第一章 前言 宮頸癌是 危害女性健康 最常見(jiàn)的 惡性腫瘤之一。 1 報(bào)道，全球每年發(fā)生宮頸癌的人數(shù)為 女性新發(fā)癌癥病例的 15%，其中，約有 發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌的發(fā)病率占全球總數(shù)的 80%，它已成為發(fā)展中國(guó)家女性死亡的主要原因之一 2。 在我國(guó)，宮頸癌的發(fā)病率占女性生殖道惡性腫瘤的第一位， 它的 發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與、多階段改變的過(guò)程， 目前其病死率及預(yù)后主要取決于腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移 。雖然隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷提高，宮頸癌的發(fā)病率明顯下降，但是它的轉(zhuǎn)移病死率仍然很高。因此，對(duì) 于宮頸癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的研究對(duì)于女性生殖健康的意義重大深遠(yuǎn)。 宮頸惡性腫瘤的癌前病變稱為宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（即 它是一組疾病的統(tǒng)稱，主要包括有宮頸不典型增生及宮頸原位癌。 宮頸原位癌是指宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生癌變，但癌變未突破基底膜，也沒(méi)有間質(zhì)的侵害。宮頸不典型增生是指宮頸上皮細(xì)胞部分或是大部分被不同程度的異型細(xì)胞所代替，根據(jù)其侵害上皮的程度，可以分為三個(gè)級(jí)別。 各種級(jí)別的宮頸上皮內(nèi)瘤樣變都有可能進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的可能，一般來(lái)講，級(jí)別越高，進(jìn)展為浸潤(rùn)癌的機(jī)會(huì)越多；級(jí)別越低，恢復(fù)正常的機(jī)會(huì)越多。宮頸上皮內(nèi)瘤樣變主要 是反映 宮頸癌連續(xù)的 發(fā)生發(fā)展過(guò)程，經(jīng)歷由宮頸不典型增生 (由輕到重 )發(fā)展為原位癌，再由早期浸潤(rùn)癌 浸潤(rùn)癌的一系列病理變化。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（ 出的 斷標(biāo)準(zhǔn)：將鱗狀細(xì)胞異常從細(xì)胞學(xué)的角度上分為 3 類：不典型鱗狀上皮（ 輕度鱗狀上皮內(nèi)病變（ 重度鱗狀上皮內(nèi)病變（ 相當(dāng)于 少發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌。- 相當(dāng)于 能會(huì)發(fā)展為宮頸浸潤(rùn)癌。 堿性螺旋環(huán)螺旋（ 白家族結(jié)構(gòu)上非常 保守，它們都含有一個(gè)堿性氨基酸鏈 (100p)連接 2個(gè) 螺旋結(jié)構(gòu)，在胚胎肌組織、神經(jīng)、造血和心臟、骨形成等的過(guò)程中起重要的作用，同時(shí)也可以負(fù)性調(diào)控細(xì)胞的分化、組織的形成 3. 性結(jié)構(gòu)域則拉在一起形成一個(gè)雙向的 異性的識(shí)別 指任何核苷酸 )，即所謂的，來(lái)激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。 于于 1983年最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)， 之后在魚類、水母、線蟲、青蛙、鼠類、人類中相繼發(fā)現(xiàn)。 們均能編碼堿性的螺旋 螺旋 且 ,在小鼠和人類的氨基酸序列中，它們具有 96%的同源性，在不同種屬中它們的00%的序列保守性，均能結(jié)合 的 含有 1個(gè)內(nèi)含子， 2個(gè)外顯子。其中 第 1個(gè)外顯子長(zhǎng)為 772 整個(gè)編碼區(qū)域都包含于其中；內(nèi)含子長(zhǎng)為 538669 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用是通過(guò)形成二聚體的方式實(shí)現(xiàn)的 5。脊椎動(dòng)物有兩種 號(hào)染色體， 號(hào)染色體 6， 7。人類 995年 被發(fā)現(xiàn) ,它的 80碼蛋白和 者在 末端結(jié)構(gòu)域相似率 90%以上， 參與 8，但是 9，因此兩者的氨基端有些不同。 60個(gè)氨基酸，分子量為 18電點(diǎn)為 03個(gè)氨基酸，分子量為 21守的 59氨基酸到第 118氨基酸，其中包括 20個(gè)氨基酸堿性0個(gè)氨基酸的螺旋 螺旋的結(jié)構(gòu)域。靶基因啟動(dòng)子與是通過(guò)其羧基端的結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子 2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄的功能。 多種組織細(xì)胞中，包括真皮、肌肉、脂肪、成骨細(xì)胞、軟骨等的分化中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的 10。 在分化的早期階段增加，晚期則降低。對(duì)將 驗(yàn)結(jié)果 證明比 3天未分化的骨母細(xì)胞，在 21天己分化的骨母細(xì)胞中 個(gè)實(shí)驗(yàn)提示 11。在小鼠脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中 12。因此，我們推論 果蠅胚層發(fā)育的過(guò)程中， 物模型提示： 及異源同組雙突變的小鼠表型與 同，都會(huì)在出生后出現(xiàn)嚴(yán)重的能量耗竭，這提示 于人類， 對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞重建及遷移發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，括骨骼的軸部及其附屬物的間葉細(xì)胞前體、顱面部的腭部上頜骨發(fā)育的間葉細(xì)胞）形成的整個(gè)過(guò)程中，并且它在真皮發(fā)育中的作用與一型膠原發(fā)生重疊。在人類的周圍中胚葉細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞（軟骨盤的早期）中，均可檢測(cè)出 現(xiàn)在手、足趾的末端。在人體皮膚的表皮下未分 化的早期間葉細(xì)胞層也可見(jiàn) 外， 中包括分泌酶的胃主細(xì)胞，也可見(jiàn)于前列腺上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)、腎集合管和分泌管、細(xì)支氣管和肺泡、睪丸生精管、卵巢濾泡粒層細(xì)胞及一些發(fā)育中的內(nèi)臟、腎臟、肺臟、結(jié)締組織 6。 胞中也表達(dá)，提示它可能在能量自穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起一定的作用 。研究表明： 列腺組織中高表達(dá)，在心臟、脊髓、腎臟、肝臟、肌肉中較多表達(dá)，在胰腺、腦中度表達(dá)，但是在胸腺、脾臟中卻不表達(dá)。結(jié)合以上研究成果，并對(duì)人、雞和鼠源的 基因組中符合這一特點(diǎn)的基因大多是具有復(fù)雜功能且在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等方面發(fā)揮重要作用的基因。 惡性腫瘤是一類細(xì)胞周期失控性疾病， 腫瘤發(fā)生的主要表現(xiàn)特征是細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞凋亡抑制。 當(dāng)細(xì)胞促凋亡基因活性受到抑制和 (或 )抗凋亡基因被激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖 /凋亡失平衡，則造成惡性腫瘤形成。 13 發(fā)現(xiàn)， 而 轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)方向抑制 而來(lái)對(duì)抗 鼠雙微體 2/制細(xì)胞凋亡的出現(xiàn)，使得細(xì)胞大量增殖 14 。 在 ， 絲氨酸 20的自身磷酸化是不可或缺的重要步驟， 止 外 , 300介導(dǎo)的乙?；?間接抑制 15 。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在 16 。 目前對(duì)小鼠細(xì)胞的研究認(rèn)為 急、慢性凋亡刺激起保護(hù)作用。 抗由 17， 僅該細(xì)胞的 且對(duì) 驗(yàn)構(gòu)建一組將 現(xiàn)刪除 夠去除該蛋白抑制 而缺乏 們抑制些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明 65活性的部位在羧基端。實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 激活參與組蛋白脫乙?；?。 8等研究證實(shí) 活性，減少在成熟 1的表達(dá)，從而抑制了由半乳糖凝集素 外。作用于 細(xì)胞中的表達(dá)。 著降低 不是增加 比 實(shí) 腫瘤 是人體器官組織的細(xì)胞在外來(lái)和內(nèi)在的有害因素的長(zhǎng)期作用下所產(chǎn)生的一種以細(xì)胞過(guò)度增殖為主要特點(diǎn)的新生物。 由于表觀遺傳學(xué)或遺傳基因等各種因素的改變，會(huì)導(dǎo)致正常的細(xì)胞發(fā)生一些生理學(xué)的改變，從而引起腫瘤的發(fā)生。這些生理學(xué)的改變主要包括 : 對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)的不敏感；獲得自給自足的生長(zhǎng)信號(hào)；抵抗細(xì)胞凋亡；獲得血管新生的能力；獲得無(wú)限增殖的潛能；獲得浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移能力。其中，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是大部分腫瘤致死率高及預(yù)后不良的主要因素。研究表明 改變過(guò)程 19。 上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞的轉(zhuǎn)變）是指在一些因素的作用下，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性 , 丟失了細(xì)胞間的緊密連接和黏附連接 , 細(xì)胞骨架得以重塑 , 從而獲得了浸潤(rùn)性和游走遷移的能力 , 變成了具有間葉細(xì)胞特性和形態(tài)的細(xì)胞。 0于 1982年研究發(fā)現(xiàn)晶狀體的上皮細(xì)胞在膠原凝膠中能夠形成偽足，轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞樣的形態(tài)，遂提出了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變這一概念。隨后陸續(xù)有報(bào)道稱神經(jīng)嵴、顱面部、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)是胚胎細(xì)胞通過(guò) 著非常重要的作用 但同時(shí)它也可能會(huì)導(dǎo)致器官纖維化并通過(guò)多種機(jī)制來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。是早期腫瘤獲得侵襲性表型的重要步驟30。 可以防止細(xì)胞凋亡和衰老 ,導(dǎo)致免疫抑制。 在皮細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)逐漸消失，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，細(xì)胞的極性和骨架被改變，進(jìn)而使抗凋亡能力增強(qiáng) 21,22 。研究報(bào)道，一些上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)發(fā)生 而獲得間充質(zhì)細(xì)胞的表型，腫瘤細(xì)胞也在此基礎(chǔ)上獲得了侵襲 和轉(zhuǎn)移的能力。另外研究報(bào)道當(dāng)惡性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn) 可以視為腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的開(kāi)始 23。因此 質(zhì)降解蛋白酶及間質(zhì)標(biāo)記物如 24。 上皮組織中一類依賴 細(xì)胞間粘連跨膜糖蛋白分子，參與 賴性細(xì)胞粘附的過(guò)程。它的編碼基因位于 16號(hào)染色體上，主要由含 合位點(diǎn)的胞外區(qū)、疏水的跨膜區(qū)、保 守的胞內(nèi)區(qū)共同組成，其中胞內(nèi)區(qū)包含環(huán)連蛋白（ 其他調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng) 在時(shí)，鄰近細(xì)胞間的 此復(fù)合體再直接連接到肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架上，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的緊密連接和細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它對(duì)于維持上皮的極性和完整性發(fā)揮著重要的作用 25。這對(duì)于成體器官中上皮組織的功能發(fā)揮及動(dòng)態(tài)平衡是必不可少的。研究發(fā)現(xiàn)，在上皮性腫瘤進(jìn)展的過(guò)程中，均發(fā)現(xiàn) 程度的丟失或功能抑制，并與腫瘤的分化、分期密切相關(guān)。它還 與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，能夠預(yù)示腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后。 體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)侵襲性腫瘤細(xì)胞可通過(guò)轉(zhuǎn)染 26。 夠觸發(fā) 將 它在腫瘤細(xì)胞株和移植瘤小鼠模型中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了腫瘤的侵襲，并與臨床預(yù)后差的人類癌癥相關(guān)。根據(jù)近幾年的研究表明， 27 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng) 路受到抑制時(shí)， 而誘導(dǎo)間質(zhì)向上皮逆行轉(zhuǎn)換。胎發(fā)育，炎癥和癌癥）中上調(diào)，主要信號(hào)有氧，配體結(jié)合的受體酪氨酸激酶的激活和炎癥細(xì)胞因子受體 28,29。如 30。目前， 道 表達(dá)下調(diào) 31。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞 的結(jié)構(gòu)越混亂、癌細(xì)胞的異型性越高、侵襲性越強(qiáng) , 集中、染色越深 32。迄今為止，很多研究均提示 制非惡性細(xì)胞分化 33,9,8,11，是誘導(dǎo)非惡性細(xì)胞腫瘤的發(fā)生，促進(jìn)惡性細(xì)胞腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的一種新型癌基因。 可能在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要作用。 2 研究依據(jù) 與 達(dá)的重疊性，功能上的部分一致性的特 點(diǎn)。但是， 兩者的表達(dá)強(qiáng)度在不同組織中存在著很大的差別，雖然 是對(duì) 有研究證實(shí)，在膀胱癌 34胃癌、前列腺癌 35、食管癌 36、鼻咽癌 37、口腔鱗狀細(xì)胞腫瘤 38、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤 39中出現(xiàn) 為與 在人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中是否如 究表明： 是在不同器官的表達(dá) 量不同；而 有研究證實(shí)，乳腺癌中 布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核也有少量的表達(dá)； 要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上；而在胃癌組織中， 40研究發(fā)現(xiàn) 對(duì)肝癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移無(wú)影響，與 是， 在乳腺癌中的表達(dá)雖然也增加，但分布在細(xì)胞核中；在胃癌組織 、非癌的胃組織、癌旁組織中雖都有表達(dá)，主要是分布在細(xì)胞質(zhì)，但未存在著明顯的差異性； 對(duì)肝癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移有影響，與 據(jù)以上這些研究，結(jié)果提示 不同的腫瘤中亦有不同的功能。目前 有初步研究顯示它與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān) 17,33。作為一種新的癌相關(guān)基因， 是發(fā)揮與 制 導(dǎo) 是有其自己獨(dú)特的功能 ?因此 本文主要探討 否與宮頸癌的發(fā)生相關(guān)，分析 襲以及轉(zhuǎn)移中的功能。對(duì)于 助于我們對(duì)同一基因在不同腫瘤中差異作用的認(rèn)識(shí)，將對(duì)宮頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有進(jìn)一步的了解，同時(shí)對(duì)宮頸癌的預(yù)防、早期診斷、治療與判斷預(yù)后均有重要的指導(dǎo)意義。 第二章 材料與方法 料 織標(biāo)本 1、選取 2010 年 06 月 04 月 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行 宮頸癌手術(shù)或?qū)m頸組織活檢切除的 162 例宮頸組織，其中 正常宮頸組（ 30 例）、低度病變組（ ）（ 35 例）、高度病變組（ - ）（ 44 例）、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組（ 53 例），（按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 (009 年手術(shù)分期，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組中 a 期 22 例， b 31 例；根據(jù)術(shù)后病檢證實(shí)是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分為無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（ n=23)和有 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（ n=30)；根據(jù)患者的年齡，分為45 歲組（ n=37)和 45 歲組（ n=16)；根據(jù)癌細(xì)胞組織學(xué)分級(jí)分為高、中分化組（ n=14)、和低分化組（ n=39)）。這些標(biāo)本用于免疫組織化學(xué)的檢測(cè)。 2、另取 60例 (20例宮頸癌、 20例 20例正常宮頸 )新鮮的宮頸組織，于離體后 30理鹽水沖洗干凈，立即放入液氮中凍存，以備 3、所有標(biāo)本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師診斷證實(shí)，術(shù)前均未接受放化療及其他特殊治療。 驗(yàn)所需的 主要儀器 恒溫水浴箱 上海榮計(jì)達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司 酶標(biāo)儀 瑞士帝肯（ 超凈工作臺(tái) 山東博科 純水器 北京亞興泰機(jī)電設(shè)備有限公司 學(xué)倒置顯微鏡 日本 低溫高速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司 燥箱 上海艾測(cè)電子科技有限公司 5 無(wú)錫盟合試驗(yàn)儀器有 限公司 量移液器（ 5ul,0ul,200 上海亞榮生化儀器廠 垂直電泳槽 美國(guó) 司 轉(zhuǎn)移電泳槽 美國(guó) 司 分析天平 日本島津電子 浴恒溫振蕩器 上海雷韻試驗(yàn)儀器制造公司 北京君意 顯恒溫水浴箱 北京中科三 研科技有限責(zé)任公司 膠電泳儀設(shè)備 湖南東大科學(xué)儀器設(shè)備有限公司 平搖床 太倉(cāng)市科教器材廠 包埋機(jī) 輪轉(zhuǎn)式組織切片機(jī) 德國(guó) 病理組織漂烘處理儀 冰箱 海爾冰箱 普通電磁爐 海爾 濕孵育盒 自制 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 廈門華之鑫商貿(mào)有限公司 通高壓鍋 蘇泊爾 實(shí)驗(yàn)所需的器械 眼科鑷，槍狀鑷，組織剪，玻璃平皿，量筒（ 1005001000燒杯（ 10005000移液管，凍存管， 紙， 普林瓶，避光片盒，載玻片，蓋玻片，片盒等 驗(yàn)所需的主要試劑、來(lái)源及配制 兔抗人 美國(guó) 兔抗人 武漢博士德生物技術(shù)有限公司 兔抗人 武漢博士德生物技術(shù)有限公司 武漢博士德生物技術(shù)有限公司 北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司 免疫組化 北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司 北京百泰克公司 蛋白電泳預(yù)制膠、 美國(guó) 上海碧云天生物技術(shù)研究所 蛋白提取試劑盒 ( 上海碧云天生物技術(shù)研究所 二甲苯 上海試劑公司 3% 封閉用血清工作液 北京中山金橋生物技術(shù)有限公司 4的多聚甲醛 蘇木素染色液 檸檬酸鹽修復(fù)液 蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科免疫組化室提供 其他化學(xué)試劑如下： 1、 2% 分離膠 和 5% 濃縮膠膠版。 12%分離膠 的配制：體系 5成成分 12分離膠 (蒸餾水 0%丙烯酸胺 0%0%過(guò)硫酸胺（ 用移液器將 上述 組分 依次加入到 10燥清潔 的 小燒杯中，輕輕吹打 使其均勻 。 將其 緊貼玻璃板沿制膠板一角緩慢灌入凝膠板間（高度大約離開(kāi)口 高影響濃縮膠的灌制），使用超純水封頂壓線，室溫靜置 20鐘。此時(shí)在水和膠之間可清楚的看到一條折射線，表明膠已經(jīng)凝固。小心倒去玻璃板間上層蒸餾水，并用吸水紙將水吸干。 5%濃縮膠 的配制： 體系 成成分 5%濃縮膠（ 蒸餾水 0%丙烯酸胺 0%0%過(guò)硫酸胺（ 用移液器將上述組分依次加入到 5輕吹打均勻，緊貼玻璃板沿制膠板一角緩慢灌入至玻璃板口，迅速將齒梳插入玻璃板 間，室溫靜置20濃縮膠充分凝固后，兩手緩慢向上平行拔出齒梳。蒸餾水沖洗玻璃板表面殘膠及板間濃縮膠梳齒孔以清理殘膠碎片，之后使用微量注射器吸凈齒梳間水，固定與電泳槽中備用 ， 4保存。（注：凝膠液注入玻璃板夾層時(shí)要將氣泡充分排出，梳齒插入玻璃板時(shí)每孔中都不應(yīng)該有氣泡） 2、 5蛋白上樣緩沖液 ： 1 的 H g； 溴酚藍(lán) 50油 5水定容至 10勻。 3、 1蛋白電泳緩沖液 ： g；甘氨酸 g； 定容至 200 4、脫脂牛奶封閉液： 5g 牛奶溶于 5液 20，加 定容至100 5、 5液： 0g； 入 定容至500 溶液 到 儲(chǔ)液稀釋成為 1， 500入 250 膜液。 6、 1000酸氫二納 化鈉 化鉀 勻，測(cè) 偏離此范圍，可用 存于室溫。 7、 檸檬酸鹽抗原修復(fù)液：用 1000g，勻，測(cè)定 溫保存。 8、蘇木素染液配制：原料為蘇木素 1g、無(wú)水酒精 50醋酸 5油 50餾水 50酸鋁鉀 5g，將蘇木素溶于無(wú)水酒精中，硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中后將所有原料都加在一起，充分?jǐn)嚢杈鶆颉?2 2 實(shí)驗(yàn)方法 蛋白印記法（ 目前對(duì)蛋白進(jìn)行定量及定性檢測(cè)最常采用的檢測(cè)手段，其核心步驟是使用 先是將提取的膜蛋白標(biāo)本與 蛋白質(zhì)變性并解離為多肽，隨后在電泳過(guò)程中將已經(jīng)解離的蛋白多肽與強(qiáng)陰離子去污劑 成帶負(fù)電荷的 通兩極間的電流后，在凝膠中形成正、負(fù)極移動(dòng)界面，帶動(dòng) 先在濃縮膠層上進(jìn)行初步蛋白分離，之后進(jìn)入分離膠層進(jìn)一步按分子量大小對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行 區(qū)帶分離，然后通過(guò)轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 行隨后的抗原抗體反應(yīng)及熒光顯色。實(shí)驗(yàn)中參照系的設(shè)置對(duì)于實(shí)驗(yàn)本身及數(shù)據(jù)的分析至關(guān)重要。如蛋白 握電泳結(jié)束時(shí)間，確定目標(biāo)蛋白位置等。而 表達(dá)相對(duì)恒定，受環(huán)境影響變異不大的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參基因的設(shè)置不僅有助于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差矯正，對(duì)轉(zhuǎn)膜效率及顯色系統(tǒng)（顯影液、定影液質(zhì)量等）也具有一定的檢測(cè)作用。 頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗狀細(xì)胞癌中 蛋白提取 （ 1）將收集的新鮮宮頸組織取 50織剪剪碎，將樣本收集到 5 （ 2）按 1001000勻漿器中反復(fù)研磨以裂解細(xì)胞。 （ 3）在冰浴中超聲波徹底破碎組織樣本，超聲波程序?yàn)椋好}沖 3秒，停頓 10秒，50% 功率，共 15秒。 （ 4） 4 ， 12000r/心 10分鐘，上清液即為樣本總蛋白懸浮液，吸取上清液到一個(gè)新的微量離心管中，棄沉淀。 （ 5）取 20濃度的測(cè)定，從剩余樣品中取出 160入到另一個(gè)含有 40L 5蛋白上樣緩沖液的 量離心管中，混勻，蓋緊蓋子并用封口膜密封，于 95 沸水浴中煮 5分鐘，所得樣品可直接用于凍存于 冰箱。 白含量檢測(cè)： 目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量： （考馬斯亮藍(lán)法）、 等。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)使用的裂解液的不同，需要采用 適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，本實(shí)驗(yàn)采用 。 是 定法的一種改進(jìn)方法，是近來(lái)廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與 蛋白定量相似，即在堿性條件下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能夠與 合，生成絡(luò)合物，并且將 原成 二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，和 合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在 562有高的光吸收值，并且化合物的顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。與 相比 ， 白測(cè)定方法操作更簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性更好，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度高（微量檢測(cè)可達(dá)到 應(yīng)用更加靈活。與 敏感度最高，且與一系列干擾 應(yīng)的還原劑（如 基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。 檢測(cè)具體步驟：將 5u 試劑與 250應(yīng)色呈嫩綠色。用100l）與 4000ug/100l）混合，總體積為 200000g/ 100 000 g/m 。依此倍比稀釋共 7次，得到的 2000 g/250g/125g/行蛋白濃度的測(cè)定：將 2005溫靜置 30分鐘，紫外分光光度儀測(cè)定 562計(jì)算蛋白濃度。 驗(yàn)流程： （ 1） 膠的濃度與目標(biāo)蛋白的分子量相關(guān)， 子量為 18于小分子量蛋白，因此使用 12分離膠， 5%的濃縮膠。 制備 12% 分離膠和 5% 濃縮膠膠版。 （ 2）上樣及電泳： 按照電泳槽的要求將做好膠的玻璃板固定放好，將 1蛋白電泳緩沖液倒入 兩玻璃板之間至玻璃板的上緣，檢查是否漏液。使用微量加樣器加入蛋白樣品和蛋白 孔樣品的上樣量約為總蛋 白 60g。電泳槽內(nèi)灌入電泳緩沖液至電泳槽二分之一的高度， 上樣時(shí)盡量保持上樣量體積一致，每次上樣結(jié)束都要清洗微量上樣器，防止標(biāo)本交叉污染。上樣結(jié)束后 以恒流 15方式進(jìn)行電泳。 直到溴酚藍(lán)移至膠底，蛋白 離清楚。 關(guān)閉電源終止電泳。 (注意 :應(yīng)選擇合適的膠濃度和電壓電流參數(shù)，確保蛋白有效分離，條帶清晰整齊。 ) （ 3）轉(zhuǎn)膜：將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體上。（雜交膜的選擇是決定 敗的重要環(huán)節(jié) ）根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小，本實(shí)驗(yàn)選用 。 A將 1陽(yáng)極緩沖液 I、 1陽(yáng)極緩沖液 1陰極緩沖液、蒸餾水各 100一定次序擺放并標(biāo)明。 (應(yīng)根據(jù)蛋白大小，選擇合適的轉(zhuǎn)膜體系及電流參數(shù)和時(shí)間，通過(guò)調(diào)整緩沖液成分，提高轉(zhuǎn)膜效率及蛋白與膜的結(jié)合力。 ) B切膠：將凝膠從電泳儀中取出，依據(jù)蛋白 標(biāo)蛋白、內(nèi)參蛋白位置切除周邊廢膠及所有濃縮膠，直尺測(cè)量膠長(zhǎng)與膠寬，放陰極緩沖液中侵泡20 C依據(jù)膠長(zhǎng)及膠寬準(zhǔn)備 及濾紙： 比膠小 1極濾紙比膠大 極濾紙依次比 小 1 D將裁剪好的 置甲醇中活化 15 秒（以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合），水中侵泡 2在陽(yáng)極緩沖液 泡 5極及陽(yáng) I、陽(yáng) 紙分別置相應(yīng)緩沖液中侵泡至少 1 E依據(jù)如下順序自下而上（從陰極到陽(yáng)極）放置在轉(zhuǎn)膜儀 中：陰極濾紙 膠 陽(yáng) 陽(yáng) I。各層間自下而上依次減小， 并使用玻璃棒清除各層間氣泡。 F連接電源， 以恒流 200方式電泳 2 小時(shí)，全過(guò)程在冰水中進(jìn)行。 （ 4） 封閉：將轉(zhuǎn)膜完成的 泡入由 1沖液配成的 5%脫脂奶粉封閉液中，載有蛋白面的一側(cè)朝上，于室溫在脫色搖床上慢搖 2 小時(shí)。 (應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，選擇合適的封閉物和緩沖液，以及封閉液濃度和封閉時(shí)間，以降低非特異性反應(yīng)，達(dá)到最高的信噪比。 ) （ 5） 雜交抗體反應(yīng)：將上一步轉(zhuǎn)膜完成的 取出，放入一抗 （ 兔抗人克隆抗體（稀釋度 1 1000）、兔抗人 克隆抗體 （稀釋度1 500） 緩沖液中，載有蛋白面的一側(cè)朝上，于 4 在脫色搖床中慢搖過(guò)夜。 （ 6） 洗膜：取出 ，放入 沖液中，在脫色搖床上緩慢洗脫 8分鐘，倒掉 ，繼續(xù)加入新鮮 沖液進(jìn)行洗脫，一共洗三遍。 （ 7） 雜交二抗反應(yīng)：將上一步洗凈的 放入二抗緩沖液中，載有蛋白面一側(cè)朝上，室溫在脫色搖床中慢搖 2 小時(shí)。 （ 8） 洗膜：取出 ，放入 沖液中，在脫色搖床上緩慢洗脫 5分鐘，倒掉 ，繼續(xù)加入新鮮 沖液進(jìn)行洗脫，一共洗三遍。 （ 9） 顯色：取 光液 A 液、 B 液各 50l 等體積混合，孵育 1適當(dāng)大小的保鮮膜平鋪與暗盒內(nèi)，把 正面朝上平鋪在暗盒中間，將混合好的發(fā)光液滴于膜表面，將暗盒水平搖晃使發(fā)光液均勻分布于膜表面，之后將其用保鮮膜包好，于暗室中準(zhǔn)備曝光。 （ 10）曝光：打開(kāi)暗室紅外燈，將顯影液，定影液倒入塑料盤中，裁取適當(dāng)大小的 置在 上面，蓋緊暗盒，記時(shí)。曝光時(shí)間依據(jù)蛋白信號(hào)強(qiáng)弱選擇，一般需要 5 （ 11）顯影和定影：曝光完成后，打開(kāi)暗合，用鑷子將底片置顯影液中侵泡至出現(xiàn)清晰條帶（一般 1 終止顯影并將底片在清水中漂洗后置于顯影液中定影 1來(lái)水沖洗表面后常溫掛晾至干燥。 （ 12）圖片掃描及數(shù)據(jù)分析：將底片掃描后保存圖片，采用 像分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定，分析數(shù)據(jù)并計(jì)算各組 對(duì)表達(dá)量。 2 疫組織化學(xué)法的實(shí)驗(yàn)原理 免 疫 組 織 化 學(xué) （ 又 稱 免 疫 細(xì) 胞 化 學(xué)（ 它有很多種方法，本實(shí)驗(yàn)所采用的是 步法。與傳統(tǒng)的三步法相比，它的優(yōu)勢(shì)在于 ，它所采用的的二步法免疫組化廣譜檢測(cè)試劑能把酶和二抗抗體分子的單價(jià) 段聚合在一起，它直接替代了傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗，放大了抗原與抗體結(jié)合的信號(hào)，既可以保留抗體特異性結(jié)合抗原的能力，又能夠避免聚合分子過(guò)大而造成的空間位阻。與傳統(tǒng)的 步法相比，此法具有簡(jiǎn)單、敏感、快速等特點(diǎn)，系統(tǒng)中不使用生物素，可以避免由于內(nèi)源性生物素所造成的背景染色。由于本試劑盒獨(dú)特的 夠使細(xì)胞的通透性發(fā)生改變，這有利于大分子的檢測(cè)系統(tǒng)更有效地結(jié)合檢測(cè)的一抗分子，這個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)是目前已知的靈敏度最高的免疫組 化檢測(cè)系統(tǒng)。 用 免疫組織化學(xué)法（ 步法）檢測(cè) 正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中的表達(dá)。 （ 1）將收取的宮頸組織標(biāo)本用 復(fù)沖洗， 4的多聚甲醛固定組織，（固定的目的在于保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽(yáng)性，假陰性的結(jié)果）常規(guī)石蠟包埋、 4處理載玻片，撈片后置烤箱 60 60 分鐘使切片緊密粘附，防止脫片。 (2) 玻片脫蠟：將玻片放入二甲苯 5甲苯 5甲苯 中15水乙醇 I 5水乙醇 5水乙醇 595乙醇 55乙醇 5餾水 次， 5（時(shí)間和次數(shù)均可按需延長(zhǎng)）。 （ 3）熱修復(fù)抗原：將約 800入高壓鍋內(nèi)，調(diào)至1700 ，待鍋底冒氣泡開(kāi)始，放入切片，蓋好鍋蓋，待排氣開(kāi)始，約 10隔 10分鐘，待排氣停止后打開(kāi)鍋蓋，于室溫下自然冷卻（約 45 （ 4）取出切片， 次， 5。 （ 5）每張切片滴加 1 （ 50注：要將 全覆蓋組織）放入濕盒內(nèi)，室溫阻斷約 10 （ 6）取出切片， 洗 3 次， 5。 （ 7）滴加 5%閉液，于濕盒內(nèi)室溫下靜置 20去多余液體，不洗。 （ 8）擦干組織周圍，滴加一抗兔抗人 釋濃度 1:100）、兔抗人 釋濃度 1:100），陰性對(duì)照用 盒中 4 冰箱孵育 16 h。 （ 9）取出濕盒，室溫下復(fù)溫 45見(jiàn)盒蓋上有小水珠。 （ 10）傾去一抗， 次， 5。 （ 11）滴加通用型二抗 ,室溫下孵育 10 3分鐘 5 次。 （ 12）滴加通用型二抗 ，室溫下孵育 103 次，5。 （ 13） 邊觀察邊顯色）使用 1,B,滴加入試劑盒中，混勻后加至切片。室溫顯色。鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在 5旦變色，適時(shí)終止，甩去多余水分。 （ 14）終止顯色后，用自來(lái)水洗泡 5干水分。 （ 15）蒸餾水 沖 3 遍，浸入蘇木素復(fù)染核 3來(lái)水沖洗片刻至無(wú)色，蒸餾水沖洗 1 遍， 75%的鹽酸酒精溶液分化 15 秒 ,自來(lái)水沖洗 5化（至切片呈紫藍(lán)色），流動(dòng)的自來(lái)水沖洗返藍(lán)，流水 4持切片濕潤(rùn)（切記切片不可干）光鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色。 （ 16）蒸餾水 3切片晾干或吹干。 （ 17）脫水： 85%乙醇 3 分鐘 95% 乙醇 3 分鐘 無(wú)水乙醇 I 5無(wú)水乙醇 5二甲苯 I 中 5二甲苯 5干后中性樹膠封片。 （ 18）日本 微圖像采集系統(tǒng)拍片采圖。 結(jié)果判斷 疫組化法結(jié)果判定： 按胞質(zhì)、胞膜和胞核 3種表達(dá)部位的染色情況分別制定染色評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。 主要位于細(xì)胞核與細(xì)胞 質(zhì)中， 性信號(hào)為棕黃色顆粒，主要定位于胞膜，少許細(xì)胞質(zhì)亦出現(xiàn) 。 參照文獻(xiàn) 41， 性細(xì)胞百分率：每例標(biāo)本選擇 10個(gè)含有陽(yáng)性細(xì)胞的高倍視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，取其平均值計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 0為陽(yáng)性細(xì)胞 50。染色強(qiáng)度： 0為無(wú)色陰性（ -）； +）； 2為棕黃色（ +）； 3