密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 角蛋白降解菌 I 中文摘要 角蛋白（ 一種廣泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于各種動(dòng)物的毛發(fā)、鱗片、羽毛、蹄、角等結(jié)構(gòu)中。 角蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于水，也 不能被一般的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。 從微生物中純化的角蛋白酶活性很強(qiáng)，可以水解多種難降解的纖維蛋白，如角蛋白、彈性蛋白和膠原等，具有廣泛的應(yīng)用前景。 本研究 確定 了角蛋白降解菌 弗氏鏈霉菌 有利于 蛋白酶純化的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件 。 通過(guò)蛋白酶的同工酶電泳，從 角蛋白降解菌 弗氏鏈霉菌 培養(yǎng)液上清中，發(fā)現(xiàn)了六種分泌的蛋白酶， 初步摸清了 弗氏鏈霉菌 分泌蛋白酶酶譜。 純化了弗氏鏈霉菌 產(chǎn)的兩種分泌蛋白酶，并進(jìn)行了部分氨基酸 序列測(cè)定。 構(gòu)建了 弗氏鏈霉菌 用多種基因克隆技術(shù)組合， 克隆得到了 六種蛋白酶基因 中四個(gè)基因 在 冊(cè)，注冊(cè)號(hào)分別為 克隆得到的六種分泌蛋白酶中，有三種 (已報(bào)道的同源性最高的蛋白酶的 源性在 80%以下， 氨基酸同源性在 72%以下，是三種新發(fā)現(xiàn)的蛋白酶基因 。 克隆 的另一蛋白酶基因 成熟蛋白的氨基酸序列與已報(bào)道的 源性高達(dá) 基本上可認(rèn)為是同一蛋白酶，根據(jù)我們及前人的研究結(jié)果，這一蛋白酶具有較高的角蛋白酶活性，是一極具應(yīng)用潛力的蛋白酶， 但前人的 工作只得到了成熟蛋白的部分基因序列（編碼成熟蛋白的 576的 492蛋白酶的 、信號(hào)肽編碼序列及基因側(cè)翼序列均未得到，而且未驗(yàn)證基因功能 , 而蛋白酶的 對(duì)蛋白酶的活性表達(dá)具有重要作用。本研究從蛋白純化出發(fā)，經(jīng)蛋白測(cè)序，進(jìn)而調(diào)出部分基因序列，通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)，首次獲得了包括信號(hào) 肽、 編碼序列在內(nèi)的完整的基因序列。 通過(guò) 步研究了 弗氏鏈霉菌 六種蛋白酶基因在 羽毛培養(yǎng)基和高氏 1 號(hào) 培養(yǎng)基中，不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。 研究結(jié)果表明，所研究的 幾種分泌蛋白酶的表達(dá)均為組成型表達(dá)，與生長(zhǎng)環(huán)境中是否存在角蛋白無(wú)關(guān) 。 構(gòu)建了組成型和蔗糖誘導(dǎo)型分泌表達(dá)的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，為今后開(kāi)發(fā)利用上述基因建立了初步的表達(dá)技術(shù)平臺(tái)。 在大腸桿菌 表達(dá)了 因，驗(yàn)證了基因的功能，證明克隆的 因是蛋白酶基因，為今后對(duì)這些基因的開(kāi)發(fā)利用打下了良好的基 礎(chǔ)。 在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中均表達(dá)了 成熟蛋白基因和蛋白酶原基因，證明蛋白酶的 對(duì)蛋白酶的活性表達(dá)起著重要的作用。 測(cè)定了在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白酶 部分酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn) 一種具有較強(qiáng)角蛋白酶活性的蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，還原劑的存在，能極大地提高其角蛋白酶活性。克隆和表達(dá)的 有較大的應(yīng)用潛力。 關(guān)鍵詞 ： 弗氏鏈霉菌 蛋白酶 角蛋白酶 基因克隆和表達(dá) I is a be in of It is in t be by as as So of of by of in of NA of 0% NA of 2%. So of a so be as 492of 576“of an in In NA NA is of in of in . of . . it in of . on of in 錄 中文摘要 A B S T R A C T 第一章 引言 1 1 研 究 目 的 和 意 義 1 2 國(guó) 內(nèi) 外 研 究 現(xiàn) 狀 1 生角蛋白酶的微生物 2 真菌 2 放線菌 2 細(xì) 菌 2 角蛋白酶的理化性質(zhì) 3 物特異性 3 子量 3 適 3 白酶抑制劑和各種離子的作用 4 它 4 角蛋白的酶解機(jī)理 4 性作用 4 解作用 5 氨基作用 5 角蛋白酶的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 5 蛋白酶表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展 5 蛋白酶基因 6 蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu) 6 蛋白酶的基因工程 6 蛋白酶的應(yīng)用前景 7 料和飼料添加劑 7 藥 7 藥和化妝品 7 蛋白酶與瘋牛病 7 它用途 7 題與展望 8 前存在的問(wèn)題 8 望和對(duì)策 8 V 3 研究?jī)?nèi)容和方法 9 究?jī)?nèi)容及目標(biāo) 9 究方法 9 第二章 蛋白酶 基因的克隆 10 1 材料與方法 10 驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)設(shè)備 10 株與質(zhì)粒 10 物合成 10 劑盒、工具酶和生化試劑 10 液 10 養(yǎng)基 10 驗(yàn)儀器 10 驗(yàn)方法 10 氏鏈霉菌 羽毛和頭發(fā)的降解 10 氏鏈霉菌 誘導(dǎo)產(chǎn)酶 11 白酶的純化 11 白酶的氨基酸序列測(cè)定 12 氏鏈霉菌 提取 12 白酶基因部分序列的克隆 12 向 15 因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 15 2 結(jié)果 18 弗氏鏈霉菌 降解羽毛和頭發(fā) 18 白酶的純化 18 白酶 的氨基酸序列測(cè)定 結(jié)果 20 白酶部分編碼基因序列的克隆 20 20 肽 酶 分編碼基因序列的克隆 20 分編碼基因序列的克隆 21 分編碼基因序列的克隆 21 分編碼基因序列的克隆 21 分編碼基因序列的克隆 21 反向 果 21 基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選 21 種蛋白酶基因的 列 23 23 25 26 27 30 31 3 討論 32 本章小結(jié) 第三章 弗氏鏈霉菌 白酶基因的表達(dá)研究 47 1. 材料與方法 47 株 47 物合成 47 劑盒、工具酶和生化試劑 47 養(yǎng)基 47 驗(yàn)儀器 47 驗(yàn)方法 47 樣 47 胞總 提取 47 醛變性電泳 48 48 一輪 增 49 二輪 49 2. 結(jié)果 50 一輪 應(yīng)結(jié)果 50 二輪 應(yīng) （ 果 51 3. 討論 52 本章小結(jié) 第四章 蛋白酶基因的異源表達(dá) 54 1. 材料與方法 54 實(shí)驗(yàn)材料 54 株與質(zhì)粒 54 物合成 54 試劑盒、工具酶 和生化試劑 54 養(yǎng)基 54 驗(yàn)方法 54 草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建 54 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和電擊轉(zhuǎn)化 58 草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和電擊轉(zhuǎn)化 59 59 60 肽酶 表達(dá)及檢測(cè) 61 2. 結(jié)果 61 草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建 61 61 62 絲氨酸蛋白酶 表達(dá)及檢測(cè) 63 大腸桿菌中 的表達(dá) 63 枯草芽孢桿菌中的表達(dá) 66 70 70 誘導(dǎo)表達(dá) 70 肽酶 表達(dá)及檢測(cè) 71 組表達(dá)載體 構(gòu)建 71 誘導(dǎo)表達(dá) 72 3. 討論 73 本章小結(jié) 第五章 蛋白酶 酶學(xué)性質(zhì) 79 1. 材料與方法 79 驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)設(shè)備 79 株 79 、底物和生化試劑 79 養(yǎng)基 79 驗(yàn)儀器 79 實(shí)驗(yàn)方法 79 表達(dá)和初步純化 79 白酶活性測(cè)定方法 79 酪蛋白為底物測(cè)定 部分酶學(xué)性質(zhì) 80 天青角蛋白為底物測(cè)定 部分酶學(xué)性質(zhì) 81 . 結(jié)果 82 酪蛋白為底物測(cè)定 部分酶學(xué)性質(zhì) 82 最適 82 最適反應(yīng)溫度 82 天青角蛋白為底物測(cè)定 部分酶學(xué)性質(zhì) 83 適 和 定性的測(cè)定 83 適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定 83 制劑對(duì) 性的影響 84 胰蛋白酶、蛋白酶 K 比較 85 3 討論 86 本章小結(jié) 第六章 結(jié)論 87 參考文獻(xiàn) 89 致謝 97 作者簡(jiǎn)歷 98 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 1 研究目的和意義 蛋白酶是一種應(yīng)用范圍廣、使用量大，有巨大市場(chǎng)潛力的酶制劑，蛋白酶酶制劑的生產(chǎn)可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和良好的社會(huì)效益。我國(guó)工業(yè)酶制劑 2000 年產(chǎn)量為 噸，其中蛋白酶在10 萬(wàn)噸左右，年增長(zhǎng)率在 20%以上，角蛋白酶由于具有比普通蛋白酶更為優(yōu)良的性質(zhì)，作為蛋白酶的一個(gè)新品種，可望占據(jù)較大的市場(chǎng)份額。 本研究的目的就是從 一株能迅速 降解羽毛和頭發(fā)等多種角蛋白的 菌株出發(fā)， 利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，研究該菌株的蛋白酶表達(dá)規(guī)律，克隆出該 角蛋白降解菌中與角蛋白降解相關(guān)的蛋白酶基因，并使用適宜的表達(dá)系統(tǒng)，重組出基因工程菌株，為進(jìn)一步構(gòu)建高效生產(chǎn)菌株 , 開(kāi)發(fā)新型的蛋白酶品種打下基礎(chǔ)。 2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 角蛋白（ 一種廣泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于各種動(dòng)物的毛發(fā)、鱗片、羽毛、蹄、角等結(jié)構(gòu)中。角蛋白可分為 角蛋白和角蛋白兩大類(lèi)。含 螺旋的角蛋白稱(chēng)為角蛋白，又分為 軟 角蛋白和 硬 角蛋白兩種。 軟 角蛋白主要見(jiàn)于皮膚組織，而 硬 角蛋白是皮膚附屬物如毛發(fā)、指甲等的主要成分。角蛋白含折疊重復(fù)結(jié)構(gòu)，是羽毛的主要成分 （譚盈盈等 ， 2001） 。 角蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于水，也不能被一般的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解 (， 1986)。角蛋白不溶于水和抗蛋白酶分解的性質(zhì)主要決定于如下幾個(gè)方面：胱氨酸殘基所提供的分子間二硫鍵的高度交叉連接；氫鍵的作用；分子間的相互疏水作用等 (1973； ， 1998)。二硫鍵可因可逆的氧化和還原作用而發(fā)生斷裂和重建。角蛋白不易降解，然而，在自然界并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)角蛋白廢棄物的大量積聚，這應(yīng)歸功于角蛋白降解菌的作用。 早在 1899 年， 報(bào) 道了真菌馬爪甲團(tuán)囊菌（ 分解角蛋白。此后，在真菌、放線菌和細(xì)菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多具 有分解角蛋白能力的微生物，如 馬發(fā)癬菌（ ， 弗氏鏈霉菌（ 地衣芽孢桿菌 。生物作用需要酶的參與， 1963 年， 將具有分解角蛋白活性的酶稱(chēng)為角蛋白酶（ ， 1963）。 上述 微生物能夠分泌角蛋白酶， 降解 毛發(fā)、羽毛、蹄、角等 角蛋白。 從微生物中純化的角蛋白酶活性很強(qiáng)，可以水解多種難降解的纖維蛋白，如角蛋白、彈性蛋白和膠原等，具有廣泛的應(yīng)用前景。 目前，人們對(duì)角蛋白酶的認(rèn)識(shí)還很膚淺，已發(fā)表的工作主要涉及菌種篩選、酶的提取和活力測(cè)定等基礎(chǔ)工作，對(duì)角蛋白酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的研究較少，分子生物學(xué)方面的研究尚處于起步階段 (2002， 2004； 1968； 2000； 1998； 003； 2003； 2005； 2004； 2004)。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 2 生 角蛋白酶的微生物 目前，已在真菌、放線菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了許多具 有分解角蛋白能力的微生物，這些微生物能夠分泌角蛋白酶， 降解 毛發(fā)、羽毛、蹄、角等角蛋白。 菌 1899 年， 道了真菌馬爪甲團(tuán)囊菌（ 分解角蛋白，此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多真菌 能夠分泌角蛋白酶， 降解 毛發(fā)、羽毛、蹄、角等角蛋白。 現(xiàn)輪枝孢菌（ 和馬發(fā)癬菌（ 有 較高的羽毛降解能力 (1980)。 研究了 21 種真菌，發(fā)現(xiàn)其中猴發(fā)癬菌（ 降解羽毛能力最強(qiáng)。 離到降解羽毛的煙曲霉（ (1996)。 從污泥中 分離到能降解雞毛、人發(fā)和羊毛的四種真菌，包括二種皮膚真菌和二種腐生真菌 （ 2002） 。 目前，從 ， 1989； ， 1985； ，1996； ， 1979)， ， 1989； ， 1968， 1971)和 M. ， 2001； ， 1987； ， 1998； ， 1982； ，1984)等真菌中已分離得到多種角蛋白酶。 線菌 1959），他們以羊毛為基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)該放線菌，并初步探討了角蛋白的降解機(jī)理。 將從土壤中分離得到的純白高溫放線菌（ 于羊毛分解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以羊毛作為唯一的碳源和氮源時(shí)能誘導(dǎo)角蛋白酶的合成。 盡管純白高溫放線菌所產(chǎn)的嗜熱角蛋白酶與彈性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶 但具有更高的水解 和角蛋白的活性。其活性是蛋白酶 倍，是枯草桿菌蛋白酶 5倍（ ， 1999）。丁正民等從雞毛堆肥中分離到一株放線菌菌株 該菌具有很強(qiáng)的降解雞毛的能力（丁正民等， 1993）。 可降解羽毛角蛋白（ 1999）。涂國(guó)全等分離到一株具有很強(qiáng)的角蛋白分解能力的菌株 弗氏鏈霉菌 該菌能迅速分解羽毛、人發(fā)等多種角蛋白，具有很好的應(yīng)用前景（涂國(guó)全等， 1994）。 細(xì)菌 目前已經(jīng)篩選和分離到很多能降解角蛋白的細(xì)菌，如： 1， 21，23， 2000； 2002， 2003， 2004； 1999； , 2005） 。其中研究最系統(tǒng)、最深入的當(dāng)屬地衣芽孢桿菌 的羽毛發(fā)酵池中分離得到的， 能在以羽毛為唯一的有機(jī)底物的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，以羽毛作為碳源、硫源和能量的來(lái)源。 以羽毛粉末為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)，這種細(xì)菌的最適生長(zhǎng)溫度為近 50 。雖然地衣芽孢桿菌 它的好氧生長(zhǎng)速度明顯高于厭氧生長(zhǎng)速度。然而，它厭氧生長(zhǎng)時(shí)降解角蛋白所產(chǎn)的游離氨基酸的量要高于好氧生長(zhǎng)時(shí)，可能是因?yàn)樵诤醚鯒l件下氨基酸很快被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。地衣芽孢桿菌 能降解未用高溫蒸煮的羽毛。要使羽毛降解，必須使羽毛高溫蒸煮至少 2分鐘以上 (990)。該菌的角蛋白 酶已被純化，其角蛋白酶基因 第一章 引言 3 （ 1997； 1999， 2003， 2004； 2002）。 從中純化到一種膜結(jié)合角蛋白酶，該酶最適溫度高達(dá) 100（ 2002）。 菌科， ， 與芽孢桿菌不同，這種羽毛降解菌是中溫性細(xì)菌，在 25 30 下生長(zhǎng)良好，在 2天內(nèi)可使羽毛幾乎完全降解，包括羽小支和羽軸。更重要的是，這種細(xì)菌能夠降解未經(jīng)蒸煮的羽毛（ 2000），因而不僅具有更大的商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值，而且為研究角蛋白降解菌降解角蛋白的作用機(jī)理提供了很好的材料。 蛋白酶的理化性質(zhì) 各種微生物所產(chǎn)的角蛋白酶有著各自不同的起源，因此它們的理化性質(zhì)既有共性又各有不同。 物特異性 目前發(fā)現(xiàn)的多數(shù)角蛋白酶的底物范圍相當(dāng)廣泛，如 地衣芽孢桿菌 能降解角蛋白外，還可分解多種多肽和其他蛋白質(zhì)，如膠原蛋 白、彈性蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白等（ 1992）。但也有一些角蛋白酶的底物范圍很窄，如雞毛癬菌角蛋白酶只能利用鳥(niǎo)類(lèi)羽毛，因此它只感染鳥(niǎo)類(lèi)。再如密旋鏈霉菌，在 位點(diǎn)對(duì)苯丙氨酸和精氨酸有專(zhuān)一性。該酶對(duì)底物表現(xiàn)出高度的立體選擇性和二級(jí)結(jié)構(gòu)專(zhuān)一性，它能快速分解鳥(niǎo)類(lèi)羽毛，但較難利用其他天然角蛋白（ 1995）。 子量 許多微生物產(chǎn)生的 角蛋白酶已被分離純化并研究了它們的性質(zhì)，各種不同的菌產(chǎn)生的角蛋白酶分子量差異很大。單體的角蛋白酶分子量 一般為幾十 地衣芽孢桿菌 單體酶，其分子量分別為 3340 0 1992； 999； 2000)， 但也有大于 100 的角蛋白酶分子量為 134 002） ，有的菌所產(chǎn)的角蛋白酶為酶復(fù)合物，其分子量更大，如 嗜熱厭氧菌 所產(chǎn)的膜結(jié)合角蛋白酶 分子量在 2002002） 。 適 目前已經(jīng)純化得到的 角蛋白酶以中性和堿性蛋白酶居多，其 最適 地衣芽孢桿菌（ 熱厭氧菌 最適 別為 8， 8 9和 9（ 1992； 1999； 2000； 2002） 。但也有少數(shù)角蛋白酶是酸性蛋白酶，如白色假絲酵母 （ 所產(chǎn)的角蛋白酶，其 最適 1983， 1984）。 多數(shù) 角蛋白酶的 最適反應(yīng)溫度在 40 55之間，如 地衣芽孢桿菌（ 1992； 1999； 2000； 2002）。但也有低于 40或高于55的（ ， 1985； 1984； 1979），更為極端的是 嗜熱厭中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 4 氧菌 ，該酶的最適溫度高達(dá) 100 （ 002）。 白酶抑制劑和各種離子的作用 不同來(lái)源的角蛋白酶有不同的專(zhuān)一性抑制劑，暗示角蛋白酶可能沒(méi)有共同的起源。目前已發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶以絲氨酸蛋白酶居多，其酶活可被絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟等所抑制（ 1995）。其次是金屬蛋白酶，其酶活可被 2002； 2004） 。 不同來(lái)源的角蛋白酶對(duì)各種離子的反應(yīng)是不同的，如 增強(qiáng)一些角蛋白酶的活性，而 抑制酶活（ , 2002）。但也有一些角蛋白酶的酶活為 抑制（ 1975）。對(duì)多數(shù)角蛋白酶而言， 增強(qiáng)其穩(wěn)定性。 它 目前已發(fā)現(xiàn)的角蛋白酶中，多數(shù)屬于胞外蛋白酶，也有少數(shù)是胞內(nèi)蛋白酶 (987)或膜結(jié)合蛋白酶（ 2002）。 蛋白的酶解機(jī)理 目前普遍認(rèn)為，微生物降解、利用角蛋白的過(guò)程可分為：變性作用、水解作用和轉(zhuǎn)氨基作用等三個(gè)步驟。 性作用 二硫鍵對(duì)于角蛋白的不溶性和高穩(wěn) 定性起著很重要的作用，因?yàn)槎蜴I可穩(wěn)固角蛋白的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其抗化學(xué)試劑和水解酶的攻擊。二硫鍵可因氧化和還原作用而發(fā)生斷裂和重建，一旦二硫鍵遭到破壞，角蛋白就很容易變性，從而喪失它不溶于水和抗蛋白酶作用的能力 （ 1934； 1995） 。例如，用還原劑巰基乙酸鹽處理角蛋白，可打開(kāi)二硫鍵，從而增加胰蛋白酶和芽孢桿菌堿性蛋白酶水解角蛋白的能力（ 934） 。再如，在 0530 的培養(yǎng)基中加入 還原劑 二硫蘇糖醇 ， 角蛋白降解率 可從 10%提高到 70%。 將角蛋白高溫蒸煮或?qū)⑵淠肽コ煞勰芙档徒堑鞍字须装彼岬暮?（ 1949），從而有利于角蛋白的降解。葉亞建認(rèn)為，在角蛋白酶降解角蛋白的過(guò)程中，不需要還原劑或輔酶的參與，角蛋白酶中的二硫鍵還原酶是角蛋白降解的關(guān)鍵，它作用于二硫鍵，將胱氨酸（ 原為半胱氨酸（ 使角蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)解體而形成變性角蛋白（葉亞建， 1989）。 不同的 微生物降解角蛋白的機(jī)理各不相同，降解過(guò)程中的產(chǎn)物也不相同 （ 1997； 1986， 1988；葉亞建等， 1989， 1998） 。目前，對(duì)多數(shù)角蛋白降解菌如何還原破壞胱氨酸二硫鍵，角蛋白酶是否具有二硫鍵還原酶活性還不清楚。由于不同的降解菌其角蛋白酶起源不同，故其作用機(jī)理可能不盡相同。某些真菌還原二硫鍵是通過(guò)菌絲體表面所分泌的亞硫酸鹽及其產(chǎn)生的酸性環(huán)境；鏈霉菌則是通過(guò)產(chǎn)生還原酶來(lái)還原二硫鍵（ 2000）。角蛋白不溶于水，它只能以顆粒的形式存在于胞外，因此，二硫鍵的還原只能發(fā)生在代謝能力強(qiáng)的整體細(xì)胞表面，最有可能發(fā)生在細(xì)胞表面的胞聯(lián)氧化還原系統(tǒng) （ 中，它需要 不溶性的角蛋白與細(xì)胞緊密接觸（ 1997） 。 對(duì)純白高溫放線菌 (研究發(fā)現(xiàn)，二硫鍵的還原是通過(guò)胞聯(lián)氧化還原系統(tǒng)進(jìn)行的 （ 1999） 。在鏈霉菌 角蛋白時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到釋放的巰基中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 5 (1997； 1992)，這可能是由于胱氨酸二硫鍵還原產(chǎn)生的半胱氨酸很快被轉(zhuǎn)化成了其它產(chǎn)物所致。 也有人認(rèn)為 , 角蛋白酶本身具有一定的二硫鍵還原酶活性 , 但這還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)證實(shí)。 解作用 角蛋白只有在變性后，才能被角蛋白酶水解（ 1988）。變性的角蛋白失去了其固有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，變得容易接近，在角蛋白酶及其它蛋白酶的作用下，變性角蛋白逐漸水解成多肽、寡肽和游離氨基酸（葉亞建， 1989）。 氨基作用 在添加羊毛的培養(yǎng)液中，隨著純白高溫放線菌的生長(zhǎng)，羊毛被降解成可溶性多肽和氨基酸，經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)液的 漸升高。這是微生物在以蛋白質(zhì)為基質(zhì)