密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 防治 黃瓜枯萎、青椒疫病木霉菌的 研究 o.: he he 要 黃瓜枯萎病和青椒疫病是設(shè)施蔬菜最為常見且危害嚴(yán)重的兩類土傳真菌病害 ， 它們的有效防治 已成為蔬菜 生產(chǎn)中急待解決的難題。 本研究在分離、篩選對(duì)黃瓜枯萎和青椒疫病兩類蔬菜 真菌病害拮抗菌的基礎(chǔ)上，對(duì)防 治 效果較好的兩株木霉菌進(jìn)行鑒定，并對(duì) 其 拮抗機(jī)制進(jìn)行初步探討， 測定了其 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性 。 同時(shí)，通過 溫室盆栽試驗(yàn)和田間 小區(qū) 試驗(yàn)進(jìn)行防治效果研究 和 田間 應(yīng)用效果評(píng)價(jià) 。旨在為高效生防木霉菌制劑的研制及設(shè)施蔬菜真菌病害的生物防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 主要研究內(nèi)容有以下幾個(gè)方面： 1、從山東壽光、蒼山兩地采集的土樣中分離、純化得到拮抗菌共 59 株。其中拮抗疫病病菌的菌株 46株；拮抗枯萎病菌的菌株 13 株。 2、將從土樣中分離得到的拮抗菌 59 株與 供的 25 株菌種，共計(jì) 84 株菌。分別針對(duì)黃瓜 枯萎病菌和青椒疫病病菌進(jìn)行拮抗菌的篩選。通過室內(nèi) 拮抗試驗(yàn) 和溫室盆栽試驗(yàn)， 篩選到 真菌 2 號(hào)菌 株 對(duì)防治黃瓜枯萎病的效果最好 ， 防治效果為 達(dá)到差異顯著 的效果 。真菌 4 號(hào)菌 株 對(duì)防治青椒疫病的效果最好， 防治效果為 達(dá)到差異顯著 的效果 。真菌 2 號(hào)菌和真菌4 號(hào)菌均為 3、 對(duì)兩株生防木霉菌的拮抗機(jī)制進(jìn)行初步探討。研究表明，在 木霉菌對(duì)病原真菌的拮抗過程中競爭、重寄生作用是重要的作用機(jī)制 。 4、采取還原糖法這一更為直觀、準(zhǔn)確的方法來 對(duì)生防木霉菌不同發(fā)酵時(shí)間幾丁質(zhì)酶活性進(jìn)行測定，得出同一菌株在 不同發(fā)酵時(shí)間幾丁質(zhì)酶活性大小變化的趨勢大致相同。 真菌 4號(hào)菌株在培養(yǎng) 145小時(shí)幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到最大；真菌 2號(hào)菌株在培養(yǎng) 170小時(shí)幾丁質(zhì)酶活性達(dá)到最大。在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，真菌 4號(hào)菌株的幾丁質(zhì)酶活性大于真菌 2號(hào)菌株的幾丁質(zhì)酶活性。 、在菌落形態(tài)觀察和顯微形態(tài)觀察的基礎(chǔ)上， 綜合 理生化檢測以及真菌 列分析等方法， 對(duì)生防效果較好的真菌 2 號(hào)和真菌 4 號(hào)菌株進(jìn)行鑒定 。 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果 將真菌 2 號(hào)和真菌 4 號(hào)菌株分別鑒定為 柄木霉）與 檸檬綠木霉）。 為黃瓜枯萎病、青椒疫病的生物防治提供了新的 有 效拮抗菌 株 。 6、針對(duì) 黃瓜 枯萎病和青椒疫病制備生防木霉菌固體制劑，在山東萊陽和泰安進(jìn)行了田間小區(qū)試驗(yàn) ， 對(duì) 田間 應(yīng)用效果進(jìn)行評(píng)價(jià) 。固體菌劑對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果為 達(dá)到差異顯著的效果 ， 并且增產(chǎn) 其 防病與增產(chǎn) 效果顯著。固體菌劑對(duì)青椒疫病防治效果 達(dá) 達(dá)到差異顯著的效果，并且 平均株高比對(duì)照增加 達(dá) 增產(chǎn) 達(dá) 其 防病與促生、增產(chǎn)效果顯著。 關(guān)鍵詞： 木霉菌，黃瓜枯萎病 ，青椒疫病，生物防治 he of in in on of on to is of on of we on of by of 159 by 6 3 29 5 in of O.2 is of O.4 is 3of 4by of we on of at of of at of O.4 45 of O.2 70 of O.4 of O.2 at 5th,on of as TS of so on,we of O.2 O.4 to 6we on of of ， of on of i 目 錄 摘 要 . I . 言 . 1 一、設(shè)施蔬菜病害及其防治現(xiàn)狀 . 1 1、黃瓜枯萎病和青椒疫病病害概述 . 1 2、生物防治在設(shè)施蔬菜病害防治中的應(yīng)用 . 2 二、木霉屬分類研究進(jìn)展 . 2 1、木霉屬分類研究概況 . 3 2、 測技術(shù)在木霉分類研究中的應(yīng)用 . 4 3、 列分析技術(shù)在木霉分類研究中的應(yīng)用 . 4 4、木霉屬分類研究展望 . 5 三、木霉菌在植物病原真菌生物防治中的應(yīng)用 . 6 1、木霉對(duì)植物病原真菌的拮抗機(jī)制 . 6 2、木霉幾丁質(zhì)酶研究概況 . 8 3、木霉菌的當(dāng)前應(yīng)用狀況 . 10 4、 存在問題、研究熱點(diǎn)及前景展望 . 11 四、本研究的目的和意義 . 12 第一章 防治 黃瓜枯萎、青椒疫病木霉菌的篩選 . 13 一、材料 與方法 . 13 1、材料 . 13 2、方法 . 15 二、結(jié)果與分析 . 19 1、拮抗菌的分離、純化 . 19 2、拮抗菌的篩選 . 19 3、溫室盆栽試驗(yàn) . 21 4、生防真菌拮抗機(jī)制的初步探討 . 23 5、 生防真菌 幾丁質(zhì)酶活性的測定 . 23 三、討論 . 26 四、本章小結(jié) . 27 第二章 生防木霉菌的鑒定 . 29 一、材料與方法 . 29 1、材料 . 29 2、方法 . 30 二、結(jié)果 . 33 1、形態(tài)觀察 . 33 2、 定 . 33 3、 真菌 列分析 . 34 三、討論 . 37 、本章小結(jié) . 37 第三章 生防木霉菌制劑的田間應(yīng)用 效果 評(píng)價(jià) . 38 一、材料與方法 . 38 1、材料 . 38 2、方法 . 38 二、結(jié)果 . 39 1、固體菌劑防治黃瓜枯萎病田間小區(qū)試驗(yàn) . 39 2、固體菌劑防治青椒疫病田間小區(qū)試驗(yàn) . 41 三、討論 . 43 四、本章小結(jié) . 43 結(jié) 論 . 44 參考文獻(xiàn) . 45 附圖 . 50 附錄 . 57 附錄 1 . 57 1、病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) . 57 2、病情指數(shù)計(jì)算方法 . 57 3、防病效果計(jì)算方法 . 57 附錄 2 96孔 5 種碳源名稱 . 58 致 謝 . 59 作者簡歷 . 60 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 1 引 言 一、 設(shè)施 蔬菜病害 及 其 防治 現(xiàn)狀 20世紀(jì) 80年代以 來，我國的蔬菜種植業(yè)發(fā)展迅速， 已 成為僅次于糧食作物的第二大農(nóng)作物。其中 設(shè)施 蔬菜面積 達(dá) 到 530萬公頃，占蔬菜 栽培 面積的 40%，年產(chǎn)值為 1500億 元 。 設(shè)施 蔬菜的發(fā)展，為解決城鄉(xiāng)蔬菜供應(yīng)和增加菜農(nóng)收入起到重要作用。 由于 設(shè)施 蔬菜栽培的特殊環(huán)境，給蔬菜病害的發(fā)生發(fā)展提供了適 宜 的條件 ,致使蔬菜病害發(fā)生種類、數(shù)量及危害程度都呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，給菜農(nóng)在經(jīng)濟(jì)上造成很大損失，已經(jīng)成為限制我國蔬菜種植業(yè)發(fā)展和增強(qiáng)國際市場競爭力的“瓶頸”。 研究 蔬菜病害 的防治 ，已是蔬菜生產(chǎn) 可持續(xù) 發(fā)展 的必需 ,也是菜農(nóng)的 迫切要求。 設(shè)施 蔬菜多是連年重茬種植，某些病 原 菌大量積累， 致使 一些土傳病害日趨嚴(yán)重。如黃瓜枯萎病、茄子黃萎病，多種蔬菜的根結(jié)線蟲病，青椒疫病等發(fā)生危害逐年加重，這些都與 設(shè)施 蔬菜不易輪作，連年重茬有關(guān)。此外， 由于 處于封閉狀態(tài)，大量追施化肥、化肥施用不平衡等，致使設(shè)施 蔬菜生理障礙嚴(yán)重，影響蔬菜正常生長。加之，目前，廣大菜農(nóng)普遍缺乏科學(xué)的病害防治技術(shù)，由于病蟲種類和農(nóng)藥品種繁多，一般對(duì)病害的識(shí)別、農(nóng)藥的選擇以及某些藥劑的使用知識(shí)缺乏。因此，存在著重治輕防，重藥輕養(yǎng)，不重不治，重了亂治的現(xiàn)象。甚至認(rèn)為所謂防治就是多打藥，以化學(xué)農(nóng)藥為主，多藥混用，隨意加大藥量，造成藥害。也有的使用生長激素過量或亂用除草劑，造成激素中毒或藥害，使植株或果實(shí)畸形，影響生長發(fā)育，甚至絕產(chǎn)，并使某些病害產(chǎn)生了抗藥性，防治次數(shù)越來越多，用藥量越來越大，病害越來越嚴(yán)重。 1、黃瓜枯萎病和青椒疫病病害概述 黃瓜枯萎病和青椒疫病是 設(shè)施 蔬菜最為常見且危害嚴(yán)重的兩類土傳真菌病害，主要癥狀表現(xiàn)為植物凋萎和萎蔫 ,根和莖維管束阻塞、變褐等（魏林等， 2002）。 瓜 枯萎 病 病原菌系半知菌亞門鐮刀菌屬 (菌。主要引起瓜類枯萎病。病菌主要 以菌絲體和厚垣孢子隨病殘?bào)w在土壤中越冬，也能在土壤中進(jìn)行較長時(shí)間的腐生生活，一般從根部傷口或根冠細(xì)胞間隙侵入。典型癥狀：病菌從根部進(jìn)入維管束導(dǎo)管，并在其內(nèi)繁殖生長，阻塞導(dǎo)管，使根和莖基變褐，嚴(yán)重時(shí)呈水浸狀腐爛，地上部莖葉迅速凋萎。 近年來，由尖鐮孢菌 (所致的枯萎病已上升為蔬菜的主要病害之一，蔬菜中以黃瓜受害最為嚴(yán)重 ,發(fā)病率一般為 20%30%,受害重的地區(qū)發(fā)病率高達(dá) 80%90%以上，甚至絕產(chǎn) (劉郵洲等， 2004)。 椒 疫病 病原菌系藻菌綱疫霉屬 (菌。主要引起青 (甜 )椒疫病，疫病病菌 (要以卵孢子、厚垣孢子在種子或隨病殘?bào)w在土壤中越冬，典型癥狀：青 (甜 )椒 :苗期中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 2 染病莖基腐爛猝倒 (呈暗綠色 )；定植后葉片染病產(chǎn)生暗綠色病斑，致葉片軟腐，易脫落；果實(shí)染病也產(chǎn)生暗綠色水漬狀斑，迅速變褐軟腐；莖、枝染病，病斑可繞表皮擴(kuò)展成褐色條斑，病部以上枝葉凋萎，濕度大時(shí)病斑表面長白色霉層。 青 椒疫病，是由 青 椒疫霉 (起的一種土傳病害 ，是青椒的毀滅性病害。整個(gè)生育期均可發(fā)病， 大水漫 灌和高溫高濕條件下容易大面積流行，常造成 青 椒減產(chǎn)，甚至絕收，已成為世界范圍內(nèi) 青 椒的毀滅性病害（朱宗源和吳玲忠， 1998）。 黃瓜 枯萎病 和 青椒疫病 的有效防治成為 生產(chǎn)中急待解決的難題 。 2、 生物防治 在 設(shè)施 蔬菜病害防治中的應(yīng)用 長期以來，在設(shè)施蔬菜病害防治方面，農(nóng)藥特別是化學(xué)農(nóng)藥的使用發(fā)揮了巨大的作用。由于采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病害防治 具有 見效快，殺菌譜廣，使用簡便等 特 點(diǎn)， 使 其在農(nóng)業(yè)防治中迅速發(fā)展，成為防病豐產(chǎn)的有效手段之一。但是長期、反復(fù)和大量使用化學(xué)農(nóng)藥存在著潛在的危害 導(dǎo)致有益微生物同時(shí)被殺死或抑制 ,破壞了生物 群落結(jié)構(gòu) ,造成了 環(huán)境污染、 蔬菜 中有害物質(zhì) 大量殘留、病原菌產(chǎn)生耐藥性或抗藥性 ,也導(dǎo)致了化學(xué)農(nóng)藥用量的增加 ,帶來更加嚴(yán)重的問題。 當(dāng)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，要求生產(chǎn)者在利用資源、提高產(chǎn)量的同時(shí)，注意保護(hù)和改善人們賴以生存的環(huán)境，這就對(duì)蔬菜病害防治中的傳統(tǒng)觀念和不良做法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。鑒于長期使用化學(xué)藥劑防治各種蔬菜病害所導(dǎo)致的對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞和病蟲害抗藥性增強(qiáng)等方面的副作用，迫使人們急切地 尋求新的安全有效的蔬菜病害防治途徑。 生物防治的特點(diǎn)正好彌補(bǔ)了化學(xué)防治的不足，因而成為普受重視的研究方向。 利用 生物防治 來 防 治蔬菜 病害不僅避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來了一系列問題，而且安全、有效和持久， 且 具有不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，對(duì)人畜安全無毒，不污染環(huán)境，無殘留，能保持生態(tài)平衡，生產(chǎn)工藝較簡單 的 特點(diǎn) 。 由于 生物防治 兼具了保護(hù)生態(tài)和抗病的雙重功效， 使 其 在 蔬菜 病害防治中發(fā)揮著巨大的作用 ，因而 得到世界各國研究者的 關(guān)注，己經(jīng)發(fā)展成為 蔬菜病害 防治中十分重要且日益得到重視的有效措施。 但是， 目前生 防 制劑 的 品種較少， 效果不如化學(xué)農(nóng)藥快，效果不穩(wěn)定，受氣候條件的影響較大等， 這些都是生產(chǎn)和應(yīng)用中突出的問題（李增智 ,1999）。 近年來，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，為 蔬菜病害的生物防治提供了一種新的途徑，已成為農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)領(lǐng)域重要的發(fā)展前沿之一（黃大昉， 1999）?？梢灶A(yù)計(jì)，隨著抗病基因資源的不斷挖掘利用和蔬菜與病害相互作用分子機(jī)理研究的不斷深入，蔬菜抗病基因工程的研究將會(huì)取得突破性進(jìn)展并走向應(yīng)用，同時(shí)生防微生物的遺傳改良將更有成效，遺傳工程生防制劑將成為蔬菜病害生物防治的重要手段?？傊碌纳锛夹g(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)方法的結(jié)合將推動(dòng)農(nóng)業(yè)微生物防治蔬菜病害進(jìn)入一個(gè)新的發(fā)展階段。 二、木霉屬分類研究進(jìn)展 木霉是一類普遍存在的真菌，常見于土壤中，是土壤微生物的重要群落，從植物根圍 、葉圍、種子及球莖表面，植物殘?bào)w及腐朽木材上都可以分離到（楊依軍等， 2000）。木霉菌 ( 屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目 ,粘孢菌類。在木霉菌的種群中有一大類被稱為拮抗木中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 3 霉 ,它們對(duì)許多植物病原菌具有寄生或拮抗作用 ,如長 柄 木霉 (、哈茨木霉(綠色木霉 (鉤狀木霉 (康氏木霉 (（ 1998）。另外某些木霉還具有活性很強(qiáng)的纖維素酶 等水解酶類，可用于生產(chǎn)纖維素酶和微生物源的糖蛋白（楊合同等， 2002）。鑒于木霉在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力，有關(guān)木霉的研究和應(yīng)用一直引起人們的廣泛關(guān)注（楊合同等， 2004）。盡管對(duì)木霉的研究和應(yīng)用很活躍，但是，木霉的分類仍存在很大的分歧。 1、木霉屬分類研究概況 木霉的研究最早可追溯到 200 多年前 ， 1794 年建立了木霉屬 (。 時(shí)并沒有認(rèn)識(shí)到木霉的有性型 。 到半個(gè)多世紀(jì)以 后 ,其有性型 860)闡明 ， 到了 1902年 ， 木霉與其有性型的關(guān)系才被完全接受 。 1871年 ， 強(qiáng)調(diào)微觀特征 ， 特別是瓶梗 (木霉屬定界上的重要性 。 1902年 ， 1939 年 ， 認(rèn)為這些形態(tài)變異的木霉菌株都可描述為一個(gè)種 ， 即 此以前，木霉的分類鑒定，沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 在 20 世紀(jì) 60 年代 ， 1966； 1969） 開始了木霉菌的分類研 究 ， 發(fā)表了一系列的研究論文 ， 并集其大成于 “A of ， 提出了第一個(gè)木霉屬的分類系統(tǒng) 。 木霉屬分為 9 個(gè)集合種 ( 集合種概念的提出受到了許多研究者的歡迎， 使人們第一次可以比較準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)木霉 “ 種 ” 。其中 許多研究者感興趣的并不是分類本身 ， 也不是纖維素的降解 ， 而是有些木霉種 ， 多數(shù)是 抗植物病原真菌生長的本領(lǐng) 。 除了 外 ， 1957)通過子囊孢子培養(yǎng)的方法研究了木霉及其有性型的聯(lián)系 。 而在這個(gè)方面 ,以日本學(xué)者 1967； 1979） 的研究最具特色 ， 他研究了木霉及其有性型 ， 發(fā)表了一系列的研究論文 （ 1994） 進(jìn)一步研究了有性型的分類 。 80 年代中后期到90 年代初 1984； 1991； 1992） 提出了一個(gè)新的分類系統(tǒng) ， 在其分類系統(tǒng)中引進(jìn)了組的概念 ,他將木霉屬分成了 5 個(gè)組 ,組下設(shè)若干個(gè)種 。 1969） 的集合種基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 ， 也是以分生孢子梗分枝方式及結(jié)構(gòu)為主要特 征建立的 ， 這個(gè)系統(tǒng)還將 從而使木霉屬分生孢子梗分枝結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜多變 。 而形態(tài)性狀易受環(huán)境影響而產(chǎn)生 可 塑性進(jìn)而導(dǎo)致趨同進(jìn)化 ， 從而可能錯(cuò)誤地確定性狀的同源性 ， 因而該分類系統(tǒng)不能真正反映木霉屬各類群間的親緣關(guān)系和演化系統(tǒng) 。 以生物大分子為主要研究內(nèi)容的分子系統(tǒng)學(xué)研究表明， 不同分類水平的遺傳變異可以被描述并用作木霉屬級(jí) 、 種級(jí)的定界 。 長期以來 ,真菌的分類鑒定一直以形態(tài)學(xué)性狀為主要依據(jù) ,而這些形態(tài)學(xué)性狀由于 難以觀察、或在人工培養(yǎng)條件下很難產(chǎn)孢而觀察不到、或者本身形態(tài)特征相近很難區(qū)分 ,以及易受環(huán)境條件的影響而不穩(wěn)定等原因，給真菌的分類鑒定，尤其是種及種以下的分類鑒定帶來了一定的難度（章中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 引言 4 初龍和徐同， 2000）。 二十世紀(jì)八十年代以來，木霉分子生物學(xué)研究取得了重大的進(jìn)展（徐同， 1996）。現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在真菌分類鑒定上的應(yīng)用 ,為人們從分子水平上分析真菌不同分類單元之間的差異和親緣關(guān)系提供了有力的手段。分子生物學(xué)方法能直接從 形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)更客觀準(zhǔn)確，并且操作簡便， 準(zhǔn)確性可靠，特異性高。因此應(yīng)用分子生物學(xué)方法從遺傳進(jìn)化角度闡明真菌種群之間和種群內(nèi)的分類關(guān)系是目前真菌分類研究的熱點(diǎn)。 目 前 用 得 較 多 的 是 限 制 性 片 段 長 度 多 態(tài) 性 (隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(列分析技術(shù)（李敏慧等， 2003）。 2、 測技術(shù)在木霉分類研究中的應(yīng)用 況 1984 年 ， 士和 立 份有限公司，公司位于美國加州北部 全球高新技術(shù)百強(qiáng)之一。 力于微生物鑒定領(lǐng)域新技術(shù)新產(chǎn)品的開發(fā)、生產(chǎn)和銷售， 1989 年自 世以來至今，經(jīng)過不斷升級(jí)，目前已經(jīng)可鑒定包括細(xì)菌、酵母