密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 辣椒抗病相關(guān) 錄因子基因的分離及特性 研究 in of in 摘 要 植物在應(yīng)對(duì)外界生物與非生物脅迫過程中獲得了一系列復(fù)雜的植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制。這種由于自身進(jìn)化而獲得的防衛(wèi)機(jī)制，主要是通過植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活與轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)生作用的。植物識(shí)別病原物后 ，通過一系列信號(hào)傳遞過程，最終誘導(dǎo)相關(guān)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)。在此過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用，它通過與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，一些轉(zhuǎn)錄因子其自身也是受誘導(dǎo)調(diào)控的，改變特定的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)條件會(huì)使植物的脅迫抗性發(fā)生很大變化。 因此，轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用。特別是 單個(gè)植物防御反應(yīng)基因的超表達(dá)可增強(qiáng)植物對(duì)特定病原物的抵抗能力，而一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因的超表達(dá)能夠激活多個(gè)下游抗病基因的表達(dá)。因此，利用防御反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因來改良植物的綜合抗病性，是一條很有潛 力的分子育種途徑。 白是一種只存在于植物體的新的轉(zhuǎn)錄因子 超 家族 ，其成員廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝以及對(duì)生物或非生物脅迫的反應(yīng)，尤其是在植物抵御病原物侵害 的 抗病反應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。 本研究以 高抗辣椒品種 為材料，利用 同源克隆法在經(jīng)水楊酸誘導(dǎo)處理的辣椒葉片中分離到 6條 因 片段 ， 命名為 ， 其中 5 條為辣椒 擴(kuò)增得到的 6 條 段 中 段 長(zhǎng)度為 659有兩個(gè) 構(gòu)域 ,其它 5 條 片段 都在 150右，只檢測(cè)到一個(gè) 構(gòu) 域。通過對(duì)這 6 條 因進(jìn)行同源與進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)其中 條基因的親緣關(guān)系較近，而 其它基因同源性較低。通過將 6 條 因 的蛋白翻譯序列 與抗病相關(guān)擬南芥第三家族 員及茄科植物中已分離的 白 進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)這 6 個(gè) 基酸序列 與擬南芥第三家族的親緣性較低，而與茄科植物的 白親緣關(guān)系接近。其中 報(bào)道的抗病相關(guān)的煙草錄因子如 緣關(guān)系非常接近，因此推斷 、 4、 6 可能在植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)中有相關(guān)作用。 通過同源進(jìn)化分析，并由于已獲得的長(zhǎng) 片段 的易操作性，無論是 增中引物的設(shè)計(jì)還是雜交探針的制備都能提供更多的序列信息，因此本實(shí)驗(yàn)最終確立 后續(xù)實(shí)驗(yàn)的靶標(biāo)基因。對(duì)此基因進(jìn)行 終獲得部分 3列 ，長(zhǎng) 1265碼 290 個(gè)氨基酸 。對(duì)列翻譯后進(jìn)行分析 ，該 因的氨基酸序列分別在 N 端和 C 端各具一個(gè) 構(gòu)域 和 一個(gè) 鋅指結(jié)構(gòu)，因此可推斷該基因?qū)儆?一家族成員。 為進(jìn)一步探索該基因在不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，以便揭示該基因可能參與的防衛(wèi)信號(hào)途徑。本實(shí)驗(yàn)采用半定量 方法及 證對(duì) 因的表達(dá)模式進(jìn) 行了初步的探索。結(jié)果表明， 水楊酸及 導(dǎo)下表達(dá)量有明顯增高趨勢(shì)，在 導(dǎo)下基本不表達(dá)。說明 因可能參與 號(hào)途徑。 由于前期實(shí)驗(yàn)中已證實(shí) 因受 導(dǎo)表達(dá)，說明該基因可能參與相關(guān)的誘導(dǎo)抗性反應(yīng)，因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證 生物脅迫下的表達(dá)情況，從而揭示出其相應(yīng) 的功能活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)辣椒進(jìn)行了疫霉及線蟲侵染實(shí)驗(yàn)， 以 探究 辣椒防衛(wèi)反應(yīng)中的作用。經(jīng) 交 驗(yàn)證表明， 辣椒疫霉侵染過程中， 達(dá)無明顯變化，而接種二齡根結(jié)線蟲后，其表達(dá)量有明顯增強(qiáng)現(xiàn)象，故推 測(cè) 抗疫病 反應(yīng) 中可能無 特異應(yīng)答 作用，而在抗線蟲反應(yīng)中 可能重要 的 作用。 綜合上述研究結(jié)果， 辣椒防衛(wèi)反應(yīng)基因簇的表達(dá)調(diào)控中 可能 具 有重要的作用。辣椒是一種重要的蔬菜作物，辣椒疫病、根結(jié)線蟲等生物災(zāi)害是影響我國(guó)辣椒生產(chǎn)的主要障礙，因此， 嘗試 利用 因 在辣椒中的超表達(dá)來提高 其 綜合抗病性，將是一 種 頗具潛力的分子育種途徑， 這 對(duì)于揭示辣椒抗病作用分子機(jī)理也具有重要的作用。 關(guān)鍵詞 : 辣椒 ， 轉(zhuǎn)錄因子，基因克隆，誘導(dǎo)調(diào)控 to of to is or of of A in is of a of to to a of In a to or of of to of a of R a of of in of It is a to a of to to be in of in in or of is is CR of of in ,3,4,6 of is ,4,6 ,4. ,4 in of in we ,4,6 ,4 in we We of It 265a 90 a at we . To we A, A on it t A We is at a by in a an in to In an in of in is an in of of on it is a to by to of in is 目 錄 英文縮略表 . I 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 言 . 1 錄因子的主要結(jié)構(gòu)特征及其功能特性 . 1 構(gòu)域 . 1 盒 . 2 白與 W 盒的結(jié)合特性 . 3 因的表達(dá)活性 . 3 白的生物學(xué)功能 . 4 錄因子調(diào)控的靶標(biāo)基因 . 4 白在防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用 . 5 白在植物形態(tài)發(fā)育上的作用 . 5 束語 . 6 第二章 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) . 7 題意義 . 7 術(shù)路線 . 7 第三章 材料與方法 . 9 試材料 . 9 驗(yàn)材料 . 9 要生化試劑 . 9 驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法 . 9 A 誘導(dǎo)處理 . 9 椒疫霉接種實(shí)驗(yàn) . 10 蟲接種實(shí)驗(yàn) . 11 取 . 11 合成 . 12 片段 的回收、克隆與測(cè)序 . 13 得全長(zhǎng) . 17 物信息學(xué)分析 . 19 定量 證 . 19 交 . 21 第四章 結(jié)果與分析 . 25 基因 片段 的獲得與生物信息學(xué)分析 . 25 提取 . 25 合成及內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果 . 25 源克隆法獲得辣椒 基因 . 26 序結(jié)果與生物信息學(xué)分析 . 27 驗(yàn)克隆基因全長(zhǎng) . 31 增實(shí)驗(yàn) . 31 末端 列分析 . 31 列拼接 . 31 因在不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下表達(dá)情況分析 . 33 因在生物脅迫下表達(dá)情況分析 . 35 椒疫霉接種實(shí)驗(yàn)中 因表達(dá)情況分析 . 35 蟲接種實(shí)驗(yàn)中 因表達(dá)情況分析 . 36 第五章 討論 . 37 源克隆技術(shù)擴(kuò)增 因及進(jìn)化分析 . 37 列 導(dǎo)抗病性 . 37 植物生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)中的作用 . 38 第六章 結(jié)論 . 39 參考文獻(xiàn) . 40 附錄 . 45 致 謝 . 47 作 者 簡(jiǎn) 歷 . 48 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 英文縮略表 I 英文縮略表 英文縮寫 中文名稱 英文全稱 楊酸 莉酮酸甲酯 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 因特異引物 光密度值 R 病程相關(guān) 端快速擴(kuò)增基因全長(zhǎng)法 of 分鐘轉(zhuǎn)數(shù) 統(tǒng)獲得抗性 c 辣椒疫霉 南芥 t 煙草 鈴薯 a 辣椒 P 上游引物 P 下游引物 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 導(dǎo)言 植物在應(yīng)對(duì)外界生物與非生物脅迫過程 中獲得了一系列復(fù)雜的植物防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制 (2001)，現(xiàn)有的研究表明，這種由于自身進(jìn)化而獲得的防衛(wèi)機(jī)制，主要是通過植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活與轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)生作用的 (1998)。植物識(shí)別病原物后，通過一系列信號(hào)傳遞過程，最終誘導(dǎo)相關(guān)植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)。在此過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用，它通過與其它相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，一些轉(zhuǎn)錄因子其自身也是受誘導(dǎo)調(diào)控的，改變特定的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)條件會(huì)使植物的脅迫抗性發(fā)生很大變化 (et 2002)。例如， （ 2002）在辣椒中過表達(dá) 因而使辣椒抵抗外界病原物的能力明顯增強(qiáng)。在擬南芥中，全基因組中 5的基因用于編碼大約 1500 種轉(zhuǎn)錄因子，其中 45%的轉(zhuǎn)錄因子只存在于植物中，說明植物具有較動(dòng)物及微生物不同的自身特殊的防衛(wèi)反應(yīng)體系 (et 2000)。因此，利用植物特有的轉(zhuǎn)錄因子來改良植物的綜合抗病性，是一種高效、快捷而頗具潛力的分子育種途徑，這對(duì)于揭示植物抗病機(jī)理也具有重要的作用。 目前研究表明，與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因 子家族主要有： 白、堿性亮氨酸拉鏈蛋白（ et 2002)，其中 1994）首次從甘薯 (克隆出一個(gè)編碼 (T)(T)序列 (后被稱為 結(jié)合蛋白的 (1994)，隨后在不同植物中克隆出大 量編碼 W 盒結(jié)合蛋白的 野生燕麥(的 (et 1995) ， 皺 葉 歐 芹 （ 的,3(et 1996)，擬南芥的 et 1996)，等等。迄今為止，已報(bào)道從擬南芥、煙草、大麥、小麥、野生馬鈴薯、水稻，棉花、可可豆、甘菊、甘蔗、沙漠豆類中均分離出 因 (et 2000; et 2003; 2004; et 2004; Xu et 2004; et 2004; et 2002; et 2001; et 2002) ，其中水稻全基因組中已鑒定出大約 90 個(gè) 因 (et 2004)，擬南芥中 已分離出 74 個(gè)因 (et 2000)。對(duì) 白進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)它們都具有 一或兩個(gè)含一個(gè)列和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的約 60 個(gè)氨基酸的區(qū)域。特定的 錄因子在病原物、化學(xué)物質(zhì)及外界損傷的誘導(dǎo)條件下，會(huì)促進(jìn)其表達(dá)活性及增強(qiáng)與 合的能力。盡管 合域，但其整體的蛋白結(jié)構(gòu)卻表現(xiàn)出高度的差異性，從而分化出不同的家族，在特定的時(shí)間和空間行使不同的功能活性。 錄因子的主要結(jié)構(gòu)特征及其功能特性 構(gòu)域 構(gòu)域是由自身 N 末端具有的高度保守的 基酸序列和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)而中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 命名。已鑒定的 白都能專性的結(jié) 合 (T)(T)序列，而這種結(jié)合特定 列的功能是由 白中的 構(gòu)域行使的 (et 1999)。已被鑒定的 白的氨基酸序列中都含有一或兩個(gè) 構(gòu)域。依照它們所含 構(gòu)域的個(gè)數(shù)及鋅指結(jié)構(gòu)的特征將 白分為三類：含有兩個(gè) 構(gòu)域的 白為類，如最早被鑒定的 ；含有一個(gè) 構(gòu)域的 白為類，如 ，已被鑒定的大多數(shù) 白都屬于第 類，只含有一個(gè) 構(gòu)域；與其他已鑒定的鋅指結(jié)構(gòu)比較，第、類 構(gòu)域具有特殊的鋅指結(jié)構(gòu)類型，即 構(gòu)(CC3H)， 而另一些 白的鋅指結(jié)構(gòu)與第、類不同，其鋅指結(jié)構(gòu)為 構(gòu) (C)， 因此將之歸為第類，如煙草中分離出的 錄因子中的鋅指結(jié)構(gòu)就為 構(gòu) (2000)。值得一提的是，盡管在高等植物中，第類 白占其家族成員的 20，但在一些低等 植物如苔蘚類植物中卻不存在 (2004)。而在擬南芥中，幾乎所有的第類 白都與應(yīng)答生物脅迫反應(yīng)有關(guān) (et 2003; et 2003)，表明該類 因在陸生植物基因進(jìn)化史上處于較后的位置，這可能是植物由于環(huán)境壓力而發(fā)生的適應(yīng)性進(jìn)化。不同的是，第類 白不僅存在于高等植物，也存在于蕨類植物，而且在一些不能進(jìn)行光合作用的真核細(xì)胞中如粘液菌和單細(xì)胞原生生物中也被檢測(cè)到 (2004)，這些資料揭示出 白可能起源于十五到二十億年前未分化出植物界之前的真核細(xì)胞，且第類 白則是最初的蛋白表現(xiàn)形式。 在類 白中，它的兩個(gè) 構(gòu)域具有不同的功能活性。在甜薯 芹擬南芥 錄因子中，結(jié)合 W 盒的都是位于 C 末端的 構(gòu)域。 N 末端的 構(gòu)域的功能尚不清楚，由于 C 末端 構(gòu)域以外的區(qū)域?qū)τ谡麄€(gè) 白在結(jié)合特定 列過程中起到一個(gè)整體協(xié)調(diào)的作用，因此，推測(cè) N 端的 構(gòu)域在參與合的過程中，可能會(huì)增 強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)序列結(jié)合的親和性與識(shí)別特異性。也有認(rèn)為它可能如同鋅指結(jié)構(gòu)域的功能一樣會(huì)為蛋白與蛋白相互作用之間提供接觸面，通過與其它蛋白之間的相互作用而進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄因子與 合的效率 (et 1999)。在只含有一個(gè) 類 白，其 構(gòu)域的功能與第一家族中的 C 末端的 構(gòu)域更為相似，表明單個(gè) 構(gòu)域與 C 末端的 構(gòu)域在功能上是等價(jià)的，是行使結(jié)合 能的主要成分。 白家族成員的另一個(gè)共同點(diǎn)是 構(gòu)域?qū)?yīng)的編 碼序列中都有 1 個(gè)內(nèi)含子，且其位置高度保守 (et 2000)，存在的意義不詳，可能預(yù)示著這類轉(zhuǎn)錄因子存在轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)節(jié)。 W 盒 構(gòu)域的保守性從順式作用元件 W 盒的保守性中得到了很好的反映。這些(T)(T)序列元件包含一個(gè) 變中心 ,它對(duì)于 錄因子的結(jié)合是必不可少的。 W 盒在很多與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的抗病基因啟動(dòng)子中都存在，例如，在已被廣泛研究的 葉歐芹中 因、煙草中 因，擬南芥中 因的啟動(dòng)子中都含中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 有不 同形式的 W 盒 (et 1996; et 1999; Yu et 2001)， 錄因子通過與抗病基因啟動(dòng)子中的 W 盒結(jié)合，激活下游基因的表達(dá)，從而開啟植物的防衛(wèi)體系。通常具有功能活性的 W 盒會(huì)在啟動(dòng)子的伸長(zhǎng)區(qū)內(nèi)成簇或分散存在，以鏡像或順式排列 (2001)，這種存在方式對(duì) 錄因子與 W 盒的結(jié)合功能有增效作用。而且，一些 錄因子自身的啟動(dòng)子中也存在 W 盒，例如，在皺葉歐芹中發(fā)現(xiàn)的 因的啟動(dòng)子中就含有 3 個(gè) 置靠近，其中 回文排列，三個(gè) W 盒具有協(xié)同作用，而不是簡(jiǎn)單的疊加 (et 1999)。為了更確切地研究 W 盒在基因表達(dá)調(diào)控方面的作用， (2002)用人工合成的啟動(dòng)子，其中只含 W 盒而排除其它可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，研究對(duì)病原體及其誘發(fā)因子或創(chuàng)傷反應(yīng)的結(jié)果表明， W 盒足以介導(dǎo)防衛(wèi)和脅迫反應(yīng)，且反應(yīng)程度與 W 盒的數(shù)量及位置有關(guān)。 白與 W 盒的結(jié)合特性 之間的相互結(jié)合作用在體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)已得到多次證明。例如， (2003)利用凝膠電泳 遷移 (驗(yàn) ， 檢測(cè)從擬南芥中分離的 白與 W 盒的結(jié)合作用，結(jié)果表明， 如果 白與之結(jié)合的能力會(huì)迅速下降或完全消失，因此說明這種結(jié)合作用是高度特異的 。盡管 白總是傾向于結(jié)合 W 盒序列，但不同的 白對(duì)于其特定結(jié)合的 W 盒元件的類型及其組成具有一定差異與偏好性。依照 列方式、間距以及側(cè)翼序列的不同，各種 盒與之結(jié)合，行使特有的功能活性 (et 1999, 2000)。 白與 有可能的金屬離子是 這與 白中含有鋅指結(jié)構(gòu)是一致的，用金屬絡(luò)合劑如 1,10et 2001; et 2000)。另外， 為用堿性磷酸酶預(yù)處理強(qiáng)烈抑制這種結(jié)合，如 1999)用堿性磷酸酶處理 與 當(dāng)加入磷酸酶抑制劑后，這種結(jié)合作用又會(huì)有所恢復(fù)。 此外，一些 白還具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)會(huì)使蛋白二聚化，促進(jìn) 白與其它蛋白之間的結(jié)合，這種功能特性已在 的實(shí)驗(yàn)中得到證明，當(dāng)刪除 蛋白中的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，這些在酵母中進(jìn)行表達(dá)的 白，與其相連的報(bào)告基因的表達(dá)量將會(huì)大大降低 (et 2000)。 因的表達(dá)活性 因在植物體內(nèi)并非組成型表達(dá)，它會(huì)受外界環(huán)境的激發(fā)而誘導(dǎo)表達(dá)。大量的研究表明， et 1999; et 1999; et 2002; 2000;et 2004)、防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)分子如水楊酸及其功能類似物 (et 1999;Yu et 2001;2000)、環(huán)境脅迫如干旱 (et 2002)、低溫 (2002)、創(chuàng)傷 (et 2000;et 2004)等不同的環(huán)境條件下都能被誘 導(dǎo)表達(dá)。 因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)是快速、瞬時(shí)，具有組織特異性，在許多情況下不依賴于其它蛋白從無到有的合成。例如皺葉歐芹受真菌誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)， 15與未受誘導(dǎo)的空白對(duì)照相比，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 細(xì)胞中的 錄本已有積累， 4590間達(dá)到最大值，而后迅速下降 (et 2002)。而煙草葉片機(jī)械創(chuàng)傷 (切口 )10，與不作機(jī)械創(chuàng)傷的相比，受傷的及上層未受傷的葉片中都有 錄本 (累， 30達(dá)到最大值，然后開始下降 (et 2000)。同時(shí) ， 2001)利用抑制性扣除雜交的方法在葉片衰亡期對(duì)調(diào)控基因進(jìn)行了差異表達(dá)分析，其中在植株生長(zhǎng)六周期的葉片中 錄本增長(zhǎng)很快，到七周期其表達(dá)量基本恒定，而到八周期該 量就呈急劇下降趨勢(shì)。此外， 因的表達(dá)還具有組織特異性，已發(fā)現(xiàn)在植