蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 皮素的來源 黃酮類化合物 (一個含有多酚類 的化學(xué)物質(zhì) ，以游離態(tài)形式或者與糖結(jié)合成苷的形式存在。 很早之前， 人類就已經(jīng)意識到黃酮類化合物具有很多的 藥理活性，但直到近代人們才開始研究它們的藥理活性、代謝途徑等，有關(guān)黃酮類化合物種類及應(yīng)用方面的研究 還 有很多問題亟待解決 (2004)。 柚皮素 (是一種重要的黃酮類化合物，化學(xué)名稱為 4,5,7 是 柚皮苷 （ 的苷元 ，具有抗氧化、抗炎、抑菌等生理活性，近年來備受重視 (1996)。柚皮素及柚皮苷主要存在于蕓香科柑橘屬植物的莖、葉、或果實中。 (1995)。其外觀為白色針狀結(jié)晶，溶于乙醇、乙醚和苯，幾乎不溶于水。柚皮素 生產(chǎn)工藝主要由醇提、萃取、層析、結(jié)晶等工序完成。 目前提取柚皮素的主要方法是 萃取法和柚皮苷水解法 。 劉亞萍從化橘紅（蕓香科植物華州柚的未成熟果皮）里提取出柚皮苷，采用雙蒸水作為溶劑、濃硫酸 作 為催化劑，把精制提取出的柚皮苷完全水解， 可以 得到 高純度的柚皮素 (劉亞萍， 2008)， 其化 學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。 圖 1 柚皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 （ 72g/ of 72g/ 皮素藥理活性 柚皮素具有多種藥理活性，是黃酮 類化合物 中一個具有代表性的藥物。 腫瘤 近年來，科學(xué)家們在類黃酮化合物上的著力點是它 們 的抗腫瘤活性，相關(guān)研究也是圍繞著抗腫瘤活性展開的。 為柚皮素 通過 抑制腫瘤細(xì)胞 各個 階段 的細(xì)胞 增殖發(fā)揮抗癌作用 (1983)；李瑞芳等研究了柚皮素對人 慢性骨髓性系白血病細(xì)蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 2 胞株 （ 的作用機(jī)制及生長影響。初步研究表明，柚皮素可以明顯抑制 胞的增殖，并說明了 其 作用機(jī)理可能是柚皮素阻滯 了 胞周期進(jìn)程，并誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡 (李瑞芳 ， 2007)。 郭國超等研究了柚皮素衍生物的合成 ， 首先以碘甲烷為甲基化試劑、碳酸鉀為縮合試劑進(jìn)行了烷基化反應(yīng)，得到 7,4后以硫酸為催化劑、乙酸酐為?；噭┻M(jìn)行了酯化反應(yīng)，制備出了 5,7， 4這 兩種衍生物對人源肝 腫瘤細(xì)胞 1 的 抑制率 分別 為 (郭國超 ， 2010)。 復(fù)功能 證明了柚皮素可以修復(fù)氧化受損的前列腺癌細(xì)胞的 其 在壞死狀態(tài)下得 以 激活而復(fù)生 (2006)；李桃園 等 認(rèn)為柚皮素不 僅 可以減輕 致的急性肝損傷中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且 可 以顯著性降低肝臟細(xì)胞核 單鏈斷裂氧化損傷水平 (李桃園 ， 2010)。 氧化、抗衰老 在 前人的研究基礎(chǔ)之上， 近期柚皮素的 抗氧化作用 研究 成為焦點 。 認(rèn)為柚皮素具有抗氧化、抗衰老的作用 (1986)； 究發(fā)現(xiàn)柚皮素的抗氧化能力可滲透到脂質(zhì)雙分子層中 ，并 借助模式生物對柚皮素的抗氧化 、 延緩衰老作用展開了討論 (1995)。 保護(hù)功能 過大鼠實驗，發(fā)現(xiàn)柚皮素能夠降低血漿與肝臟中膽固醇的濃聚水平 (1999)。通過小鼠實驗，宋紫輝發(fā)現(xiàn)了柚皮素對急性免疫性肝損傷具有保護(hù)作用，柚皮素直接抑制了 T 淋巴細(xì)胞的激活，并且阻止了許多炎癥因子分泌，從而減輕了小鼠急性免疫性肝損傷 (宋紫輝 ， 2009)。柚皮素還能 有效 降低肝炎 C 病毒 感染的 肝臟細(xì)胞數(shù)量 ，起到有效 的肝臟保護(hù)作用 (2008)。 它活性 現(xiàn)柚皮素可以增加雌激素受體的濃度，發(fā)揮 起作用并 促進(jìn)子宮發(fā)育 (2004)。有 研究表明，柚皮素具有抑菌 活性， 對大腸桿菌、金黃葡萄球菌等細(xì)菌和真菌有很強(qiáng)的抑制作用 (2008)。 化學(xué)物質(zhì) ， 如巴豆油、二甲苯等 ， 可引起急性炎癥 ， 表現(xiàn)為局部充血 ， 水腫等炎癥反應(yīng)。若將這些物質(zhì)涂于小鼠耳部 ， 可誘導(dǎo)其耳部腫脹 ， 抗炎藥物可使腫脹減輕甚至消除。通過該藥效方法 ， 人通過實驗發(fā)現(xiàn) ，以小鼠耳片重量差為指 標(biāo)的抗炎作用看 ， 柚皮素抗炎作用隨劑量增加 ， 抗炎作用增強(qiáng) ， 高劑量組效果最好 ， 抑制率達(dá) 38%左右。以小鼠耳片厚度差為指標(biāo)的抗炎作用看 , 柚皮素抗炎作用隨劑量增加 ， 抗炎作用增強(qiáng) ， 高劑量組抑制率達(dá) 結(jié)果說明 ， 柚皮素各劑量組均有抗炎效果 ， 隨劑量增加 ， 抗炎效果增加 ，具有良好的抗炎作用 (1994)。 以 明顯地減小細(xì)胞色素 的活性，抑制多種藥物在體內(nèi)的代謝(2001)。 此外， 柚皮素金屬配合物體外亦顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性 (2006)蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 3 及修復(fù) 能力 (i, 2007)。但 是，目前有關(guān)柚皮素 環(huán)糊精衍生物類包合物和金屬 配合物的 生物 活性卻從未報道過。 皮素 其它應(yīng)用價值 柚皮素具有重要的生物活性 ，不但 應(yīng)用于醫(yī)學(xué) 中，還在 化工、食品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域廣泛 應(yīng)用 (呂愛新 ， 2011)。 工領(lǐng)域中的應(yīng)用 分子印跡聚合物，是一種新型高分子材料，對模板分子的識別具有“預(yù)定”能力，在仿生傳感器、手性物質(zhì)拆分、生物分離、抗體模擬、酶催化模擬等領(lǐng)域中具有不可比擬的應(yīng)用前景。鄭細(xì) 鳴 在開發(fā)高分子材料過程中，以柚皮 素為模板分子 、 乙二醇二甲基的丙烯酸甲酯為交聯(lián)試劑 、 氯丙烯酰胺為功能單體，研究單步溶個脹聚合的方法制備了單分散的分子印跡之聚合物微球 （ 。 這種特殊的微球?qū)τ谀０娣肿泳哂泻軓?qiáng)的特異吸附能力 (鄭細(xì)鳴 ， 2006)。 品領(lǐng)域中 的應(yīng)用 柚皮素可被 用 做食品的香料添加劑，常 被 用于苦味、辣味食品以及食用油的 矯味 。 從西班牙出產(chǎn)的檸檬和橄欖中提取 柚皮素 ，并把它作為一種功能型的食品添加劑 ； 在此后的系列研究中發(fā)現(xiàn)， 它 可 用于 治療由 于 血液 中 膽固醇與甘油三酯 過高所 引起的疾病 (2010)。 業(yè)領(lǐng)域中 的應(yīng)用 類黃酮物質(zhì)具有抗菌和酶抑制等作用。 取有機(jī)溶劑萃取 方法 在 日本出產(chǎn)的赤小豆、蕓豆、綠豆、豇豆等食用豆科植物中，提取了柚皮素類的衍生物 。研究表明， 它們 都可以制作成殺蟲劑，可以較好地防治豆象等害蟲 ， 是一種新型的 、 環(huán)境友好 的 生物農(nóng)藥，具有極為重要的應(yīng)用價值 (2004)。 皮素劑型與臨床應(yīng)用進(jìn)展 柚皮素?zé)o論是制備成片劑還是膠囊劑，都普遍存在著體外溶出度和生物利用度方面不夠理想的問題 ，以其 作為 單獨 活性成分的藥物 處 方 或制劑，國內(nèi)外鮮有報 道 。 國內(nèi) 已 有專利申請柚皮素的片劑， 提示該制劑 可增高肝細(xì)胞的微粒體酶的活性，加速肝的解 毒 能力；降低四氯化碳引起的大鼠血清谷 同時 還可降低四氯化碳、鬼筆堿、硫化乙酰胺、豬屎豆堿等肝臟毒物引起的各種類型的肝損傷的細(xì)胞膜，而達(dá)到明顯的肝臟保護(hù)作用。 加藥物溶解度和生物利用度的方法 針對難溶性藥物口服給藥生物利用度低、難以制成水溶劑液體制劑等問題，國內(nèi)外藥學(xué)工作者進(jìn) 行了大量的探索和研究。目前增加難溶性藥物溶解度的傳統(tǒng)手段，多采用超細(xì)粉碎、成鹽、添加增溶劑、助溶劑等措施 (崔福德 ， 2003)。除此之外，主要就是通過改變難溶性藥物的分子結(jié)構(gòu)、選用合適藥物晶型、采用包合技術(shù)、或采用合適的載體和制劑蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 4 技術(shù)改善藥物理化性質(zhì)，提高其與胃腸道黏膜的親和性和透過性，促進(jìn)其口服吸收 (朱盛山 ，2003； 陸彬 ， 2005) 成水溶性前體藥物 合成水溶性前體藥物主要是通過成酯、成鹽、或進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)修飾形成以共價鍵結(jié)合親水性大 分子。通過前體藥物增加難溶性藥物的水溶性，促進(jìn)其在胃腸道的吸收。前體藥物在體內(nèi)通過酶解或水解等作用轉(zhuǎn)化為原藥而發(fā)揮療效 (陸彬 ， 2005)。 備成環(huán)糊精包合物 制備成環(huán)糊精包 合物就是將難溶性藥物分子被包合于環(huán)糊精 (環(huán)糊精衍生物分子空腔中。由于藥物分子具有很高的分散度，同時由于環(huán)糊精的親水性，使包合物具有良好的可潤濕性，因此 增大了 藥物 的溶解度 ， 改善了 其體外溶出特性和人體生物利用度。 備成固體分散體 制備成固體分散體就是采用適當(dāng)工藝技術(shù) 將 難溶性藥物與適宜載體形成的固體分散體。由于藥物以微晶態(tài)，無定型態(tài)、膠體分散態(tài)或分子分散態(tài)存在，具有很大的分散度，當(dāng)與胃腸液接觸后，藥物的溶出速度加快，可促進(jìn)藥物的吸收，提高生物利用度。制備固體分散體常選 用親水性或兩親性載體材料，以不同載體材料制成的固體分散體對藥物溶出的影響不同，如以 載體，隨著 量增加，藥物的溶出速率增加， 子量的增加可提高藥物的吸收量，但藥物的吸收速率不受影響。以磷脂為載體制備的固體分散體可提高藥物的峰濃度，縮短達(dá)峰時間，但曲線下面積無顯著差異，增加載體的用量，藥物的溶出速率并不隨之增大。制備固體分散體的關(guān)鍵在于形成并保持藥物的高度分散狀態(tài)，一般采用熔融法和溶劑法。 增加藥物溶解度和生物利用度的方法很多， 在此 我們將重點介紹環(huán)糊精包合技術(shù)與應(yīng)用。 皮素的理化性質(zhì) 及溶解度和穩(wěn)定性的探討 柚皮素易 溶于 甲醇，溶于 乙醇、乙醚和苯 等非極性有機(jī)溶劑 ，幾乎不溶于水 ，同時 在空氣和溶液中 極易被氧化， 性質(zhì)很不穩(wěn)定。因此， 雖然柚皮素具有多種藥理活性，但它的理化性質(zhì)卻 降低了藥物的生物利用度， 限制了 藥效的發(fā)揮 。 通過對柚皮素的劑型 進(jìn)行 研究，找出 行之有效的 能夠改善其溶解度和 提高 穩(wěn)定性的新 方法變得較為迫切 。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 5 糊精概述 1891 年意大利科學(xué)家沙丁格發(fā)現(xiàn) 了 環(huán)糊精（ ，并由他的名字命名為沙丁格糊精（ 20 年 后世界第一例環(huán)糊精包合物問世。 1959 年 擇結(jié)合及催化一些有機(jī)反應(yīng)的性質(zhì)，并明確提出了可以借助分子間作用力制備包合物，以改變化合物的物理化學(xué)至性質(zhì) (童林薈， 2001)。由于環(huán)糊精本身并無毒副作用，可以在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面作為輔料廣為應(yīng)用，這些工業(yè)應(yīng)用極大地促進(jìn)了環(huán)糊精化學(xué)的發(fā)展。使用環(huán)糊精進(jìn)行包合的藥物在提高藥物生物利用度、溶解度、溶出速度等方面顯示出了其獨特的性質(zhì)，使得科學(xué)家們投入大量精力進(jìn)行研究 。 經(jīng)被中國、美國、日本及歐洲等國 作為口服輔料納為他們藥典的一員。比如，前列腺素 合物開發(fā)制作的新劑型也已在日本和歐洲發(fā)售，上市后的口碑不同凡響 （ 1999） 。此外，美國藥學(xué)會 載了多種 生物， 批準(zhǔn) 為藥用輔料上市，歐洲藥典也將 錄。 糊精作為新型藥用輔料的優(yōu)勢 環(huán)糊精作為藥物的新型輔料，可以有效 地 改進(jìn)藥劑處方。在藥學(xué)中的應(yīng)用，隨著不同用途的環(huán)糊精衍生物問世，目 前 在 緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑、透皮吸收制劑、黏膜吸收制劑等新型給藥系統(tǒng)的不斷開發(fā)中，環(huán)糊精的應(yīng)用研究也不斷地擴(kuò)大和深入。環(huán)糊精的優(yōu)勢主要集中于：提高藥物穩(wěn)定性；增加藥物溶出度，提高生物利用度；使液體藥物粉末化、防止藥物揮發(fā)；掩蓋藥物的不良?xì)馕?、降低刺激性；調(diào)節(jié)藥物的釋藥速率；促進(jìn)藥物經(jīng)皮膚和黏膜吸收等。在新制劑技術(shù)及新型給藥系統(tǒng)的開發(fā)中，深入研究環(huán)糊精具有非?？捎^的市場應(yīng)用價值 (朱盛山， 2003)。 糊精的空間結(jié)構(gòu) 環(huán)糊精結(jié)構(gòu)是一個 筒狀結(jié)構(gòu)的 多糖， 是淀粉經(jīng)酶解環(huán)合后得到的 612 個葡 萄糖分子連接而成的環(huán)狀低聚化合物 (1998)。 環(huán)糊精有一個疏水的中心結(jié)構(gòu)以及外部的親水表面，可以將客分子封裝至中心結(jié)構(gòu) ，從而 提高藥物的溶解度 (1999; 2006)。 糊精的分類 環(huán)糊精常見的結(jié)構(gòu)主要是 、 、 三種亞型，分 別是由 6、 7、 8 個葡萄糖分子，通過 苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物，對于絕大多數(shù)藥物來說， 內(nèi)徑稍??； 然腔內(nèi)徑較大，可用于包合很蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 6 多藥物，但價格昂貴； 洞大小適中更適合于包合藥物， 考慮到環(huán)糊精分子內(nèi)的洞穴直徑大小以及成本等因素 (1996)， 藥物制劑有比較重要的實際應(yīng)用價值 (2002; 代國飛 ， 2005)。葡萄糖分子上的 6 位羥基最有活性， 3 位上的羥基最穩(wěn) 定 。但是，環(huán)糊精上的羥基活性差別不是很大，這主要取決于反應(yīng)條件（溫度、堿度）。所以進(jìn)行專一性強(qiáng)、選擇性強(qiáng)的環(huán)糊精衍生物制備并不容易。 由于工業(yè)上制備的環(huán)糊精純度很低，要生產(chǎn)高純度的環(huán)糊精代價巨大，所以環(huán)糊精的應(yīng)用一直以來仍 受到限制。 糊精的水溶性 中溶解度較低。室溫下每 100能溶解大約 14g 23g 只能溶解 是因為 環(huán)狀結(jié)構(gòu)最致密，更易結(jié)晶。 合水溶性差的藥物后溶解度可以增加數(shù)倍，但也不過使藥物濃度達(dá)到 00就是 一個原因是 靜脈注射途徑人體給藥后，不能被人體代謝，在腎臟中以不溶性膽固醇的復(fù)合物晶體形式存在，從而導(dǎo)致非常嚴(yán)重的腎臟損傷；有些 萃取 ”紅細(xì)胞膜上的成分， 如磷脂、膽固醇和蛋白質(zhì)，從而造成膜的破裂和細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)的丟失，產(chǎn)生溶血作用 (2002;)。其中，隨機(jī)甲基 被認(rèn)為是不適用于注射途徑的輔料 (2002; 1999)。所以非常有必要對 行化學(xué)修飾或者結(jié)構(gòu)改造，提高其的溶解度、防止不溶性膽固醇的復(fù)合物晶體的形成而且還要密切關(guān)注其溶血性。 第一個用于制劑的環(huán)糊精衍生物是高水溶性的（ 2,6現(xiàn)在來看并不是一個很好的衍生物，但在當(dāng) 時卻是對許多疏水性藥物最為有效的增溶劑。這種衍生物表面活性高，對膽固醇有較高的親和力，即使 1mg/濃度也引起人體紅細(xì)胞的溶血。另外一個問題，其制備復(fù)雜、價格比較高昂。隨機(jī)甲基化的 已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)，完全可以替代 生物 (2002)。 第二類是用于非胃腸道途徑給藥的 生物，這其中以二羥丙基環(huán)糊精衍生物為代表，它通過環(huán)糊精在堿性水溶液中與 31,2稱 “表氯醇 ”）反應(yīng)制得。比如，含有羧甲基或二乙氨乙基的二羥丙基的離子基團(tuán)的環(huán)糊精衍生 物，可作為酸堿性藥物的優(yōu)良增溶劑。此類衍生物沒有表面活性與溶血性。因為其中含有一定量的平均分子量在30008000 道爾頓的高水溶性的環(huán)糊精低聚物。 這些衍生物可以用于口服或外用的制劑處方中，但目前還沒有作為非胃腸道給藥載體而進(jìn)行詳細(xì)的研究 (1998)。 第三類 生物以純度較好但分子量分布窄的羥烷基衍生物為代表，如羥乙基、蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 7 2類衍生物表面活性可以忽略不計，而且溶血性大大降低。毒理學(xué)研究進(jìn)一步表明其中至少有一種衍生物 ， 2 22非胃腸道給藥途徑即使在很高劑量下人體也具有很好的耐受性 。2國外已獲得了批準(zhǔn)上市，且含有 2藥物注射制劑也已經(jīng)投放市場。2有良好的增溶能力，可以解決一些難溶性藥物的溶解度低的問題，但其對藥物的增溶能力還不能達(dá)到令人十分滿意的地步， 例如 在具體應(yīng)用中還要使 用更高的劑量，或者被增溶的藥物形成溶液后穩(wěn)定性不太理想 (1999)。 另一類環(huán)糊精衍生物就是本課題中采用的磺丁基醚 ，其為羧烷基醚類衍生物，具有廣闊的應(yīng)用前景， 非均一的環(huán)糊精衍生物，表現(xiàn)為無定型或非結(jié)晶狀態(tài)，羧烷基直接與環(huán)糊精中的葡萄糖環(huán)相連，或者通過醚鍵與環(huán)糊精中的羥烷基側(cè)鏈相連。研究表明，環(huán)糊精環(huán)上隨著取代基的增多，其洞穴的包容能力也相應(yīng)地減弱，所以低取代的衍生物更具有優(yōu)勢；但另一方面環(huán)糊精環(huán)上取代程度增大，其溶解度變大，且離子基團(tuán)的取代能降低溶血作用，可以與不同的離子型客分子反應(yīng)，增加了包合物的穩(wěn)定性和溶解度。將離子 型基團(tuán)引入環(huán)糊精環(huán)上，不僅可以成鹽、增大溶解度，而且還具有一些新的藥理活性。目前烷基化 烷基化 們在穩(wěn)定性、低毒性、水溶性好等方面前景可觀 (2002; 2004)。 概述 背景介紹 無毒、安全等優(yōu)點，在科研生產(chǎn)上被越來越多地使用。 1,4對 、 3、 6 位羥基進(jìn)行取代合成，可以獲得 2 所示 (2002)。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 8 圖 2 磺丁基醚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 of 外觀是白色或偏白色的無定型粉末，在水中的溶解度可以高達(dá) 500g/L，30%的水溶液 為 其相對分子質(zhì)量 （ 與取代度 （ 關(guān)系為 ： 取代度為 4 的 704） 和取代度為 7 的 241） ， 商品 名 1990 年由美國 司開發(fā) (古福根 , 2004)。其中， 聚物的形式是 (種多聚物是陰離子 型的 、水溶性 較 高的環(huán)糊精衍生物 。 它們 可以 與藥物分子進(jìn)行包合形成非共價復(fù)合物， 從而 提高藥物的水溶性、穩(wěn)定性、安全性、降低其揮發(fā)性 、 腎毒性、控制藥物釋放速率并且掩蓋藥物不良?xì)馕?(2004; 2001)。前主要被 用 于 一種新型 抗癌藥物 的 眼部藥物傳遞 系統(tǒng) (2001)。 藥物 的增溶作用 藥物與 行物理作用，不但 可以 提高藥物在水中的溶解度、生物利用度，并且 包合 后環(huán)糊精可以緩控釋地把藥物傳遞到目標(biāo)位置， 釋放藥物 。這 種 制劑可以有效地降低藥物對目標(biāo)位置的刺激性、增加藥物的穩(wěn)定性、掩蓋藥物的異味 (1996)。在大鼠實驗中，靜脈注射甲潑尼松 合物，生物利用度有效地高于未包合的藥物（甲強(qiáng)龍磷酸酯，甲強(qiáng)龍半琥珀酸酯） (2001)。增溶桂利嗪， 1995)。 行包合制成口服片，給小狗喂食后檢測達(dá)那唑的生物利用度（ 在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)達(dá)那唑的絕對生物利用度可以達(dá)到 64%， 使原有 藥物的生物利用度提高了 33 倍 (2002)。 制備了青蒿素（ 合物，利用相溶解度法研究其包合比例，并通過熱重分析、末衍射和掃描電鏡檢查法進(jìn)行初步表征 ， 結(jié)果表明 ,蒿甲醚可以有效地封裝在環(huán)糊精空腔里。水溶液含有大量的包合物，其可溶性明顯高于游離青蒿素 (2012)。苯妥英（ 水溶性很差，儲存時會以沉淀形式析出，影響其藥理作用。 合物和 合物來提高原藥的生物利用度和溶解度。 別與 成 1:1 包合比的包合物，藥物動力學(xué)研究表明，包合物的生物利用度 （ 4h） 提高了兩倍 (1998)。地匹福林 （ 臨床上用 于治療高眼壓癥及慢性開角型青光眼，其水溶性及穩(wěn)定性都很差。 人研究了 ， 3770 環(huán)境下環(huán)糊精的濃度對藥物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，帶負(fù)電荷的 中性的 比能很好地與正電荷的 成穩(wěn)定的包合物并且顯著地提高了 液的穩(wěn)定性。 37 、 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 9 時， 液的穩(wěn)定性較提高了 100 倍，而 合物只提高了 5 倍 (1997)。 將 多西紫杉醇使用 行包合，增加了它的口服生 物利用度和水中的溶解度 (2012)。 目前常見蛋白質(zhì)類激素和多肽，也可采用環(huán)糊精及其衍生物進(jìn)行包合 (張奕 , 1999)。近期研究結(jié)果表明， 為一種新型的藥用輔料，具有其它環(huán)糊精類衍生物無法比擬的優(yōu)點，其負(fù)電荷支鏈對正電荷的含氮藥物有特殊的包埋性與親和力，能更好的增加藥物的穩(wěn)定性及溶解度，改善藥物的釋放速度，提高藥物的生物利用度，減少藥物的揮發(fā)性和藥物對局部組織的刺激性，降低毒副作用。雖然 經(jīng)有了很好的藥物應(yīng)用，但也存在著增加了某些藥物的穩(wěn)定性和溶解度的同時 ，出現(xiàn) 降低藥 效的缺點。所以，今后研究中如何克服這些缺陷，不同藥物與不同取代度的 包合作用對藥效的影響及藥物劑型應(yīng)用的關(guān)系，以及不同 件對包合作用的影響 需要 進(jìn)一步的研究 加以 探討。 屬配合物的背景介紹 過量的致癌因子在體內(nèi)由于自由基的富集，使脂質(zhì)細(xì)胞的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的 鏈斷裂，引起癌變 (曹志權(quán) ， 1993)。 科學(xué)家們受到金屬配合物的啟發(fā)， 通過對 天然藥物的有效成分與微量元素 的 深入研究 ，發(fā)現(xiàn)藥物的活性成分其實是無機(jī)與有機(jī)成分的協(xié)同作用 ，由此建立了 天然藥物配位化 學(xué)理論。 屬配合物配位研究 1870 年，蘇黎士大學(xué) 表了系列學(xué)說 “對于親和勢與價理論的貢獻(xiàn)”、“對于無機(jī)化合物結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)”，并首次闡釋了配位化合物、配位數(shù)及現(xiàn)代配位鍵的概念。配位化學(xué)學(xué)說 (朱旭祥 ， 1997)認(rèn)為， 單一的有機(jī)成分與微量元素都不是天然藥物的有效成分，只有當(dāng)有機(jī)成分與微量元素結(jié)合而成的配位化合物后，這種新型結(jié)構(gòu)更能體現(xiàn)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)，并代表中藥的活性作用核心。中藥配位化學(xué)學(xué)說指出，中藥的有效成分不僅是配合物的形式，而且以配合物形式在人體內(nèi)產(chǎn)生作用。我們所了解的中藥有效成分之間協(xié) 同或拮抗作用的本質(zhì)，是有效成分的結(jié)構(gòu)形態(tài)或者存在狀態(tài)，由配位反應(yīng)發(fā)生改變，從而改變了生物活性。 微量元素在配合物中發(fā)揮了重要的藥理活性及作用。人體中最豐富的微量元素就是鐵，它是肌紅蛋白和血紅蛋白的組成成分，參與體內(nèi)氧的運(yùn)輸儲存并維持生物體的正常生長發(fā)育和免疫；鋅影響著人體的免疫功能，它在生物體中發(fā)揮著清除自由基的功能，它還參與組成銅鋅 超氧化物歧化酶 （ 州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 10 是一類能夠有效清除超氧陰離子（ 由基的極其重要的抗氧化酶 (2008; 2005)。金屬酶的輔助因子最常接觸到的是銅，它參與了人體的免疫反應(yīng)過程，并有效地增強(qiáng)機(jī)體防御功能，屬于一種必不可少的微量元素 (高宏科 , 1993)。銅在機(jī)體中參與到抗氧化反應(yīng)，比如銅藍(lán)蛋白中含有的血清銅作為細(xì)胞外液的一種抗氧劑 (2008)。張振學(xué)等研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁對癌細(xì)胞并沒有殺傷力， 溶液對癌細(xì)胞具有輕微殺傷力，但蘆丁 合物的殺傷力卻很強(qiáng) (張振學(xué) ， 1996)。張企蘭等比較了十余種抗癌中藥中硒的含量，文章指出具有抗癌活性的 中藥中硒含量明顯高于其他藥物，說明微量元素硒與抗癌活性密切相關(guān) (張企蘭 ， 1995)。舒榮華等觀察到黃芩苷 非特異性免疫、紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)有很強(qiáng)的影響，結(jié)果表明，配合物的藥效強(qiáng)于原藥 (舒榮華 ， 1989)。 酮類金屬配合物研究現(xiàn)狀 黃酮類化合物是一類含有多酚類植物成分的群體，以游離態(tài)形式或者與糖結(jié)合成苷的形式存在，對我們?nèi)粘ｏ嬍成钣兄艽蟮淖饔谩?它們擁有多種的生物活性及藥理活性，例如抗病毒、抗氧化、抗炎、抗過敏、治療肝損傷以及抗腫瘤活性等我們所熟知的生理活性 (2010)。其配 合物的研究成為了近年來無機(jī)生物方向的熱點，在研究金屬離子與藥物配體的合成、結(jié)構(gòu)及相互作用后，深入研究配合物的藥理生理活性以及構(gòu)造、穩(wěn)定性、作用機(jī)理等方面有非常重要的作用。 人 研究了金屬配合物與 相互作用，并開發(fā)了桑色素的銅配合物 (2闡述了桑色素與配合物結(jié)合 機(jī)理， 發(fā)現(xiàn)它們與 結(jié)合模式不同：配合物對 嵌入結(jié)合，而桑色素對 非嵌入結(jié)合 (2002)。究了楊梅酮變異的脫氧核糖分解體系， 而且比較了三價鐵離子與助氧劑條件下的抗氧化能力： C)； 究中發(fā)現(xiàn)楊梅酮本身具有微弱的抗氧化性，但是與鐵離子螯合之后具有超強(qiáng)的抗氧化性 (2011)。微量元素鈷刺激機(jī)體生成促紅細(xì)胞生成素，加速胃腸道里鐵的吸收并善于儲存鐵，使鐵離子進(jìn)入骨髓中被利用 (2008)。韓蘋果初次使用柚皮素與金屬鈷進(jìn)行配位，初步合成并且柚皮素 系列的表征 (韓果萍 ， 2011)。 行了 槲皮素的投料及反應(yīng)過程對槲皮素 合物穩(wěn)定性的試驗研究(2005)。 柚皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)為 4,5,7眾多的生理活性，主要的活性 有 抗氧化性 ，如 清除活性氧（ 抑制單胺氧化酶生成 等 (2009)； 還可以有效地預(yù)防或治療癌癥 (2008)。 很多植物中富含柚皮素和柚皮苷(2005)， 柚皮素具有眾所周知的阻抗自由基及抗氧化的作用，抑制了脂質(zhì)的過氧蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 11 化，破壞了隨之產(chǎn)生的癌細(xì)胞來完成抗癌過程。在自然界中， 柚皮素作為有效的抗氧化劑，經(jīng)常合成新的抗氧化劑來提高自身的 抗氧化能力（ (1994)。 前人研究基礎(chǔ)之上合成了柚皮素 種配合物可以有效地清除活性氧、 基、超氧陰離子自由基，并且清除能力都強(qiáng)于原藥 (2012)。賈冬英等研究了二苯代苦味肼自由基法（ 硫代巴比妥酸法（ 三種柚皮苷 果表明，這三種配合物均能清除 由基（柚皮苷 合物 柚皮苷 合物 柚皮苷 合物）。其中，柚皮苷 合物的抗氧化活性顯著高于陽性對照組抗壞血酸 (賈冬英 ， 2005)。 上述研究表明，中藥活性成分與 金屬離子形成配合物后，有利于增強(qiáng)藥物的生理活性。將柚皮素與金屬離子制備成配合物，有望提高其抗氧化活性及生物活性。 麗隱桿線蟲的背景介紹 秀麗隱桿 線蟲 （ C. 作為分子生物學(xué)、遺傳生物學(xué)以及基因組學(xué)研究的模式生物被廣泛使用。其歸屬于線形動物門、胞管腎綱，為一種多細(xì)胞真核生物，在土壤中能自由生長，以大腸桿菌為食，遍布于世界的各個角落。小體型，簡單生長環(huán)境，使得 C. 適宜的溫度、氧氣、濕度下容易生長繁殖，所以在實驗條件下容易培養(yǎng)、繁殖和保存 ,這種特殊的優(yōu)勢是鼠類、兔類或者果蠅等模式生物不易具備(1997)。 理特征 C. 型很小，成蟲只有 。目前，在基因組中它是最小并已經(jīng)完全測序的多細(xì)胞真核生物，整體是由表皮、食管、導(dǎo)管、咽道、生殖與排泄系統(tǒng)構(gòu)成，它的基因 組均勻地分布在六條染色體上，具有基因密度高與內(nèi)含子少的特性。如 圖 3 所示。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 12 圖 3 秀麗隱桿線蟲的解剖圖 （引自丁曉霞， 2009） 從圖中我們可以觀察到 C. 位于身體最前端，雄性的泄殖系統(tǒng)和雌雄同體的肛門都 靠近身體的后側(cè)腹部。其全身呈透明狀，使用顯微鏡 可以 很清晰地觀察到由咽道和腸部瓣膜所組成的腸道系統(tǒng)。通過咽部肌肉產(chǎn)生收縮刺激線蟲進(jìn)食，在底部的球形咀嚼器粉碎食物細(xì)菌，然后把食物細(xì)菌通過咽部和腸部瓣膜送入腸道再進(jìn)行消化，通過顯微鏡觀察 C. 食是其咀嚼器的收縮進(jìn)行的。簡單結(jié)構(gòu)只有 20 個細(xì)胞，組成腸道結(jié)構(gòu)(2003)。 體壁肌肉單細(xì)胞均勻地分布排列在 C. 整個背部和腹部，并位于皮下組織下層，形成了 4 條樹狀的菱形帶子，每條帶子大約有 2 個細(xì)胞的寬并且是由 24 個肌細(xì)胞組成 ，但是左腹的帶子則是由 23 個肌細(xì)胞組成，這些肌細(xì)胞的作用是外界刺激傳遞到神經(jīng)細(xì)胞上并通過肌肉神經(jīng)突觸完成這一過程。 C. 動很簡單，是由腹肌和對應(yīng)的背肌調(diào)節(jié)收縮完成的。復(fù)雜的身體活動需要對應(yīng)的部位進(jìn)行高級協(xié)調(diào)，比如進(jìn)食、雄性線蟲交配等運(yùn)動 (2003)。 C. 雄性 （ 和雌雄同體 (分，通過顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)雄性較雌雄同體更加瘦小，見 圖 4。雄性只可以產(chǎn)生精子，必須與雌雄同體的卵子進(jìn)行受精，而雌雄同體可以自我繁衍。所以實驗室中研究利 用的為雌雄同體的 C. 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 13 圖 4 雌雄同體與雄性秀麗隱桿線蟲的形態(tài) （引自丁曉霞， 2009） of 雄同體 C. 感覺細(xì)胞位于線蟲的頭部，神經(jīng)細(xì)胞富集于咽部神經(jīng)環(huán)、腹部神經(jīng)鏈及尾部，總數(shù)達(dá) 302 個。神經(jīng)系統(tǒng)的功能主要是應(yīng)答對外界刺激環(huán)境和調(diào)節(jié)并控制線蟲的行為活動，使線蟲可以感受到外界的各種刺激。雄性比雌雄同體線 蟲多 79 個神經(jīng)細(xì)胞，這兩種性別的線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)主要區(qū)別在它們不同的性行為上。從連續(xù)的電子顯微照片清除的看出，線蟲的復(fù)原由神經(jīng)系統(tǒng)的連接性決定了，正是具有這種單純而獨特的神經(jīng)系統(tǒng)，所以將它被作為模式生物 (2003)。 C. 胚胎發(fā)育之后會隨著性別的區(qū)別逐漸體現(xiàn)出生殖部排列及尾部的不同，但它們都具有簡單管狀結(jié)構(gòu)的生殖部并進(jìn)行著生殖細(xì)胞的細(xì)胞核分裂過程的復(fù)制，在生殖口處胚胎細(xì)胞逐步成熟。特別指出的一點是，線蟲精子是類變形蟲，不具有其他生物的鞭毛結(jié)構(gòu) (2003)。雄性線蟲 的生殖部與排泄腔相連，在尾部管狀處閉合，雌雄同體線蟲由前后對稱的部分組成，這一前一后在線蟲的中部回轉(zhuǎn)并在中腹部形成生殖口處的子宮，并通過在此處的肌肉細(xì)胞的作用下進(jìn)行產(chǎn)卵，在輸卵管和子宮間的精囊中完成受精。所以雄性和雌雄同體的區(qū)別在于雌雄同體的尾部結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包括與交配相關(guān)的復(fù)雜肌肉及神經(jīng)系統(tǒng)。除此之外，線蟲體壁內(nèi)還有排泄腺、孔、管和排泄細(xì)胞組成的分泌系統(tǒng)，還有體腔的區(qū)別，雄性有 5 個，雌雄同體有 5 個，具體的功能還有待開發(fā)，目前尚不清楚(2003)。 長發(fā)育周期 在實驗室條件下，線蟲可 以很快完成生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)線蟲在 15 時，從受精卵到可以進(jìn)行繁殖需 6 天左右，在 20 時這個過程大概需要 4 天時間， 25 時這個過程不及 3蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 14 天。在 20 時，線蟲繁殖速度最快，一條未產(chǎn)卵的成蟲在 4 天的時間里大約可以產(chǎn)卵多達(dá)300 個 (2004)。在實驗室的培養(yǎng)皿上放置幾條線蟲，幾天后就能得到大量的線蟲后代。 C. 生長發(fā)育由胚胎期、幼蟲期以及成蟲期構(gòu)成。第一個過程胚胎期是由受精卵孵化并發(fā)育成 的線蟲，在這個時期內(nèi)線蟲體型很瘦小，長度大約只有 250m 左右，結(jié)構(gòu)與成蟲相似。胚胎的發(fā)育后期 包括了 個幼蟲期，最后一期的線蟲蛻皮后為成蟲。在 20 條件下， 14 個小時左右卵開始進(jìn)行孵化，在開始的幾個小時內(nèi)在雌雄同體線蟲的子宮內(nèi)進(jìn)行，卵化的線蟲分在隨后的 29、 38、 47 和 59 個小時內(nèi)連續(xù)蛻皮，只到發(fā)育成蟲。由此可以看出 C. 胚胎發(fā)育過程是連續(xù)進(jìn)行的。當(dāng)線蟲處于食物缺乏和高密度競爭等不良外界環(huán)境下，在第二次蛻皮即 后停止進(jìn)入 ，而是進(jìn)入了一個特殊時期 ，這個時期是線蟲為了抵御外界不良環(huán)境繼續(xù)生存的一種特殊手段。 C. 受精卵發(fā)育到可 以進(jìn)行產(chǎn)卵大約需要 3 天時間 (1997)。 麗隱桿線蟲與黃酮類藥物的研究進(jìn)展 黃酮類化合物作為次生植物復(fù)合物的主要亞群，它隨著結(jié)構(gòu)和空間上的改變有著不可比擬的生物多樣性 (2004)。它的廣泛生物化學(xué)功能歸因于其多酚類結(jié)構(gòu)，而且這種多酚類結(jié)構(gòu)同生物活體的健康與衰老密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)見圖 5。 圖 5 黃酮化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu) . of 過模式生物可以得到眾多信息，例如，黃酮類化合物中的槲皮素 或兒茶酚在小鼠動物實驗中已經(jīng)顯示出了延長壽命的功效 (2008; 2008; 2009; 2009)，但是高溫 (2009; 2007; 2009)或氧化應(yīng)激反應(yīng) (2007; 2009; 2009)對動物會 產(chǎn)生不利的影響。 黃酮類化合物在酵母中 可以提體現(xiàn) 延長壽命和應(yīng)激反應(yīng) 的優(yōu)勢 ， 但是通過 黑腹果蠅和小鼠的研究 中未出現(xiàn)，這也 表明 了不同物種之間 的進(jìn)化是保守的 (2011; 2007)，在這些進(jìn)化中可能會影響到生長的軌跡，尤其是經(jīng)常提到關(guān)于它們高抗氧化活性的特質(zhì) (2009; 1998)。在體外測蘭州大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 柚皮素包合物、金屬配合物的制備及生物活性研究 15 試中，構(gòu)效關(guān)系決定總抗氧化能力 （ 、三價鐵離子的還原能力 （ 的抗氧化能力 (2005)。在鄰苯二酚結(jié)構(gòu)中， B 環(huán) （ 3,4、羥基 （ 3和 C 環(huán)上雙鍵的已經(jīng)證明了是產(chǎn)生高抗氧化作用的重要先決條件 (1995; 2002)。 C. 一種重要的 模式生物，結(jié)構(gòu)簡單、身體透明、易于觀察、繁殖周期短等生物學(xué)特征賦予了其成為模式生物的前提。 曾采用 C. 油茶籽餅中提取的多聚糖進(jìn)行了考察，證明了多聚糖可以產(chǎn)生抗氧化和抗腫瘤活性 (2012)。 利用 C. 驗研 究肌肉蛋白 型的模擬修復(fù)，發(fā)現(xiàn)它是肌肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)和鈣離子釋放的最佳影響方式 (2012)。 過對四種黃酮類化合物的比較發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的酚羥基數(shù)目可以影響 C. 壽命，酚羥基數(shù)目 與線蟲壽命成正比。 C. 型可以用于黃酮類化合物抗氧化及 延壽 等生物活性方面的評價 (2012)。 提出 化學(xué)結(jié)構(gòu)為 4， 5， 7是黃酮類化合物中一個具有代表性的藥物，具有 抗 氧化性、有效地清除 制單胺氧化酶生成，有效地預(yù)防或治療癌癥等 多種 活性。 溶于甲醇，溶于乙醇、乙醚和苯等非極性有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水，同時極易被氧化， 因此盡管 有多 種藥理活性，但 溶解度差和不穩(wěn)定等 理化性質(zhì)卻 影響了柚皮素的生物利用度及臨床應(yīng)用 （郭國超， 2010） 。 一種 陰離子型高水溶性環(huán)糊精衍生物 ，通過與難溶性性藥物形成包合物可有效提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性。與 比具有毒性低、 高水溶性、緩和藥物溶血性 的優(yōu)點，常被應(yīng)用于片劑、注射劑等制劑，是一種發(fā)展?jié)摿艽蟮男滦退幱幂o料。將難溶性 備成 合物，國內(nèi)外未見報道，有望提高 溶解度、穩(wěn)定性以及生物利用度，拓展 臨床應(yīng)用。 金屬配合物可以使 藥物與金屬離子產(chǎn)生協(xié)同 作用， 可以 提高某一成分的活性 ，具有 提高藥效的潛能。黃酮類化合物的銅、鐵、鋅金屬配合物已顯示出較好的清除自由 基和抗氧化能力。盡管已有文獻(xiàn)報道柚皮素金屬配合物，具有清除自由基的功能，但是生物體內(nèi)試驗仍未見報道。因此，本課題擬進(jìn)行： 制備 合物，通過相平衡試驗闡述了包合物的形成機(jī)理，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了包合物的制備工藝。同時，為提高 藥效和生物利用度，本文自制了 種金屬配合物。 本文