數(shù)明顯增加。而在低溫條件下細胞生長則無異?，F(xiàn)象發(fā)生。這表明 矮稈基因對溫度敏感，在高溫條件下由于居間分生組織的異常使植株矮縮。此外，攜帶矮稈基因 植株在低溫條件下生長時表現(xiàn)矮稈小粒，在高溫條件下則表現(xiàn)正常（ , 1981）。 3 相關的株高突變體的研究進展 過去的近五十年，世界人口迅猛增長，從 30 億增加到 60 億，糧食危機日益嚴重。由于半矮稈基因 (入水稻而促進世界范圍內水稻 產(chǎn)量的大幅度提高，對于解決日益增加的糧食危機具有重要的作用。這項矮化育種的成就舉世矚目，被譽為綠色革命 (2002; 2002; 003)。莖是支撐植物直立生長，及穩(wěn)定性的重要單位。合適的株高是對于決定植株的生長，特別是對于禾本科作物的結實具有重要的作用。因此，研究植株生長機理，對合理有效地利用這些資源，改良品種無疑具有重要作用。 在所有已知的株高突變體中，它們絕大多數(shù)都與激素有關，特別是與 成有關。目前，雖然在植物體內還沒有分離到 受體，但是通過分離 號的上游調控物質，或者順式及反式的下游調控因子，有關 植物體內的合成及功能研究取得了較大進展。通過有關激素生理學研究，確定各合成突變體的阻斷位點，基本弄清了 物合成的主要途 徑（圖 3） (998; 2002; 2002)。在玉米中，已鑒定出至少 5 個參與 成的基因 些基因變異后最顯著的影響是導致植株矮化及雌穗雄化。此外，這些變異株中的 量比正常對照的要低得多。施加外源 變異株的高度及其他性狀恢復正常。 通過進一步的研究已經(jīng)找到了這些突變基因的阻斷位點。在擬南芥中也鑒定了 5 個參與 成的基因 ( 在豌豆中也發(fā)現(xiàn)了類似的變異 ( 目前關于 能的基本一致的看法是： 1 促進莖和葉伸長。 2 誘導種子中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 3 - 發(fā)芽。 3 調節(jié)開花時間和花、果實及種子的發(fā)育。下面就調控 號的相關突變體的研究作一綜述。 圖 1A 的合成 A A 反應的正向調節(jié)物 變體 稻矮桿突變體 (1999; 2000)和 敏感突變體 (2003; 004)以及擬南芥突變體 (1998)均表現(xiàn)為半矮桿（約 90 110葉色深綠。 碼 G 蛋白的亞基，它的突變導致植物體內的 量明顯降低，但是高于其它 成途徑缺失的突變體。當外施 ，它的矮桿表型不能完全被恢復，即使在飽和濃度的 理時，也只能部分恢復表型。在橡膠糊粉層研究中證明， G 蛋白做為信號分子發(fā)揮了重要的作用。在突變體 ，因 G 蛋白并不參與 成，所以推測其與橡膠中一樣，參與 號傳導。然而，一個值得探討的問題就是：擬南芥中也只有一個 G 蛋白，但是，當用外源 理時，擬南芥 G 蛋白缺失突變體 夠恢復表型。這說明在不同的植物體內， G 蛋白的功能并不完全一致。在水稻中還存在另一種 號途徑 (004)。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 4 - 周期反應 1 突變體（ 光周期反應 1 突變體（ (2001)是在短日條件下篩選那些表達量有所變化的基因時發(fā)現(xiàn)的。當將 因反義抑制時，發(fā)現(xiàn)植株株高變矮，并且對外源 敏感。 過量表達 ，植株表現(xiàn)出生長更快，比野生型對 敏感。證明 一個 號的正向調節(jié)物。將 白與 白融合，發(fā)現(xiàn) 核中表達，證明 位在核中。在果蠅和無脊椎動物中，信號分子 兩種重要組份犰狳 ( 們中包含一種保守結構域，命名為犰狳。 括 7次犰狳 (復。 列的缺失證明這段序列在核定位過程起作用。 變體 碼一種 白，可能是 一類 3 連接酶 合體的一個亞基。合體除了包含 白以外，還包括 白以及含 構域的 白 (1998; 1999)。其中 白結合到 過程中， 白的 N 端的 40 60 個氨基酸是必需元件，而 C 端則在識別哪些蛋白可以與 3 復合體相結合以及在 26S 蛋白酶降解的過程中起作用。已經(jīng)證明由 導的蛋白水解在植物體的多種發(fā)育過程，比如花發(fā)育、光周期反應、光受體信號、衰老以及激素信號中均有調控作用。 A 信號過程中的負調控物 穩(wěn)定性來達到控制 應，進而控制植物高度。 變體 變體 現(xiàn)為明顯的矮化，并且對 現(xiàn)不敏感。 白包含 除了控制株高以外，還與 起相互作用去調控開花時間。在短日照條件下， 雙突變體表現(xiàn)出了開花時間嚴重延遲。它們共同參與 號的調控。 此外， 參與 號以外的生理反應。當 雙突變體中，出現(xiàn)了異位葉的表型。因此，雖然 與 號是肯定的，但是，如何 號中發(fā)揮作用以及如何調控異位葉的出現(xiàn)，仍不清楚。 A 不敏感突變體 1（ 白與酯酶、脂肪酶和蛋白酶等蘇氨酸家族成員極其相似，但是它在體內的功能仍然不清楚。當用 理突變體時，淀粉酶活力并不像已知的與 關的突變體，如 是 表達量卻高于野生型。另外，通過與 建雙突變體，發(fā)現(xiàn)突變體表現(xiàn) 表型，證明它是在 上游參與 號。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 5 - A 反應的負向調節(jié)物 白 有自己獨特的 構域。 蛋白已經(jīng)從多種植物體，如擬南芥 (1997; 2001; 2002)、小麥 (2002; 2002)、水稻 (2001; 2001)和大麥 (999)中鑒別獲得。這些突變體可以分為兩類，一類是半顯性的擬南芥、小麥和大麥矮桿突變體。另一類隱性的是株高伸長的擬南芥、大麥和水稻突變體。大麥和水稻中的兩個這樣的基因是 它們在體內作為 徑的負調控因子參與植物的生長發(fā)育過程。 突變導致 變體中的一些如毛狀體起始延遲、莖桿變短等表型消失。 是沒有 顯。 雙突變的植株株高及開花均恢復正常，甚至 含量還有所提高。 三突變體不能夠發(fā)芽 ,說 明它們還在控制發(fā)芽過程中起作用。 變體含有比野生型更多的 性物質，反饋調節(jié) 合成。 白在 缺失 17 個氨基酸，因而導致蛋白失活而不能降解 量提高，進而表現(xiàn)出莖節(jié)伸長的表型。 變體 c/ 1999)。該突變體表現(xiàn)為下胚軸較短、偏上位的子葉節(jié)、葉基部較窄和短葉柄，這種表型在第一葉表現(xiàn)的尤為明顯。雖然突變體 外施 能恢復 此， 據(jù)轉座子的插入位點及 實 野生型的 示 少 1999; 2001)。 少了淀粉酶的表達，說明 而，因為擬南芥中有九個 以 此，有關 需進一步的研究。 4. 矮化植株與 系的研究 近年來的研究表明水稻矮化也與 合成及其信號傳導受阻有關。在擬南芥中已經(jīng)克隆到 13 個與 成相關的基因（ 及 4 個與 導相關的基因 國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 6 - 中 別編碼一個富含亮氨酸的蛋白激酶， 碼一個絲氨羧肽酶， 對 號轉導的負調控，它位于 游，編碼一個 似的激酶（ , 2001； , 2002;， 2004， 2004）。在水稻中也克隆到了 3個與 成相關的基因 及 1 個與 導相關的基因 2000; , 2002; , 2003;， 2005）。 5. 水稻基因精細定位與克隆 隨著擬南芥和水稻基因組的測序完成，一個重要的目標就是鑒定和克隆在農(nóng)藝生產(chǎn)上有價值的基因。目前主要的策略是采用圖位克隆法以及利用突變體和生物信息學。 位克隆的原理 克隆基因最經(jīng)典的方法就是圖位克隆法（ 它是基于遺傳作圖和物理作圖的一 種克隆基因的方法。它的原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有穩(wěn)定的基因座位，在利用分子標記技術對目的基因進行精細定位的基礎上，用與目的基因緊密連鎖的分子標記篩選基因組文庫，從而構建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步行（ 逐步逼近目的基因或利用染色體登陸（ 方法最終找到包含目的基因的克隆，并通過遺傳轉化試驗來驗證目的基因的功能。 圖位克隆法無需預先知道基因的 列和其表達產(chǎn)物的有關信息，但是應具備兩個基本條件：一是構建 遺傳群體。常用的遺傳群體有 交（ 加倍單倍體（ H）、重組自交系（ 近等基因系（ 以及由這些群體衍生的群體，如測交群體（ 高代回交群體（ 二是具有包含目的基因的遺傳圖譜和物理圖譜。構建遺傳圖譜 常用 的 分子標記有：限制性片段長度多態(tài)性 ( 微衛(wèi)星 (、序列標記位點 (和酶切擴增多態(tài)序列 ( 圖位克隆法主要包括四個基本技術環(huán)節(jié)：目的基因的初步定位；精細定位；目的基因所在區(qū)域物理圖譜的構建；篩選 庫或基因組文庫并進行功能互補實驗。其中目的基因的精細定位是圖位克隆策略中最艱苦和最耗時的限速步驟。利用 混合樣品作圖可以有效地提高精細定位的效率（ 1993）?；旌蠘悠纷鲌D是在準確鑒定目的基因的表型的基礎上，把大群體中的單株分別混合提取 用目的基因附近的所有分子標記對混合的 品池進行分析，根據(jù)所有池中包含有交換的 的比例來確定與目的基因最連鎖的分子標記和目的基因附近分子標記的順序。混合樣品作圖技術可以極大的提高分子標記分析效率，減少 取的工作量，有利于擴大群體，加快基因克隆速率。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 7 - 圖位克隆的應用 隨著水稻高精密遺傳圖譜和物理圖譜的相繼構建成功（ ， 1998； ， 2002），尤其是 全基因組測序結果的公布（ 2002； ， 2002），為水稻基因的精細定位以及后續(xù)的圖位克隆創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。早期在水稻中克隆的兩個抗白葉枯病基因和兩個抗稻瘟病基因均是利用圖位克隆戰(zhàn)略完成的。其中 克隆是在獲得了一個與抗病基因共分離的分子標記進行染色體登陸實現(xiàn)的（ ， 1995）；而 是通過染色體步行實現(xiàn)的（ ， 1998； ， 1999； ， 2000）。最近報道的一些水稻基因的圖位克隆則是以突變體為材料，如矮稈基因 分蘗基因 矮稈基因 1999; 2003; ,2003; ,2003）。 從 13000 個 株中選取了 3185 個矮稈植株，應用 分子標記將 因定位于 小區(qū)域內，并應用 1 基因 以 起點的圖位克隆則相對于主基因的克隆更為困難一些，主要是由于 效應一般都較小又受基因組背景的調節(jié)，且易受環(huán)境的影響。 1996 年 次在番茄中克隆了控制果重的 ， 1996）。迄今，最為成功的例子莫過于日本研究人員對一系列水稻抽穗基因的克?。?, 2000; , 2002; , 2001）。 應用 群體（ 9000）將 位于約 12 小區(qū)間，并最終克隆到了與擬南芥花期基因 源的 因。 物信息學的應用 隨著擬南芥和水稻基因組的測序完成以及數(shù)據(jù)的釋放，生物信息學越來越突現(xiàn)出其重要性。當目的基因精細定位到一定小的區(qū)域時，候選基因的確定就非常關鍵 了。應用生物信息學可以快速、省時和準確地確定目的基因。 將單分蘗基因 細定位到約 20 小區(qū)間，通過基因注釋，發(fā)現(xiàn)在 20 小區(qū)間里有一個編碼蛋白與番茄的 S)蛋白高度同源。而在番茄中， 因缺失功能的突變體則表現(xiàn)出不能分枝的表型。從而以此作為候選基因，通過 構和互補實驗等最終克隆 因。 對 克隆同樣依賴于生物信息學。在 細定位甚至是初步定位的基礎上，利用生物信息學提取眾多的預測基因，并通過對性狀及生理生化等的分析，從而可 以確定候選基因，最終克隆基因。最近， （ 2004）就利用日本晴及其一個近等基因系 于第 1 染色體長臂上的一個淀粉合成相關基因：蔗糖磷酸合酶（ 變體資源的應用 近年來，利用突變體資源克隆基因發(fā)展迅速。相對于圖位克隆法需要花很長的時間來縮小基因或 處的區(qū)域，利用突變體克隆基因具有快速，便捷的優(yōu)勢。 目前建立突變體庫的方法主要有以下幾種方法： 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 - 8 - （ 1） 接插入法。 用其轉移特性插入到植物基因組中。 在基因組不同的部位造成各種插入結果。由于多數(shù)突變性狀是由隱性基因決定的，所以一旦確定了突變性狀和 連鎖的，就可以通過獲得 旁鄰序列，從而 得到被標簽的功能基因。 （ 2）轉座子系統(tǒng)插入法。由于轉座子的特殊特性（它的插入會引起基因突變，而當它割離之后基因的功能又可以恢復），可以將它作為一個插入突變原，用來克隆因為轉座子插入而失活的基因。 （ 3）逆轉座子標簽法。逆轉座子被認為和基因的復制和基因的表達調控相關。當植物染病、創(chuàng)傷或是在組織培 養(yǎng)時都會發(fā)生逆轉座子的轉座。 （ 4）增強標簽法。因為正常情況下基因產(chǎn)物的數(shù)量是限定的，必須與其他產(chǎn)物達到平衡?；虍a(chǎn)物的不足和過量都會破壞這種平衡，并表現(xiàn)出生長與發(fā)育的異常。該標簽系統(tǒng)在 使細胞中某一基因過量表達。 根據(jù)突變體的表型，利用生物信息學可以查找擬南芥以及其它禾本科作物中已經(jīng)克隆到的基因，通過序列的比對，在水稻中找到一些同源基因，繼而進行基因的克隆與功能研究。最新報道的一些水稻基因就是通過這種策略完成的，如 ,2001; ,2000; , 2002 )。 獲得一個單隱性矮稈突變體后，通過表型的觀察、外源激素的處理以及內源激素含量的測定，發(fā)現(xiàn)矮稈是由于 成的一個關鍵酶 過數(shù)據(jù)庫的查找，發(fā)現(xiàn)了一個與番茄中編碼 因以及擬南芥 因同源的 生型和 列的測定驗證了缺失和插入引起了移碼并造成了的 功能缺失。 6本論文研究內容提出 植株株高是構成植株株型的重要因子。適宜的株 高是保證農(nóng)作物高產(chǎn)的重要保證。六七十年代在小麥、水稻的矮化育種而掀起的“綠色革命”即是明證。水稻中已報道有六十多個矮稈突變體，但分離出的矮稈突變的基因并闡明其突變本質的還不多。由于植株生長發(fā)育是一個很復雜的現(xiàn)象，有很多基因參與調控。因此利用更多的矮稈突變體，分離出更多導致矮稈突變的基因，不僅有利于弄清植株形態(tài)建成的內在分子機理，而且有助于建立主要農(nóng)作物分子輔助育種體系。 本研究的水稻矮稈突變體 自秈稻 9311 自發(fā)突變后代， 該突變體與矮稈突變體 似：莖短而壯；葉片顏色 深綠、寬而短，但葉片卷曲或扭曲，粒型變小。 目前 它編碼一個 G 蛋白亞基，參與了 信號傳導 ， 而且 因很可能單拷貝存在水稻基因組。但 上下游關系還很不確切， 號傳導的途徑還很不完整。分離因有助于建立基因之間互作關系。 我們擬采用圖位克隆的方法精細定位因，為今后分離 因和研究其功能，在分子水平上闡明水稻植株高度