密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 棉鈴蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白和 G 蛋白亞基 基因克隆表達(dá)及其相互作用蛋白的篩選 I 摘 要 棉鈴蟲是許多國家農(nóng)業(yè)上的重要害蟲。研究表明，昆蟲的嗅覺在處理來自環(huán)境的化學(xué)信號過程中起著非常重要的作用，從而使昆蟲能夠覓食，尋找配偶、產(chǎn)卵場所、寄主和獵物，及發(fā)現(xiàn)捕食者等。昆蟲的氣味識別過程非常復(fù)雜，有多種蛋白參與。迄今為止，昆蟲的嗅覺識別機(jī)制研究取得了一些可喜的進(jìn)展，但是對整個(gè)嗅覺信號傳導(dǎo)途徑了解得非常少。清楚闡明昆蟲的嗅覺信號傳導(dǎo)會為研制高效的引誘劑或殺蟲劑提供理論依據(jù)，為有效防治棉鈴蟲提供新的思路與途徑，延緩或降低棉鈴蟲對 花抗性演化的速度。本文利用 術(shù)結(jié)合 隆了 亞基基因；采用半定量 究了 兩個(gè)基因在棉鈴蟲體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)情況；對兩個(gè)基因進(jìn)行原核表達(dá)和純化；利用酵母雙雜交技術(shù)研究已經(jīng)克隆的 否互作，并篩選與 互作用的蛋白。本研究所取得的結(jié)果如下： (1) 利用 合 術(shù)從棉鈴蟲觸角中首次克隆了 G 蛋白亞基基因，經(jīng)過索同源序列發(fā)現(xiàn)其屬于 G 蛋白 亞基的 q 家族。已被 據(jù)庫收錄，登錄號 名為 亞基相似性在 90以上。與近緣種甘藍(lán)夜蛾 與家蠶 相似性高達(dá) 與果蠅 (與線蟲 相似性高達(dá) 與 加勒比龍蝦 相似性高達(dá) (2)半定量 究表 明， 棉鈴蟲雌雄成蟲觸角中表達(dá)，在頭、胸、腹、足和翅中也有表達(dá)，并且表達(dá)量差異不顯著；此外，在喙、下顎須和下唇須中也有表達(dá)；在 卵、幼蟲、蛹和成蟲體內(nèi)也都有表達(dá)；在卵中的表達(dá)量最高，而在成蟲中的表達(dá)量最低，在幼蟲和蛹的前、中、后期的表達(dá)量差異不大 。研究表明 一種普遍存在的蛋白。棉鈴蟲 這種組織分布廣泛性，可能預(yù)示其參與細(xì)胞的多種信號傳導(dǎo)途徑。 (3) 棉鈴蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白基因序列法國人 已經(jīng)報(bào)道（ . 2003 利用特異性引物從本實(shí)驗(yàn)室棉鈴蟲觸角中克隆了一條全長 1690 列，感覺神經(jīng)元膜蛋白（ 讀框全長 1572碼 523 個(gè)氨基酸殘基，序列中有 2 個(gè)跨膜區(qū)，具有昆蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白的典型特征。 已報(bào)道的其它昆蟲的感覺神經(jīng)元蛋白的氨基酸序列有很高的相似性。半定量 究結(jié)果顯示， 棉鈴蟲中不僅在 觸角中表達(dá)，也在去掉觸角的頭、足中表達(dá)。但是在觸角中的表達(dá)量最高，在雌雄觸角中的表達(dá)量差異不顯著。在 棉鈴蟲的味覺器官如： 喙，下顎須 和下唇須中也有表達(dá)。在 卵、蛹和成蟲體內(nèi)也都有表達(dá)，在卵中表達(dá)量相對較低 。 棉鈴蟲體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)情況表明： 僅參與棉鈴蟲的嗅覺識別，而且還參與棉鈴蟲的味覺識別。 4）將棉鈴蟲 因分別亞克隆到原核表達(dá)載體 多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建原核表達(dá)載體 導(dǎo)，目的基因在大腸桿菌中成功進(jìn)行表達(dá)，但是蛋白以包涵體形式存在。對包涵體進(jìn)行溶解和重折疊后，經(jīng)過親和層析對重組蛋白進(jìn)行了初步純化。得到了比較純的 但是使用同樣的純 化方法沒有得到純的 (5) 通過構(gòu)建棉鈴蟲觸角的 庫，用克隆的 亞基做誘餌進(jìn)行酵母雙雜交篩選，得到與其相互作用的蛋白。共鑒定了 43 個(gè)陽性克隆，并且對這些克隆測序。通過 詢和分析，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)克隆與性外激素結(jié)合蛋白（ 度同源，這為 與氣味信號傳導(dǎo)提供了證據(jù)。另外，還發(fā)現(xiàn)了與 G 蛋白 亞基互作的蛋白，如， 3糖體蛋白 胞色素氧化酶亞基、細(xì)胞色素氧化酶 C 亞基、促咽側(cè)體素神經(jīng)肽前體（ 翻譯控制腫瘤蛋白(體液凝集素前肽 。這些克隆的獲得，為進(jìn)一步研究棉鈴蟲 G 蛋白 亞基在信號傳導(dǎo)中的作用奠定了基礎(chǔ)。 (6) 用酵母雙雜交系統(tǒng)研究克隆的棉鈴蟲 G 蛋白 亞基和 間是否存在互作。本試驗(yàn)沒有篩到相互作用的陽性克隆，可能是這兩個(gè)蛋白之間不能結(jié)合或結(jié)合力很弱，推測棉鈴蟲中 能與 G 蛋白其他家族的 亞基互作，有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。 綜上所述，本研究首次從棉鈴蟲觸角中克隆了 G 蛋白 亞基，在 的登錄號為 G 蛋白 亞基與 行了不同組織和階段發(fā)育轉(zhuǎn)錄水平的研究，證實(shí)克隆的 G 蛋白 亞基屬于普遍存在 的蛋白，可能參與細(xì)胞多種信號途徑的傳導(dǎo)； 時(shí)空表達(dá)情況說明其在棉鈴蟲體內(nèi)不是觸角特異性蛋白，既參與氣味識別，又參與味覺識別。酵母雙雜交的研究表明， G 蛋白 亞基能與性外激素結(jié)合蛋白作用，參與棉鈴蟲的氣味信號傳導(dǎo)。棉鈴蟲 G 蛋白 亞基和 上對棉鈴蟲 G 蛋白的研究結(jié)果，目前在國內(nèi)外均未見報(bào)道。這些成果的取得，不僅圓滿完成了國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目規(guī)定的研究任務(wù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究棉鈴蟲 G 蛋白的功能及其信號傳導(dǎo)途徑奠定了基礎(chǔ)，對今后深入開展昆蟲與寄主植物互作機(jī)理及植物抗蟲機(jī)制的研究，開辟防治新途徑具 有極為重要的理論和實(shí)踐意義。 關(guān)鍵詞 ：棉鈴蟲， G 蛋白 亞基， 因克隆， 時(shí)空表達(dá)，原核表達(dá)與純化， 酵母雙雜交，信號傳導(dǎo) is a in an in to of or is a in in is of of of of to t. In a q in by q by by q as (1) G 3/5)It to q 90%) q up , , (2) by q in at in in . no in it in in in no in a it be in IV (3) . . in 003 ( A by to in 57223 wh is it in in a . in in no in it in in 0 in (4) of by q by (5) as D/to 20, c I T2 , of of in V (5) q no of is ma y or is no is to of In G on q a in in an of in G in is no e in It on of 錄 第一章 緒 論 . 1 味結(jié)合蛋白研究進(jìn)展 . 1 蟲觸角氣味受體的研究進(jìn)展 . 2 覺神經(jīng)元膜蛋白（ 研究進(jìn)展 . 4 生化特性： . 4 分布及時(shí)空表達(dá)情況 : . 5 生理作用： . 6 蟲觸角 G 蛋白 的研究進(jìn)展 . 7 蛋白的基本結(jié)構(gòu)和種類 . 7 蛋白的調(diào)控循環(huán) . 9 蛋白 亞基 . 10 蟲 G 蛋白信號途徑的研究進(jìn)展 . 13 母雙雜交簡介 . 13 母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 . 13 母雙雜交系統(tǒng)的特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn) . 14 母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 . 15 母雙雜交系統(tǒng)的缺陷 . 16 母雙雜交系統(tǒng)的拓展 . 19 究的背景和意義 . 20 第二章 棉鈴蟲 基及 . 22 料與方法 . 22 試?yán)ハx . 22 養(yǎng)基 . 23 要試劑 . 23 器設(shè)備 . 24 驗(yàn) 技術(shù)路線 . 25 提取 . 26 合成 . 27 物的設(shè)計(jì) . 27 應(yīng) . 29 q 5應(yīng) . 29 q 3應(yīng) . 31 物的回收純化 . 32 接反應(yīng) . 33 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 . 33 化大腸桿菌 . 33 粒 小量提取 . 33 性克隆鑒定 . 34 8 序列測定 . 35 鈴蟲 G 蛋白 亞基及 時(shí) 空 表 達(dá) . 35 驗(yàn)室不同品系棉鈴蟲中腸 G 蛋白 亞基基因變異情況 . 36 蛋白 亞 基 基 因 內(nèi) 含 子 情 況 . 38 果與分析 . 38 蛋白 亞 基 基 因 克 隆 及 序 列 分 析 . 38 亞基在不同組織及各蟲期的轉(zhuǎn)錄水平 . 49 基因克隆及序列分析 . 52 鈴蟲 不同組織及各蟲期的轉(zhuǎn)錄水平 . 56 驗(yàn)室不同品系棉鈴蟲中腸 G 蛋白 亞 基 蛋 白 變 異 情 況 . 58 蛋白 亞 基 基 因 內(nèi) 含 子 情 況 . 60 論 . 61 克隆的棉鈴蟲 基 因 及 其 時(shí) 空 表 達(dá) 情 況 的 分 析 . 61 于半定量 法的探討 . 63 于 術(shù)的探討 . 64 第三章 棉鈴蟲 G及 原核表達(dá)及純化 . 65 料與方法 . 65 種和質(zhì)粒 . 65 物設(shè)計(jì) . 67 合表達(dá)載體的構(gòu)建 . 67 接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、鑒定 . 69 胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá) . 69 烯酰胺凝膠電泳分析 . 69 因的融合表達(dá) . 70 涵體的破碎和重折疊 . 70 3 2 結(jié)果與分析 . 70 蛋白 亞基和 合表達(dá)載體的構(gòu)建 . 70 丙烯酰胺凝膠電泳分析 . 72 第四章 酵母 雙雜交篩選與 用的蛋白 . 77 料與方法 . 77 料 . 77 劑 . 77 術(shù)路線 . 83 別用棉鈴蟲 建誘餌蛋白 . 84 建 庫 . 88 構(gòu)建好的誘餌蛋白篩選 庫 . 90 母共轉(zhuǎn)化法研究克隆的 間的互作 . 94 果與分析 . 95 餌蛋白的構(gòu)建 . 95 庫的構(gòu)建 . 99 棉鈴蟲 G 蛋白 亞基做誘餌蛋白篩選 庫的結(jié)果 . 100 母雙雜交研究克隆的 G 蛋白 亞基與 間的互作關(guān)系 . 103 對酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的討論 . 104 母雙雜交試驗(yàn)常見問題 . 105 一步工作計(jì)劃 . 106 第 五 章 結(jié) 論 . 107 參考文獻(xiàn) . 110 作者簡 歷 . 118 致 謝 . 119 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 嗅覺在昆蟲處理來自環(huán)境的化學(xué)信號過程中起著非常重要的作用，從而使昆蟲能夠覓食，尋找配偶、產(chǎn)卵場所、寄主和獵物，及發(fā)現(xiàn)捕食者等。蛾類信息素識別已經(jīng)成為嗅覺接受和傳導(dǎo)機(jī)制研究的模式 (et 002)。研究表明昆蟲嗅覺識別過程非常復(fù)雜，有多種蛋白參與這一過程，這些蛋白主要包括氣味結(jié)合蛋白 (981; R 2004a; 王桂榮等， 2002a)、嗅覺受體 (J 1999; et 002; B 1999)以及氣味降解酶 (E 1999; R 2004b )。氣味分子被水溶性氣味結(jié)合蛋白（ 載到氣味受體 (003)，氣味受體通過鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（ G 蛋白）把細(xì)胞表面的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部的效應(yīng)器 . 氣味識別的生化途徑如圖（圖 示： 圖 味 識 別 的 生 化 途 徑 A. 一個(gè)嗅覺感器包括 2 3 個(gè)神經(jīng)元，被 3 個(gè)支撐細(xì)胞包圍。嗅覺樹突 /