密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 食用菌遺傳多樣性研究中的應(yīng)用 摘 要 本 研究 以 黑木耳 （ 、 白靈菇 （ 、灰樹花 （ 、金針菇 （ 、滑菇 （ 、茶樹菇 （ 、杏鮑菇 （ 和雞腿菇 （ 等 8 種食用菌 105 個菌株 為 材料 ， 針對菌絲體 中 多糖等物質(zhì) 豐富 的 特點 ，改進 取方法， 獲得 高 質(zhì)量 設(shè)計引物， 優(yōu)化 反應(yīng)體系和擴增條件 ， 進行 傳多樣性分析，形成了適合多種食用菌菌株遺傳鑒別鑒定和遺傳分析的技術(shù)和方法。 研究 表明 ， 我國食用菌栽培菌株遺傳多樣性豐富 ，多數(shù) 種內(nèi) 不同 菌株 之間 遺傳距離在 上 。 21 個 黑木耳 （ A. 菌株 ， 10 個引物擴增出 185 個位點， 多態(tài)性 位點 比例（ P）為 平均每個位點 的觀察等位基因數(shù)（ 平均每個位點的有效等位基因數(shù)（ eiH）平均為 s 信息指數(shù)（ I）為 省際 間 菌株基因流（ 為 20 株 白靈菇 （ P. ， 11 個引物 共 擴增出 70 個位點， P 為 ， H 為 I 為 13 株 灰樹花 （ G. ， 12 個引物 共 擴增出 178 個位點， P 為 ， H 為 I 為 12 個 13 個金針菇 （ F. 株 擴增出 124 個位點， P 為 H 平均為 I 為 16 個引物將 12 株 滑菇 （ P. 擴增 出 146 個 位點 ，P 為 H 為 I 為 13 個引物將 10 株 茶樹菇（ A. 擴增 出 194 個 位點 ， P 為 H 為 為 9 株杏鮑菇 （ P. ， 13 個引物擴增 出 250 個 位點 ， P 為 e 為 H 為 I 為 7 株雞腿菇 （ C. ， 14 個引物擴增 出 141 個 位點 ，P 為 H 為 I 為 基于菌株間 傳距離的 類分析 表明 ，我國栽培食用菌菌株 的分布與 地理 區(qū)域無關(guān) ， 表明 我國食用菌菌株適應(yīng)栽培地域性強，生產(chǎn)菌株在全國 范圍內(nèi)引種頻繁 。 以 白靈菇 和杏鮑菇 為材料，進行 酯酶同工酶分析 ，將 分析 結(jié)果與 析結(jié)果 相比較， 結(jié)果表明兩種方法 對菌株的 分析 結(jié)果 大致相同， 都是鑒別菌株的良好方法，但對遺傳關(guān)系的分析結(jié)果有差異 。 對 不同 白靈菇 菌株 的 增 位點 進行連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測序，獲得了 24 個位點 的序列，對 序列初步分析結(jié)果表明： （ 1） 5錨定引物對擴增的特異性 相對較弱 ， 相似的引物間存在非特異擴增 位點 ； （ 2） 同一個引物對不同菌株的擴增 得到的相同 位點 ，雖然在分子量大小上沒有差異，但位點內(nèi)部 存在著 單個 核苷酸 位點 的 差異 ； （ 3） 增 位點 序列在 對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與已登錄的 功能 基因序列無同源性 ； （ 4） 增位點序列內(nèi) 存在著大量的串聯(lián)重復序列，說明這些 增區(qū)域 正 是微衛(wèi)星的活動頻繁區(qū)域 。 關(guān)鍵詞 ： 大型真菌 ， 簡單重復序列區(qū)間 ， 分子標記 ， 遺傳距離 ， 聚類分析 05 in in NA to 20 We a to D) .4 in 1 . 10 85 of P) of of eis H) s I) 0 . 11 0 P Na Ne H I 3 . 12 78 P Na Ne H I 3 . 12 24 P Na Ne H I 2 P. 16 46 P Na Ne H I 0 . 13 94 P Na Ne H I . 13 50 P Na Ne H I . 14 41 P Na Ne H I eis of of of of ST . . to of 24 . 1) 5 on 2) in in 3) no to in 4) in SR 錄 第一章 引言 . 1 述 . 1 國人民對食用菌的認識和利用 . 1 用菌產(chǎn)業(yè)在農(nóng)村經(jīng)濟中的作用 . 1 國食用菌生產(chǎn)的現(xiàn)狀和特點 . 2 外食用菌生產(chǎn)簡述 . 3 國食用菌菌種現(xiàn)狀 . 3 用菌遺傳多樣性研究進展 . 4 態(tài)學研究 . 4 胞學研究 . 5 白質(zhì)研究 . 6 子生物學研究 . 7 子標記技術(shù)研究進展 . 11 技術(shù)原理 . 12 術(shù)特點和操作 . 12 遺傳育種中的應(yīng)用 . 13 題意義和研究內(nèi)容 . 14 題意義 . 14 究 內(nèi)容 . 15 第二章 基因組 獲得 . 16 驗材料 . 16 要儀器和設(shè)備 . 16 要試劑 . 16 試菌株 . 17 法步驟 . 21 絲培養(yǎng) . 21 絲收集 . 22 菌 取 . 22 質(zhì)菌 取 . 22 脂糖凝膠電泳 . 23 外分光光度計檢測濃度 . 23 果分析 . 24 絲培養(yǎng) . 24 傘菌 取結(jié)果 . 24 質(zhì)菌不同材料 取 比較 . 24 度結(jié)果 . 25 論 . 25 第三章 物初步篩選及 應(yīng)體系確定 . 26 料和方法 . 26 驗儀器和試劑 . 26 料和引物設(shè)計 . 26 應(yīng)體系和參數(shù)確定 . 26 物凝膠和電泳條件 . 27 果分析 . 27 性溫度 . 27 脂糖凝膠濃度和電泳電壓 . 27 論 . 28 第四章 食用菌遺傳多樣性的 析 . 29 料和方法 . 29 驗儀器和試劑 . 29 引物 . 29 增和凝膠電泳 . 29 據(jù)分析 . 29 果與分析 . 30 木耳（ A. . 30 靈菇（ P. . 33 樹花（ G. . 36 針菇（ F. . 38 菇（ P. . 40 樹菇（ A. . 42 鮑菇（ P. . 45 腿菇（ C. . 47 物擴增結(jié)果 . 50 傳多樣性分析 . 51 論 . 51 記方法的可行性 . 51 傳距離與同物異名 . 52 物與微衛(wèi)星 . 52 V 傳多樣性 . 53 第五章 酯酶同工酶分析結(jié)果比較 . 54 料和方法 . 54 驗儀器和試劑 . 54 試材料 . 54 膠制備 . 55 酶液提取 . 55 樣及電泳 . 55 據(jù)觀察與分析 . 55 果與分析 . 55 泳圖譜 . 55 據(jù)處理和聚類分析 . 56 論 . 57 第六章 列特征分析 . 58 料和方法 . 58 驗材料與儀器 . 58 應(yīng)和電泳 . 58 收與純化 . 58 A 克隆和轉(zhuǎn)化 . 58 化子檢測 . 59 列分析 . 59 果和分析 . 59 隆結(jié)果 . 59 列拼接 . 60 物擴增非特異性 . 61 核苷酸多樣性 . 61 列 對 . 62 復序列尋找結(jié)果 . 63 論 . 64 第七章 結(jié)論 . 65 參考文獻 . 66 致 謝 . 75 作者簡歷 . 76 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 增片段長度多態(tài)性 ) 堿基對 六烷基三甲基溴化銨 氧核糖核酸 化乙錠 乙胺四乙酸 單重復序列區(qū)間 密度 丙烯酰胺凝膠電泳 合酶鏈反應(yīng) 乙烯吡咯烷酮 機擴增的多態(tài)性 制性片段長度多態(tài)法 分鐘轉(zhuǎn)數(shù) 二烷基磺酸鈉 單重復序列 羥甲基氨基甲烷 加權(quán)算術(shù)平均對群法 of 個位點的觀察等位基因數(shù) of 個位點的有效等位基因數(shù) H s eis 基因多樣性 D 傳距離 I s s 信息指數(shù) P of 態(tài) 性 位點 比例 準偏差 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 述 估計地球上現(xiàn)有 150 萬種真菌，預計其中 14 萬種是能產(chǎn)生 較大個體 和相應(yīng)結(jié)構(gòu)子實體的大型真菌。 目前我們已知 約 14 000 種，只占預測 大型真菌 種類總量的 10 （ 2002） 。在 14 000 種已知 大型真菌 中，約 5 000 種具有不同程度的可食性，其中 31 個屬的 3 000 多種被當作食用菌 （ 2 000 種具有藥用功效 ） 。 約有 95的食用菌屬于擔子菌門 （ 少數(shù)屬于子囊菌門（ 我國 幅員遼闊， 氣候多樣 ， 地形復雜 ， 孕育了豐富的 大型 食用 真菌資源。估計 我 國目前有 3 800 種 以上 大型 真菌 ，其中 900 多 種 為食用菌 ，栽培生產(chǎn)的 近百種 （卯曉嵐， 2000）。 國 人民對 食用菌 的認識和利用 我國人工栽培食用菌的歷史悠久，是世界人工栽培食用菌最早的國家，為世界人民提供了極為寶貴的技術(shù)經(jīng)驗（楊新美， 1996）。中國人民早在數(shù)千年前就已開始觀察和采食大型 食用 真菌，在歷代農(nóng)業(yè)和文學作品中都有大量記載。 “ 味之美者，越駱之菌 ” ，兩千多年 前的呂氏春秋 就向人們推薦了食用菌。 秦漢以前的哲學家 和 思想家指出： “ 無華而實者名栭芝屬也 ” ；又說： “ 朝菌不知晦朔 ” ， “ 朽壤之上，有菌芝者，生于朝，死于晦 ” ，說明其生長在腐殖質(zhì)土壤上 ，且子實體出現(xiàn)時間短暫。秦漢以后，隨著唐、宋文化的昌盛，我國人民對大型真菌的觀察與認識，也從零星記載，逐步走向深入與系統(tǒng)化，并從生產(chǎn)與生活實踐中積累經(jīng)驗，編輯撰寫為專著或某些農(nóng)學和藥物學著作中的專題。如唐代段成式的酉陽雜俎和韓鄂所著的四時纂要，宋代陳仁玉的菌譜和陳景沂的全芳備祖，元代王楨的農(nóng)書，明代潘之恒的 廣菌譜和李時珍的本草綱目中的菜部第二十八卷，以及清代吳林的吳菌譜等 （ 呂作舟 ， 2006） 。 我國勞動人民 在 長期的生活和生產(chǎn)實踐 中 ，逐步形成的生產(chǎn) 技術(shù) ，至今仍然有很大的實用和參考價值。 唐代韓鄂所著的四時纂要中有關(guān)于 “ 種菌法 ” 的最早記載：