密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 甘草 有益微生物的分離 、 鑒定 及 共接種效果初探 of of of of I 摘 要 本論文 以 內(nèi)蒙古和青海省人工栽培的烏拉爾甘草 為材料， 研究 甘草 內(nèi)生細(xì)菌 分布 的多樣性 。同時(shí) ， 還對(duì)內(nèi)蒙古栽培甘草的 根瘤菌 和 根 進(jìn)行了 分析 ， 并 對(duì) 內(nèi) 生細(xì)菌、根瘤菌、 根的 共接種 效果進(jìn)行了初步探討 ， 結(jié)果 如下： 1、 對(duì)內(nèi)蒙 古 一年生、兩年生和三年生烏拉爾甘草 、青海 兩年生 烏拉爾 甘草 健康植株根、莖、葉等組織中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了 分離和 數(shù)量測(cè)定 ，共分離出細(xì)菌 146 株。 結(jié)果表明 ，甘草根、莖、葉等組織內(nèi)存在大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的分布密度不同。 不同 地域、不同 年份甘草組織中內(nèi)生細(xì)菌分布密度也存在較大差異。 通過(guò)鏡檢觀察芽孢桿菌是分離的優(yōu)勢(shì)菌 ， 約占 30%，實(shí)驗(yàn)中還分離到了 黃單孢菌屬 ( 假單孢菌屬 ( 類芽孢桿菌屬（ 及短小桿菌屬 ( 采用 析 方法 ， 發(fā)現(xiàn) 甘草內(nèi)生細(xì)菌存在特異的擴(kuò)增條帶， 能夠分辨出不同 地區(qū) 來(lái)源、不同組織中 菌株的差異 ， 說(shuō)明 甘草 中 內(nèi)生細(xì)菌存在著豐富的多樣性。 2、 在 板上測(cè)定了 146 株內(nèi)生細(xì)菌菌株對(duì)西瓜枯萎病 菌 和煙草赤星病菌等 15 種 病原菌的體外拮抗活性。 共有 23 株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)一種或幾種病原菌具有 不同程度的 拮抗活性，其中 6株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)這些病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌活性，對(duì) 15 種病原菌的抑制半徑幾乎都達(dá)到了 7別是 黃瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌的抑制半徑都達(dá)到了 菌率達(dá)到 65%，對(duì)病原菌的擴(kuò)展具有明顯的抑制作用。 同時(shí)， 株 的 培養(yǎng)濾液 在 板上 抑制 煙草赤星病菌 和 小麥紋枯病 菌的生長(zhǎng)， 產(chǎn)生透明的抑菌圈， 這 說(shuō)明 細(xì)菌 在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生了具有抑菌活性的抗生物質(zhì)，抑制了真菌抱子的萌發(fā) 。經(jīng) 常規(guī)的生理生化鑒定、 生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定 、 16S 列 分析 ， 將 6 株 拮抗菌 分別 鑒定為萎縮芽孢桿菌 (枯草芽孢桿菌 (多粘類芽孢桿菌 ( 3、 從不同年份甘草根瘤中共得 到 54 個(gè)根瘤培養(yǎng)物 ，經(jīng)菌落形態(tài)及鏡檢發(fā)現(xiàn)這些菌具有根瘤菌屬的特征 。 采用 析方法，發(fā)現(xiàn)甘草根瘤菌存在特異的擴(kuò)增條帶，能夠分辨出從不同年 份植株上分離的根瘤菌 的差異，說(shuō)明甘草根瘤菌存在著豐富的多樣性。 在用 根瘤菌回接甘草中， 液體培養(yǎng)結(jié)瘤數(shù)多于半固體培養(yǎng)的，且根瘤較半固體培養(yǎng)的大 。對(duì)結(jié)瘤效果好的菌株進(jìn)行克隆測(cè)序， 并分析 序列 比對(duì)結(jié)果， 發(fā)現(xiàn) T)似性都為 99%， 屬于中慢生根瘤菌屬 。 4、 分離 甘草的 并用三葉草進(jìn)行 單孢繁殖 ，將繁殖后的菌根回接 甘草。 接種了菌根的甘草植株莖長(zhǎng)、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對(duì)照顯著增加，并且不同處理對(duì)植株生長(zhǎng)影響不同?？梢?jiàn)接種 將 根瘤菌、內(nèi)生細(xì)菌和菌根共接種甘草，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ， 、鉀有明 顯的促進(jìn)作用，三種微生物 接種后 ， 復(fù)合接種比單一接種處理植株 根 莖葉中氮、 磷、 鉀含量增加。這表明，甘草有益的根瘤菌和內(nèi)生細(xì)菌能增強(qiáng)菌根對(duì)植株的促生長(zhǎng)作用。 因此，應(yīng)用三種微生物共接種，對(duì)促進(jìn)甘草生長(zhǎng)，提高品質(zhì)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 關(guān)鍵詞 甘草 內(nèi)生細(xì)菌 根 瘤菌 根 共接種 on of A in go as 146 in of of on of Of 46 6 B. P. of 54 NA of CR of CR in of by to 6of 50 31 in 50 31 9% to 6S of VA by On of of of is by To 、 K 、 K . of to to 、 K VA 錄 第一章 緒論 . 1 物有益微生物的作用 . 1 物內(nèi)生細(xì)菌的作用 . 1 瘤菌的應(yīng)用 . 3 A 菌根的研究與應(yīng)用 . 4 生細(xì)菌、根瘤菌、 根在植物上的相互作用 . 5 物有益微生物研究展望 . 6 草簡(jiǎn)介 . 6 草的用途 . 6 草的栽培現(xiàn)狀 . 7 論依據(jù)和研究?jī)?nèi)容 . 8 論依據(jù) . 8 文研究的內(nèi)容和技術(shù)路線 . 9 第二章 不同地區(qū)甘草內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析 . 10 驗(yàn)材料 . 10 試甘草 . 10 離和培養(yǎng)用培養(yǎng)基 . 10 驗(yàn)方法 . 10 生細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù) . 10 生細(xì)菌多樣性分析 . 11 果與分析 . 13 同組織消毒時(shí)間的差異 . 13 同組織內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的差異 . 13 生細(xì)菌的多樣性 . 14 論 . 15 第三章 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選和鑒定 . 17 驗(yàn)材料 . 17 生細(xì)菌 . 17 原真菌 . 17 養(yǎng)基 . 18 驗(yàn)方法 . 18 生細(xì)菌體外拮抗作用測(cè)定 . 18 內(nèi)生拮抗細(xì)菌濾液對(duì)病原菌的抑制作用 . 18 生拮抗細(xì)菌的鑒定方法 . 18 果與分析 . 19 生拮抗細(xì)菌的篩選結(jié)果 . 20 試菌株的培養(yǎng)濾液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 . 21 生拮抗細(xì)菌的鑒定結(jié)果 . 21 論 . 24 第四章 甘草根瘤菌的 分離 和鑒定 . 25 驗(yàn)材料 . 25 驗(yàn)方法 . 25 瘤菌的分離與純化 . 25 析根瘤菌的多樣性 . 25 瘤 菌的回接方法 . 26 瘤菌的鑒定 . 27 果與分析 . 29 瘤菌的分離結(jié)果 . 29 果 . 29 瘤菌的回接結(jié)瘤檢測(cè)結(jié)果 . 30 瘤菌的鑒定結(jié)果 . 31 論 . 33 第五章 甘草 根的 分離 和共接種 . 34 驗(yàn)材料 . 34 驗(yàn)方法 . 35 A 菌根的分離方 法 . 35 A 菌根的繁殖方法 . 35 A 菌根的回接方法 . 35 接種方法 . 35 A 菌根效果測(cè)定方法 . 36 果與分析 . 36 A 菌根的篩選及繁殖結(jié)果 . 36 A 菌根的回接效果 . 36 接種效果 . 37 論 . 38 V 第六章 全文結(jié)論及展望 . 40 參考文獻(xiàn) . 42 附錄 1 實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基、試劑的配制以及主要儀器設(shè)備 . 48 附錄 2 實(shí)驗(yàn)圖版 . 52 附錄 3 部分菌株的 16S 列 . 54 致謝 . 58 作者簡(jiǎn)歷 . 59 文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱 中文名稱 基對(duì) 氧核糖核酸 磷酸脫氧核糖核酸 二胺四乙酸 化乙錠 g 丙基 千堿基對(duì) 鐘 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 二烷基硫酸鈉 醋酸 沖液 （羥甲基）氨基甲烷 g 克 l 升 . 腸桿菌的 微克 t 米 m 性梯度凝膠電泳 in 光原位雜交 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 物有益微生物的作用 據(jù)初步研究，在植物體 中 存在的微生物，有益的約為 15%， 有害的約為 15%，表現(xiàn)中性的為70%，但 “益 ”與 “害 ”之間并沒(méi)有絕對(duì)界限。 植物有益內(nèi)生細(xì)菌可以產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)物質(zhì)，提高植物固氮性能，促進(jìn)植物對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)平衡 ， 保證寄主植物健康生長(zhǎng)。植物根際土壤中的 根能促進(jìn)植物對(duì) P 等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和水分的吸收，增強(qiáng)植物的抗性，促進(jìn)藥用植物有效成分的合成，還能減少植物對(duì)有毒元素的吸收。根瘤菌具有固氮的功能，幫助植物吸收營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng) 。將這些微生物菌劑應(yīng)用于 生產(chǎn) ， 不僅可以增 加植物營(yíng)養(yǎng) ， 培肥地力 ， 節(jié)約生產(chǎn)成本 ， 而且對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的保護(hù)起重要作用。 植物有益微生物能單獨(dú)對(duì)植物產(chǎn)生作用，當(dāng)聯(lián)合使用時(shí)，也對(duì)植物產(chǎn)生共促進(jìn)作用。 下面 簡(jiǎn)單介紹植物內(nèi)生細(xì)菌、根瘤菌、 們 之間的相互作用。 物內(nèi)生細(xì)菌的作用 植物內(nèi)生細(xì)菌 (指能夠定殖在健康植物組織內(nèi) ， 并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物 （ 992） 。內(nèi)生 細(xì) 菌是一個(gè)生態(tài)學(xué)概念 ， 而非分類學(xué)單位。在過(guò)去的50 多年 ， 人們不斷的從植物的根 （ 005） 、莖、葉 （ 001） 和種子 （ 002;2005） 上分離并鑒定出多種微生物 。實(shí)驗(yàn)證明， 內(nèi)生細(xì)菌廣泛的存在于植物體中，現(xiàn)已 從甘蔗、牧草、水稻 （ 001;001） 、玉米、小麥、高 粱（ 002） ， 以及棕櫚樹(shù)、塊根植物 （ 004） 、甘薯、咖啡 樹(shù)（ 997）、野花（ 006）、西紅柿（ 004）、榆樹(shù)（ 003）等植物中分離到多種內(nèi)生 細(xì)菌 。 隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的次生代謝產(chǎn)物 ， 眾多內(nèi)生細(xì)菌活性成分成為新型化合物的一個(gè)重要來(lái)源和途徑，是天然藥物的重要 組成 部分 （ 003） 。 有益的內(nèi)生細(xì)菌能產(chǎn)生植物促生物質(zhì)而促進(jìn)植物生長(zhǎng) （ 001） ，促進(jìn)植物對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)，加強(qiáng)系統(tǒng)的生態(tài)平衡，還可作為潛在生防資源和外源基因載體。 近年來(lái)，隨著研究領(lǐng)域的拓寬和研究方法的不斷改進(jìn)， 以 及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物內(nèi)生細(xì)菌所發(fā)揮的重要作用已逐漸被研究者了解，并且引起植物學(xué)家、生態(tài)學(xué)家、微生物學(xué)家的極大興趣 ，已逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 目前 對(duì)內(nèi)生細(xì)菌在植物組織內(nèi)的生物學(xué)作用 機(jī)理還沒(méi)有進(jìn)行深入的研究，但在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中 許多內(nèi)生細(xì)菌已作為生物防治劑、固氮菌劑和植物促生劑廣泛應(yīng)用于溫室和大田 （ 999） 。 開(kāi)展植物內(nèi)生細(xì)菌的研究不僅對(duì)植物微生物學(xué)科的基礎(chǔ)研究有重要的理論價(jià)值，而且對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展也有重要的實(shí)踐意義。 物防治病原菌 植物內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)地分布于植物的不同組織中，有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（碳源、氮源等），同時(shí)受到植物組織的保護(hù)作用，不受外部惡劣環(huán)境如強(qiáng)烈日光、紫外線、暴風(fēng)雨等的影響而具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境，相對(duì)于腐生細(xì)菌更易于發(fā)揮生防作用（ 990）。關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子的研究很多 ， 并由此開(kāi)發(fā)出一些植物生防菌劑（ 990）。 如有的研究者 從棉花中分離篩選出抗棉花枯萎病的內(nèi)生細(xì)菌菌株 ，用此內(nèi)生細(xì)菌回接棉花 ， 可以減輕人工接種感染的棉花枯萎中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 癥（ 995）。傅正擎 （ 1999） 等 采 用棉花內(nèi)生細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物與棉花黃萎病菌共培養(yǎng)的方式，證明內(nèi)生細(xì)菌可通過(guò)促生長(zhǎng)作用來(lái)提高棉株的抗逆性， 顯示出了良好應(yīng)用潛力 。 從土豆中分離的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)輪枝菌、絲核菌、核盤霉、鏈霉菌、歐文氏菌等都有抑制作用（ 004, 002） 。 從健康柑橘植株中分離的 有抗性 (002)。 從玉米中分離的 內(nèi)生細(xì)菌還能防治玉米病害（ 2004）。 源基因載體 植物內(nèi)生細(xì)菌可作為 外源基因的載體 。將某些殺蟲(chóng)防病基因?qū)氲街参飪?nèi)生細(xì)菌中，構(gòu)建植物內(nèi)生殺蟲(chóng)或防病工程菌 ， 使植物起到與轉(zhuǎn)基因防病殺蟲(chóng)植物相同或相似的作用（何紅 ,2004） ，而植物本身的基因并未發(fā)生改變。如將蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)基因整合到從百慕大草中分 離到的木質(zhì)棍狀桿菌犬齒亞種 (染色體上，建成了工程殺蟲(chóng)細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)了對(duì)歐洲玉米螟的生物防治，減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，開(kāi)創(chuàng)了內(nèi)生細(xì)菌作為殺蟲(chóng)基因載體的先例（ 993）。劉云霞（ 1997）等用水稻體內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌巨大芽孢桿菌 ( 為受體，構(gòu)建了具有防水稻二化螟活性的工程菌 ， 2000） 等將 因轉(zhuǎn)入分離自蘋果苗的內(nèi)生細(xì)菌熒光假單胞菌 (，該帶 因的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)豆苗立枯病 (表現(xiàn)出良好的生防作用。在以內(nèi)生細(xì)菌為載體構(gòu)建殺蟲(chóng)或防病工程菌時(shí)，必須考慮內(nèi)生細(xì)菌本身對(duì)寄主植物的作用效果。若以對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的內(nèi)生細(xì)菌為載體構(gòu)建殺蟲(chóng)或防病工程菌可能更有應(yīng)用價(jià)值，對(duì)此值得進(jìn)一步研究。 將基因工程技術(shù)運(yùn)用于 內(nèi)生細(xì)菌能改善環(huán)境，在 維持 生態(tài) 平衡 方面起重要作用。有報(bào)道指出，通過(guò)基因工程改造的內(nèi)生細(xì)菌能提高植物對(duì)甲苯的抗性，減少甲苯傳播到空氣中。將這種內(nèi)生細(xì)菌導(dǎo)入植物體內(nèi)，可以通過(guò)植物提高毒素的降解，減少 毒力。 如 植物內(nèi)生細(xì)菌 菌株 可以通過(guò) 基因工程手段 將這類降解毒素的基因?qū)雰?nèi)生細(xì)菌，利用內(nèi)生細(xì)菌為保護(hù)環(huán)境做貢獻(xiàn) (005)。 生細(xì)菌的促生作用 內(nèi)生細(xì)菌的促生作用包括直接促生和間接促生。直接促生通過(guò)產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)物質(zhì)如植物生長(zhǎng)素（ 赤霉素（ 及細(xì)胞激動(dòng)素（ 而促生。如假單孢菌屬，芽孢桿菌屬等都能產(chǎn)生吲哚乙酸或赤霉素，草生歐文氏菌不僅能產(chǎn)生吲 哚乙酸，而且還能產(chǎn)生細(xì)胞分裂素，這些物質(zhì)都能有效的直接促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。從墨西哥分離到的 18株重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌都能產(chǎn)生生長(zhǎng)素，表明重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌 （ 在與植物的相互作用中不僅固氮，而且可以直接作用于植物的代謝，產(chǎn)生促生長(zhǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)（馮永君 ,2001）。從大豆中分離的內(nèi)生細(xì)菌 也 能產(chǎn)生 004）。呂澤勛 （ 2000） 等的研究表明，產(chǎn)酸克雷伯氏菌產(chǎn)生的生長(zhǎng)素對(duì)水稻植株的生長(zhǎng)和發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)內(nèi)生 細(xì) 菌也能通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng) 營(yíng)養(yǎng)和空間或直接產(chǎn)生拮抗物質(zhì)而抑制病原菌，起到間接促生作用。如分 離 自橡樹(shù)的內(nèi)生細(xì)菌，有些能夠產(chǎn)生抗生素或產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶抑制病原菌，而分離自土豆的某些內(nèi)生細(xì)菌能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制一種引起馬鈴薯環(huán)腐病的病原菌而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)（楊海蓮 ,1999）。內(nèi)生細(xì)菌也能通過(guò)幫助植物吸收 N、 從而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)（ 004）。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩 士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 物固氮作用 隨著對(duì)內(nèi)生細(xì)菌研究的不斷深入 ， 研究者感興趣的是非豆科植物內(nèi)生細(xì)菌的固氮作用 。 根瘤菌在豆科植物體內(nèi)的聯(lián)合固氮作用是眾所周知的 ， 但非豆科植物存在有固 氮菌 ， 卻是 1975年 之后， 才引起了世人關(guān)注。 在巴西和菲律賓，雖然連年不施氮肥，但甘蔗和水稻依然能獲得較高的產(chǎn)量，研究者認(rèn)為就是由于甘蔗和水稻體內(nèi)的生物固氮細(xì)菌利用植物體內(nèi)的碳源進(jìn)行代謝 ， 固定空氣中的氮?dú)?， 提高植物可利用的氮源。 現(xiàn)已 從甘蔗、牧草、禾谷類植物以及棕櫚樹(shù)、塊根植物 （ 004） 、甘薯 等非豆科植物中分離到多種具有固氮作用的內(nèi)生細(xì)菌 ， 主要有 ： 巴西固氮螺菌 (生脂固氮螺菌 (無(wú)乳固氮螺菌 (伊拉克固氮螺菌 (織片草螺菌(紅蒼白草螺菌 (重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌 (、固氮弧菌 (和伯克霍爾德氏菌 (等（ 997） ；也有研究表明，有的內(nèi)生細(xì)菌 產(chǎn)生的細(xì)菌素促進(jìn)大豆結(jié)瘤（ 006）。 與幾乎所 有植物體內(nèi)含有內(nèi)生細(xì)菌相似 ， 有可能幾乎所有植物中也含有內(nèi)生固氮細(xì)菌。 值得一提的是內(nèi)生固氮菌的共生固氮與根瘤菌的共生固氮是不同的，前者不形成特殊結(jié)構(gòu)，幾乎可以在宿主植物的各種營(yíng)養(yǎng)器官內(nèi)發(fā)揮固氮作用；而后者必須在宿主植物的特定器官上形成根瘤，才能發(fā)揮固氮作用，共生體的宿主特異性要強(qiáng)于前者 （ 馮永君 ,2001） 。 瘤菌的應(yīng)用 根瘤菌是 一類廣泛分布于 土壤中 的革蘭氏陰性菌，它 具有固氮功能， 能夠 通過(guò)與相應(yīng)豆科植物共生，引起該豆科植物根部或莖部結(jié)瘤， 將空氣中的 而 為豆科植物提供氮素 營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加植物產(chǎn)量。根瘤菌與豆科植物共生固氮體系是已知固氮能力最強(qiáng)的生物固氮體系之一，每年固