密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 利用 記 與無(wú)毒基因構(gòu)建 小麥白粉菌的遺傳圖譜 A ap ap I 摘 要 本研究選 用小麥白粉菌（ 兩個(gè)菌株 及它們的雜交后代作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其無(wú)毒性進(jìn)行遺傳分析，利用 記對(duì)雜交后代進(jìn)行了分析，初步構(gòu)建了小麥白粉菌的遺傳圖譜。 1：對(duì)小麥白粉菌 交所得的 95 個(gè)后代的無(wú)毒性進(jìn)行了遺傳分析。結(jié)果表明：小麥白粉菌雜交群體對(duì)應(yīng)于抗病基因 無(wú)毒性 /毒性分離比為 1:1，表明無(wú)毒性受 1對(duì)基因控制；對(duì)應(yīng) 無(wú)毒性 /毒性呈現(xiàn) 3:1 的分離比例，表明無(wú)毒性受 2 對(duì)基因控制；對(duì)應(yīng)無(wú)毒性分離比為 15:1，表明無(wú)毒性受 3 對(duì)基因控制。其中與抗病基因 對(duì)應(yīng)的無(wú)毒性遺傳分析為首例報(bào)道。 2：在遺傳分析的基礎(chǔ)上，利用 記技術(shù)進(jìn)行親本與后代間的連鎖分析，所篩選的 208對(duì)引物中有 105 對(duì)引物組合在親本間存在差異。利用篩選出的 105 對(duì)在親本間有明顯差異的引物組合對(duì)雜交后代進(jìn)行 析， 22 對(duì)引物組合共產(chǎn)生 51 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。作圖分析表明， 在 件下， 51 個(gè)位點(diǎn)分別連鎖在 5 個(gè)連鎖群上，每個(gè)連鎖群上分別有 6 個(gè)， 5 個(gè)， 2 個(gè)， 2 個(gè)，2 個(gè) 記 位點(diǎn) ，獲得 總長(zhǎng) 125 均距離為 遺傳圖譜。由于作圖的標(biāo)記數(shù)目較少，有 34 個(gè)標(biāo)記未發(fā)現(xiàn)連鎖關(guān)系。構(gòu)建的連鎖圖有待于進(jìn)一步飽和。 本文還就小麥白粉菌無(wú)毒基因的遺傳分析， 記技術(shù)在小麥白粉菌研究中值得注意的問(wèn)題等進(jìn)行了討論。 關(guān)鍵詞 小麥白粉菌 無(wú)毒基因 遺傳分析 遺傳圖譜 he of in a 17. is by is by of is by of m2 is A 08 to NA 05 of NA 22 of to 8 7 25 cM 4 to be be so be to A is 錄 第一章 緒論 . 1 麥白粉病概況 . 1 谷類(lèi)白粉菌無(wú)毒基因的遺傳研究、分子標(biāo)記與定位 . 2 谷類(lèi)白粉菌無(wú)毒基因的遺傳研究 . 2 谷類(lèi)白粉菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記與定位 . 3 位克隆法與 記技術(shù) . 3 物致病真菌遺傳圖譜的構(gòu)建 . 5 谷類(lèi)白粉菌遺傳圖譜的構(gòu)建 . 5 它致病真菌遺傳圖譜的構(gòu)建 . 6 本研究的目的、內(nèi)容和意義 . 9 第二章 小麥白粉菌無(wú)毒基因遺傳分析 . 10 料與方法 . 10 驗(yàn)材料 . 10 驗(yàn)方法 . 10 果與分析 . 11 結(jié) . 12 第三章 小麥白粉菌遺傳圖譜的構(gòu)建 . 13 劑及儀器 . 13 劑 . 13 器設(shè)備 . 13 究方法 . 13 麥白粉菌基因組 提取 . 13 作程序 . 14 物的電泳檢測(cè) . 16 據(jù)分析 . 16 果分析 . 17 麥白粉菌基因組 提取 . 17 因組 切、連接、預(yù)擴(kuò) . 17 本菌株多態(tài)性引物篩選 . 18 代群體 析及遺傳圖譜的構(gòu)建 . 20 第四章 結(jié)論與討論 . 24 麥白粉菌無(wú)毒基因的遺傳分析 . 24 記技術(shù)在小麥白粉菌研究中值得注意的問(wèn)題 . 25 麥白粉菌基因組 取 . 25 因組 酶切及連接 . 25 丙烯酰胺凝膠電泳及銀染顯色 . 25 麥白粉菌遺傳圖譜的構(gòu)建 . 26 參考文獻(xiàn) . 27 致 謝 . 33 作者簡(jiǎn)歷 . 34 附 表 . 35 第一章 緒論 1 第一章 緒論 麥白粉病概況 小麥白粉病是由布氏白粉菌（ 起的小麥生 產(chǎn)中的主要真菌病害之一，在全世界大多數(shù)小麥產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生。 1900 年以前，歐洲就有報(bào)道 。 我國(guó) 1927 年首先發(fā)現(xiàn)于江蘇省。小麥白粉病過(guò)去主要發(fā)生在冷涼、潮濕、多雨的地區(qū)。近些年來(lái) 由于小麥生 產(chǎn)中水肥 條件及 種植密度水平的提高以及感病品種尤其是單基因抗病品種大面積推廣等原因，小麥產(chǎn)量問(wèn)步提高的同時(shí)也為白粉病的發(fā)生流行提供了良好的田間環(huán)境，導(dǎo)致小 麥白粉病的發(fā)生面積日益擴(kuò)大、危害程度也日趨嚴(yán)重。以我國(guó)為例，過(guò)去小麥白粉病主要分布在云、貴、川及沿海氣候濕潤(rùn)、肥水條件較好的地區(qū)，現(xiàn)在我國(guó)各小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。 1981 年全國(guó)小麥 白粉病大流行，發(fā)生面積達(dá) 287 萬(wàn)公頃。 1990間，因 性的喪失白粉病又連續(xù)在全國(guó)大發(fā)生，發(fā)生面積約占我國(guó)小麥種植面積的 40，造成小麥損失約 210 萬(wàn)噸（劉萬(wàn)才等， 1995）。近年來(lái)由于春季干旱，病害雖未再大流行，但年發(fā)病面積仍一直維持在 400 800 萬(wàn)公頃之間，目前仍是我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害之一。 小麥白粉病可籍氣流作高空遠(yuǎn)距離傳播，流行性強(qiáng)，分布范圍廣，危害嚴(yán)重。對(duì)該病的防治主要采用“以推廣種植抗病品種為主，化學(xué)防治和栽培防治為輔”的綜合防治措施?；瘜W(xué)防治具有立竿見(jiàn)影的效果，能在短期內(nèi)對(duì) 大面積發(fā)生的病害進(jìn)行有效的控制。但化學(xué)防治白粉病也存在著一些問(wèn)題 (劉君麗， 2002)。例如白粉菌抗藥性問(wèn)題， 1981年英國(guó)首次報(bào)道了大麥白粉菌對(duì)三唑類(lèi)藥劑的抗藥性（ T.， 1981），此時(shí)三唑類(lèi)殺菌劑在歐洲僅使用了 5年。我國(guó) 1987年 開(kāi)始對(duì)小麥白粉菌 進(jìn)行抗性監(jiān)測(cè)， 1991年 在山東發(fā)現(xiàn)三唑酮的抗 性菌，隨之在四川也有報(bào)道 （ 劉君麗等， 1999） 。此外防治白粉病的藥劑單一，苯并咪唑類(lèi)殺菌劑由于抗性問(wèn)題對(duì)小麥白粉病已失去防治作用，只有部份硫磺及復(fù)配劑在生產(chǎn)中應(yīng)用。目前用于防治小麥白粉病的藥劑主要是 甾醇生物合成抑制劑，而且 90%以上是脫甲基抑制劑的三唑類(lèi)。三唑類(lèi)殺菌劑不僅存在著抗藥性問(wèn)題而且還一直存在著藥害問(wèn)題，它所具有的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用在使用不當(dāng)時(shí)也會(huì)出現(xiàn)影響產(chǎn)量的現(xiàn)象。 培育推廣抗病品種是防治小麥白粉病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施，但由于病菌的基因重 組、變異、基因遷移、外源毒性基因的滲入 , 基因的搭載及寄主的選擇作用等對(duì)該菌群體遺傳多樣性產(chǎn)生很大的 影響。當(dāng)病菌產(chǎn)生能克服小麥抗白粉基因的毒性小 種 后，新小種便得以良好 地 哺育而迅速發(fā)展，引起生產(chǎn)品種喪失抗性，并在環(huán)境條件適合時(shí)造成病害的大流行。 小麥白粉菌的毒性進(jìn)化 是導(dǎo)致品種抗性喪失的主要原因之一，如 向齊君 , 1996),以及農(nóng)科院植保所白粉病組近年來(lái)毒性監(jiān)測(cè)結(jié)果都證實(shí)了這一點(diǎn) (段霞瑜 , 1998)。為此我們必須尋找新的途徑，獲得持久抗性的品種來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。 早在 20世紀(jì) 40年代， 因?qū)颉奔僬f(shuō)。此假說(shuō)的核心內(nèi)容是對(duì)于寄主中的每一個(gè)顯性抗性基因， 第一章 緒論 2 基因 ( 病菌的無(wú)毒基因是病原物遺傳因子， 其功能是直接或間接地編碼激發(fā)子；而植物抗病基因 (則編碼激發(fā)子的受體。當(dāng)激發(fā)子與受體結(jié)合即 與 性互作時(shí)，誘發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的表達(dá)，寄主才表現(xiàn)出抗性。其它情況下寄主均表現(xiàn)為感病。上世紀(jì) 60年代，包括大、小麥白粉病在內(nèi)的其它一些病害的基因?qū)蚧プ麝P(guān)系就已得到了闡述 (et 1959； 1960)。因此， 用小麥品種抗性來(lái)防治白粉病時(shí)，寄主特異抗性的表達(dá)不僅取決于該品種本身的抗病基因型，還取決于小麥白粉菌的無(wú)毒基 因型。研究病原菌無(wú)毒基因的結(jié)構(gòu)及功能，有助于了解病原物與植物的識(shí)別機(jī)制，對(duì)認(rèn)識(shí)植物的抗病性及病害的防治都具有重要意義。 谷類(lèi)白粉菌無(wú)毒基因的遺傳 研究 、分子標(biāo)記與定位 谷類(lèi)白粉菌無(wú)毒基因的遺傳研究 國(guó)外利用 分子遺傳學(xué)對(duì)很多大麥品種與白粉菌分離物的互作 進(jìn)行 研究 ，結(jié)果 表明 它們的互作符合基因?qū)蚧プ鞯哪Ｐ汀?994)對(duì)大麥白粉菌兩個(gè)菌株 交得到的 166 個(gè)后代菌株進(jìn)行無(wú)毒基因遺傳分析，得到對(duì) 毒性 /毒性的 分離比為 1:1，菌株的無(wú)毒性受 1 對(duì)基因控制；對(duì) 無(wú)毒性 /毒性為 3:1 的分離比例，表明菌株的無(wú)毒性受 2 對(duì)基因控制。 995)對(duì)大麥白粉菌兩個(gè)菌株 交得到的 57 個(gè)后代，以及 交得到的 140 個(gè)后代群體一同進(jìn)行了無(wú)毒基因的遺傳分析。結(jié)果表明對(duì) 無(wú)毒性 /毒性分離比為 1:1，菌株的無(wú)毒性受 1 對(duì)基因控制；而與抗病基因 應(yīng)的菌株的無(wú)毒性是由2 對(duì)基因 同控制的。 國(guó)內(nèi)向齊君等 (1995)采用卡寶品紅染色對(duì)小麥白粉菌的染色體數(shù)目進(jìn)行了研究，認(rèn)為小麥白粉菌具有 n=8 條染色體。 (2004)將獲得的大麥白粉菌的遺傳連鎖數(shù)據(jù)與我國(guó)小麥白粉菌細(xì)胞遺傳學(xué)顯微照片結(jié)合起來(lái)分析，推斷大、小麥白粉菌很有可能存在相同的染色體數(shù)，都具有n=11 條染色體。 1999 年，本小組通過(guò)室內(nèi)人工雜交，獲得了小麥白粉菌 6 個(gè)雜交組合的有性世代，并對(duì)其中的一個(gè)組合 交 后代的無(wú)毒性遺傳進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于小麥抗白粉病基因 無(wú)毒性分別由一對(duì)基 因控制， 對(duì)應(yīng)于無(wú)毒位點(diǎn)之間完全連鎖，在雜交群體中共分離；羅瓊 (2002)進(jìn)一步結(jié)合 法對(duì)這兩個(gè)菌株的 89 個(gè)后代菌株進(jìn)行了無(wú)毒基因遺傳分析 ， 發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)于抗病基因 無(wú)毒性分別由 1 對(duì)基因控制，并且對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因 重組率為 對(duì)應(yīng)于 無(wú)毒性分別由 2 對(duì)基因控制， 對(duì)應(yīng)于 對(duì)基因控制； 李志英 (2003)對(duì) 小麥白粉菌兩個(gè)菌株 交 所得的74 個(gè) 后代進(jìn)行毒性鑒定得到： 無(wú)毒性 /毒性 分離比為 1:1，符合 1 對(duì)基因控制；對(duì) 無(wú)毒性 /毒性為 3:1 的分離比例 ， 無(wú) 毒性受 2 對(duì)基因控制，對(duì)應(yīng)的 無(wú)毒性 /毒性為 15:1 的分離比例，表明受 3 對(duì)基因控制。 這種對(duì)傳統(tǒng)的“基因?qū)颉奔僬f(shuō)中一一對(duì)應(yīng)關(guān)系的偏離與國(guó)外在大麥白粉菌中的研究結(jié)果是一致的。 第一章 緒論 3 谷類(lèi)白粉菌無(wú)毒基因的分子標(biāo)記與定位 國(guó)外從 80 年代后期起，對(duì)大麥白粉菌的 行了分子標(biāo)記的研究，并取得了積極的結(jié)果。990)、 994)，先后利用 毒性無(wú)毒性構(gòu)建了 2 個(gè)遺傳圖譜，其中 連鎖圖中有 7 個(gè)無(wú)毒基因即 人用兩個(gè) 含有 8 個(gè)無(wú)毒基因 差異 的菌株雜交 ，對(duì) 獲得的 84 個(gè)后代菌株進(jìn)行 記，建立了有 11 個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)為 1205 遺傳圖譜，并推斷出白粉菌的染色體為 n=9 或 n=10，將 8 個(gè)無(wú)毒基因定位到三個(gè)連鎖群中，并獲得 2 個(gè)距 4 標(biāo)記，發(fā)現(xiàn) 距 6 得 1 個(gè)距 2 個(gè)距 為 1 標(biāo)記 （ 2002年，個(gè)人交流）， 目前他們 已完成 對(duì) 毒基因 的 克?。?2005 年，個(gè)人交流）。 990 年工作的基礎(chǔ)上，于 1994 年構(gòu)建了 庫(kù)。 2002 年， 人選用兩個(gè)含有 7 個(gè)無(wú)毒基因差異的大麥白粉菌菌株雜交，對(duì)獲得的 81 個(gè) 交后代進(jìn)行了遺傳連鎖分析，建立了具有共 34 個(gè)連鎖群、總長(zhǎng)為 2114 遺傳圖譜，定位了 7 個(gè)無(wú)毒基因即 國(guó)內(nèi)利用分子標(biāo)記對(duì)小麥白粉菌無(wú)毒基因進(jìn)行研究開(kāi)始地比較晚。段霞瑜（ 1998）首次利用記對(duì)白粉菌群體的進(jìn)化進(jìn)行了初步 地 探討，結(jié)果表明 增產(chǎn)生的多態(tài)性位點(diǎn)可以遺傳到子代中，并可產(chǎn)生重組子。這一結(jié)果為小麥白粉菌連鎖圖的產(chǎn)生和無(wú)毒基因的分離奠定了基礎(chǔ)。羅瓊 （ 2002） 在遺傳分析基礎(chǔ)上，使用 法尋找和無(wú)毒基因連鎖的 記。用隨機(jī)引物 行 析時(shí)，對(duì) 毒性親本 產(chǎn)物中有一條分 子量約為 帶，而毒性親本 擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有此帶。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn) 該標(biāo)記與無(wú)毒基因 密連鎖，遺傳圖距僅為 李志英（ 2003）在遺傳分析的基礎(chǔ)上，利用 記技術(shù)進(jìn)行白粉病菌親本與后代之間的連鎖分析。這些研究為白粉菌的基因組研究奠定了基礎(chǔ)。 位克隆法與 記技術(shù) 絕大多數(shù)病原菌無(wú)毒基因的生化性質(zhì)及功能目前尚未確定，克隆這類(lèi)無(wú)毒基因的主要途徑是通過(guò)圖位法和插入突變法。 圖位克隆 (稱(chēng)定位克隆 ( 1986年首先由劍橋大學(xué) 基本工作思路為：首先將目的基因精確定位在分子標(biāo)記連鎖圖上。利用與目的基 因緊密連鎖的標(biāo)記篩選大片段 如 并構(gòu)建含目的基因區(qū)域的精細(xì)物理圖譜， 利用該物理圖譜采用染色體步行 (方法逐步逼近目的基因。若篩選的標(biāo)記與目的基因連鎖十分緊密或共分離，無(wú)需步移就可直接著陸，獲得含目的基因的大片段克隆，再將大片段克隆作亞克隆分析或用大片段克隆作探針篩選 而將目的基因確定于 一個(gè)較小的 段上，進(jìn)一步作序列分析和目的基因功能鑒定。 用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，無(wú)需預(yù)先知道基因的 也無(wú)需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息，這一特點(diǎn)恰恰適合于小麥白粉菌基因組的研究。 第一章 緒論 4 實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記。實(shí)質(zhì)上，分子標(biāo)記是一個(gè)特異的 其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止，已 有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選。這些技術(shù)有別于最初的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記， 一般表現(xiàn)出穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，有 的使用成本也相對(duì)較低，特別適用于篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的標(biāo)記，尤其是與目標(biāo)基因共分離的標(biāo)記。 本研究所選用的分子標(biāo)記是 子標(biāo)記。 析是 人在 1994 年發(fā)明的，荷蘭 司擁有該項(xiàng)技術(shù)的專(zhuān)利。 析是 結(jié)合的一種技術(shù)。其原理是基因組 過(guò)限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識(shí)別粘性末端，互補(bǔ)連接后成為 板。接頭與接頭相鄰的酶切片段的幾個(gè)堿基序列作為 應(yīng)引物的結(jié)合位點(diǎn)。引物由三部分組成 ： (1)核心堿基序列，該堿基序列與人工接頭互補(bǔ)；（ 2）特異性酶切序列；（ 3）引物 3 了達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，專(zhuān)用引物在酶切位點(diǎn)序列的 3 數(shù)量不等的堿基，這些延伸的堿基組成是隨機(jī)的，因此，通過(guò)調(diào)整引物 3 可調(diào)節(jié) 物的特異性和數(shù)量。 基本反應(yīng)程序包括： (1)模板 制備； (2)兩個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶 對(duì) 模板行酶切 ； (3)限制性酶切片段末端連接雙鏈接頭； (4)用與接頭限制性酶切位點(diǎn)序列互補(bǔ)的引物對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增； (5)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物再次用選擇性引物擴(kuò)增； (6)擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析。 測(cè)的是分布于某種生物全基因組上的 段，它綜合了 術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有自身獨(dú)特的魅力。其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)在于： (1)理論上可產(chǎn)生無(wú)限多的 記。由于 此理論上 產(chǎn)生無(wú)限多的標(biāo)記數(shù)，并可覆蓋整個(gè)基因組。 (2)多態(tài)性高。 記具有比 記可靠、 經(jīng)濟(jì)、有效的揭示物種多態(tài)性水平的能力。每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可檢測(cè)到的 標(biāo)記數(shù)為 50，能夠在遺傳關(guān)系十分相近的材料間產(chǎn)生多態(tài)性，被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。 (3)量少，檢測(cè)效率高。 (4)可靠性好 , 重復(fù)性高。 析采用特定引物擴(kuò)增 , 退火溫度高 ,使假陽(yáng)性降低，可靠性增高。 (5)對(duì) 板質(zhì)量要求高 , 對(duì)其濃度變化不敏感。 應(yīng)對(duì)模板濃度要求不高，在濃度相差 1000 倍的范圍內(nèi)仍可得到基本一致的結(jié)果。目前， 記已廣泛應(yīng)用于 植物的 抗病基因 、病菌的無(wú)毒基因 的分子標(biāo)記、遺傳作圖及遺傳多樣性檢測(cè)等領(lǐng)域。 目前已經(jīng)克隆到植物病原真 菌的無(wú)毒基因包括：番茄葉霉菌 (的無(wú)毒基因 an et 1992)、 et 1994)、 et 1999)、et 2002b)、 et 1997)、 et 1998)、 et 2000)、 et 2000)，大麥云紋菌（ 的 et 1995)，致病疫霉菌 (的 et 1998)，稻瘟菌 (et , 2000)、 et 1998)、 et 1995)、et 1995)、 et 2004)等無(wú)毒基因，大麥白粉菌 (中的 2個(gè)無(wú)毒基因也已完成克隆。其中稻瘟菌的 麥白粉菌的 2005， 個(gè)人交流 ） 都是通過(guò)圖位法克隆的。 第一章 緒論 5 物致病真菌遺傳圖譜的構(gòu)建 最初構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)主要是利用蛋白質(zhì)或免疫學(xué)多態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記來(lái)研究這些標(biāo)記位點(diǎn)與所研究性狀之間的相互關(guān)系，從而建立標(biāo)記系統(tǒng)與性狀之間的連鎖關(guān)系。但由于已知多態(tài)性蛋白 位點(diǎn)較 少，等位基因的數(shù)目有限，無(wú)法獲得足夠的信息量，準(zhǔn)確性差和檢測(cè)技術(shù)的繁瑣等因素， 促使人們?cè)O(shè)法從 尋找可靠的標(biāo)記系統(tǒng)。用于作圖的 征稱(chēng)為 記，它至少應(yīng)具備以下幾個(gè)條件： （ 1） 任何一種構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)所使用的標(biāo)記，一個(gè)重要的屬性就是多態(tài) 性的存在。 （ 2） 信息量大，基因組內(nèi)密度大。 （ 3） 遺傳共顯性，即可以在群體中區(qū)分 3種基因型。 （ 4） 成本低，操作簡(jiǎn)便，適合作大規(guī)模的基因型分析，特別適合于自動(dòng)化分析 (趙志輝， 2005)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展先后出現(xiàn) 三種序列特征 滿足此要求 ( 2002)。一是20 世紀(jì) 70 年代中后期建立起來(lái)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (二是簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性 (它有兩種類(lèi)型：小衛(wèi)星 (微衛(wèi)星 (隨后其它標(biāo)記系統(tǒng)如擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列 (也相繼建立。這些標(biāo)記位點(diǎn)在基因組內(nèi)不但含量豐富，多態(tài)性較好，且符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律 ,因而可以為連鎖分析提供足夠多的遺傳信息。加之由于 大降低了檢測(cè)成本并提高了檢測(cè)過(guò)程的自動(dòng)化程度；三是單核苷酸多態(tài)性(這種標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用為 片技術(shù)應(yīng)用于遺傳作圖提供了基礎(chǔ)，在基因定位的 研究中就有著其它標(biāo)記系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性和潛力。 遺傳圖譜是根據(jù)遺傳重組試驗(yàn)設(shè)計(jì)的表示同一染色體 子上不同基因之間的排列順序及相對(duì)距離，這樣的一種線性圖稱(chēng)為遺傳圖譜。 遺傳圖距的單位，表示 1%的重組率。遺傳圖譜現(xiàn)已成為所研究的目標(biāo)生物傳統(tǒng)遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)研究的基 礎(chǔ)。從上世紀(jì) 80年代人們便開(kāi)始了植物致病真菌遺傳圖譜的構(gòu)建工作，經(jīng)歷了 20 多年的時(shí)間目前已有 包括小麥白粉菌在內(nèi)的 12 種植物致病真菌構(gòu)建了遺傳圖譜。 谷類(lèi)白粉菌遺傳圖譜的構(gòu)建 麥白粉病菌 (傳圖譜的構(gòu)建 大麥白粉菌的遺傳圖譜分別由英國(guó)和丹麥的兩個(gè)研究小組完成。 1990年丹麥的 步地構(gòu)建大麥白粉菌 (遺傳圖譜。共有 31個(gè) 個(gè)毒性位點(diǎn)被定位在 7個(gè)連鎖群中，其中 2個(gè)連鎖群既包括 此，在 性位點(diǎn)及大麥白粉菌自身的研究。 1994年英國(guó)的 用 大麥白粉菌基因組 構(gòu)建了大麥白粉菌 (遺傳圖譜。該圖譜有 7個(gè)連鎖群，共包括 22個(gè)位點(diǎn)。 1999年 第一屆國(guó)際白粉病研討會(huì)上公布了大麥白粉菌 (遺傳圖譜。該圖譜由 7個(gè)無(wú)毒基因、 1個(gè)交配型位點(diǎn)和 304個(gè) 第一章 緒論 6 2002年 構(gòu) 建了一個(gè)大麥白粉菌 (遺傳圖譜（個(gè)人交流）。該圖譜由 8個(gè)無(wú)毒基因與 333個(gè) 12個(gè)連鎖群 , 總長(zhǎng)為 1205 發(fā)現(xiàn) 獲得了 1個(gè)距 2 個(gè)距 2002年 建了一個(gè)內(nèi)容較豐富的大麥白粉菌 (傳圖譜。共創(chuàng)立了 34個(gè)連鎖群，其中包括 182個(gè) 168個(gè) (包含 42個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)， 99個(gè) ， 7個(gè)無(wú)毒基因， 1個(gè)交配型位點(diǎn)。在 7個(gè)無(wú)毒基因中 定位在 34號(hào)連鎖群中； 位在 29號(hào)連鎖群中； 5和 25連鎖群中。在無(wú)毒基因與分子標(biāo)記之間位于 15號(hào)連鎖群的 個(gè) 個(gè) 有利于 大麥白粉菌遺傳圖譜與其它真菌遺傳圖譜的構(gòu)建有著明顯的不同，它并不像其它真菌那 樣有一定的繼承性。兩個(gè)小組對(duì)大麥白粉菌的研究成果很不吻合。 2個(gè)連鎖群而4個(gè)連鎖群。他們的結(jié)果又不能彼此說(shuō)服對(duì)方，因此大麥白粉菌的連鎖群數(shù)至今仍無(wú)定論，隨之而來(lái)的是大麥白粉菌基因組的大小也不能得到一個(gè)定論。 麥白粉病菌 (傳圖譜的構(gòu)建 小麥白粉菌 (大麥白粉菌 (同種不同專(zhuān)化型的植物病原真菌。通過(guò)對(duì)小麥白粉菌遺傳圖譜的構(gòu)建而得出的結(jié)論可以與大麥白粉菌進(jìn)行比較基因組學(xué)的研究，并可作為探討生理專(zhuān)化現(xiàn)象的基礎(chǔ)。目前國(guó)外還未見(jiàn)構(gòu)建小麥白粉菌遺傳圖譜的報(bào)道，國(guó)內(nèi)對(duì)小麥白粉菌遺傳圖譜的研究仍處于起步階段，李志英于 2003年初步構(gòu)建了該菌的遺傳圖譜。 2003年李志英在遺傳分析的基礎(chǔ)上利用 篩選的 200對(duì)隨機(jī)引物中共有 25對(duì)引物組合在親本間存在差異。其中一對(duì)引物 連鎖，其遺傳距離為 28.2 用篩選出來(lái)的 25對(duì)引物對(duì)雜交后代進(jìn)行 3對(duì)引物組合共產(chǎn)生 39個(gè)標(biāo)記。通過(guò)作圖，將 22個(gè)位點(diǎn)分別定位在 7個(gè)連鎖群中。 它 致病 真菌遺傳圖譜的構(gòu)建 稻瘟菌 (是人們研究較深入的一種植物致病真菌， 于 1983 年便初步構(gòu)建了該菌的遺傳圖譜。隨著研究的不斷深入， 全序列也已公布 最新的 稻瘟菌 遺傳圖譜中已包括 4 個(gè) 無(wú)毒基因 位點(diǎn) 在內(nèi)的 262 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。 稻惡苗病菌 (以引起玉米惡苗病，其遺傳圖譜的構(gòu)建中除包括一些常見(jiàn)的分子標(biāo)記外也包括 身獨(dú)有的一些基因的位點(diǎn)，如 雌性不育位點(diǎn)(孢子致死位點(diǎn) (控制產(chǎn)生串珠鐮刀菌毒素的 位點(diǎn) (共計(jì) 634個(gè)位點(diǎn)。而一些特殊位點(diǎn)在遺傳圖譜中的定位有利于人們今后對(duì)其進(jìn)行克隆。 麥類(lèi)赤霉病菌 (目前為止已構(gòu)建了兩個(gè) 二者的連鎖群數(shù)相同，遺傳圖譜的長(zhǎng)度也 相似。沒(méi)有出現(xiàn)其它真菌構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)不同圖譜之間存在的連鎖群數(shù)及圖譜長(zhǎng)度存在較大差異的現(xiàn)象。因此所構(gòu)建出的遺傳圖譜具有較高的可信度。最新的遺傳圖譜中包括 35個(gè)位點(diǎn)。 致病疫霉病菌 （ 遺傳圖譜的構(gòu)建是由 完成的。繼 第一章 緒論 7 年構(gòu)建第一個(gè) 致病疫霉遺 傳圖譜后又分別于 2001 年 和 2004 年對(duì) 1997 年構(gòu)建的遺傳圖譜進(jìn)行改進(jìn)，完成了 6 個(gè)無(wú)毒基因的定位及連鎖群的重新劃分，最新的遺傳圖譜中包括 6 個(gè)無(wú)毒基因 位點(diǎn)在內(nèi)的共計(jì) 508 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn) 。 大豆疫霉病菌 (新 的遺傳圖譜是 2002 年 建立 的， 共計(jì) 386 個(gè)位點(diǎn)， 包括 10 個(gè)無(wú)毒基因 位點(diǎn) 的較為飽和的遺傳圖譜，通過(guò)該圖譜所提供的信息可以對(duì)某些無(wú)毒基因進(jìn)行圖位克隆。 萵苣霜霉病菌 (遺傳圖譜與 遺傳圖譜構(gòu)建非常相似，在圖譜中都定位了一定數(shù)量的無(wú)毒基因，并且所構(gòu)建出的遺傳圖譜內(nèi)容也非常豐富，都可以用來(lái)對(duì)無(wú)毒基因進(jìn)行克隆。 油菜黑脛病菌 (引起油菜 黑脛病，該菌的遺傳圖譜中除一般常見(jiàn)的分子標(biāo)記外還包括寄主特異性位點(diǎn) (決定病斑的形成 )。該位點(diǎn)的定位將為今后對(duì) 病過(guò)程的研究奠定基礎(chǔ)。 玉米小斑病菌 (迄今為止只構(gòu)建了一個(gè) 且該圖譜也不像其它菌的遺傳圖譜那樣飽和 ， 共有 125個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，在圖譜中仍存在一些長(zhǎng)度較大的缺口。 小麥根腐病菌 (遺傳圖譜中包含其它 菌遺傳圖譜中所沒(méi)有的位點(diǎn)，即毒性基因位點(diǎn) (該位點(diǎn)的定位有利于今后