密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 蜂花粉中黃酮類化合物的檢測 及純化方法的研究 on s on I 摘 要 黃酮類成分因其具有多樣生物活性成為目前天然產(chǎn)物研究的熱點。但有關(guān)蜂花粉黃酮分離純化與檢測方面的研究國內(nèi)外未見報道，本研究在這些方面作了初步探索，首次建立了一套經(jīng)濟、安全的蜂花粉黃酮純化與檢測方法。 本研究通過三種檢測方法的比較，確定了聚酰胺 檢測波長為 360蘆丁為標準品，在 圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù) 均回收率分別為 穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性均理想，其 別為 n=3), n=3)、 n=5)。該法檢測油菜蜂花粉中總黃酮含量為 本研究采用聚酰胺對蜂花粉黃酮進行分離純化。通過靜態(tài)吸附與解吸實驗考察了聚酰胺對蜂花粉黃酮的吸附和解吸情況；通過動態(tài)吸附與解吸實驗確定了蜂花粉黃酮分離純化的操作條件。結(jié)果證明聚酰胺動態(tài)吸附量達 g 干樹脂以上，洗脫率可達 96%以上，分離純化后的產(chǎn)品蜂花粉總黃酮含量約達 20%，較原材料中蜂花粉黃酮含量提高 13 倍。 關(guān)鍵詞 ：蜂花粉，總黃酮，純化，檢測 is in of to Up to is of on or of an a of of a of of 60a of of n=3). to to to in of an to of in g 6%. of of 0%, 3 of 錄 第一章 緒論 1 1 . 1 研究目的和意義 1 1 . 2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 4 聚酰胺層析法的研究 4 花粉黃酮類化合物的研究 5 研究內(nèi)容和方法 11 預(yù)期目的 12 第二章 蜂花粉 總黃酮檢測方法的研究 13 蜂花粉總黃酮的三種不同檢測方法 14 酰胺 14 比色法 15 雙波長比色法 15 蜂花粉總黃酮不同檢測方法的比較 16 品 前處理對檢測結(jié)果的影響 16 定性的比較 16 標回收率的比較 17 密度的比較 17 聚酰胺 重現(xiàn)性試驗 17 結(jié)果與討論 18 第三章 蜂 花粉 總 黃酮 分離 純化方法的研究 25 材料與方法 25 實驗部分 29 靜態(tài)吸附及 解吸 實驗 29 動 態(tài)吸附及 解吸 實驗 30 產(chǎn)品鑒定 31 結(jié)果與討論 32 第四章 結(jié)論與展望 40 參考文獻 42 致謝 47 作者簡歷 48 V 插圖清單 圖 1黃酮 ) 6 圖 2酰胺法蘆丁標準品吸光度 18 圖 2色法蘆丁標準品吸光度 19 圖 2波長法蘆丁標準品吸光度 20 圖 2同前處理對檢測結(jié)果的影響 20 圖 3丁標準品吸光度 28 圖 3溫下聚酰胺對黃酮類化合物的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線 32 圖 3溫下黃酮類化合物質(zhì)量濃度對聚酰胺樹脂吸附性能的影響 33 圖 3溫下黃酮類化合物質(zhì)量濃度對聚酰胺樹脂吸 解 附性能的影響 33 圖 3樣量對聚酰胺吸附率的影響結(jié)果 34 圖 3液濃度對聚酰胺吸附的影響結(jié)果 35 圖 3液酸堿度對聚酰胺吸附的影響結(jié)果 35 圖 3同體積分數(shù)的乙醇與吸附量和解吸率的關(guān)系 37 圖 3同酸堿度的乙醇與解吸率的關(guān)系 37 圖 3脫劑的用量對洗脫效果的影響 38 表清單 表 2酰胺 標準品溶液濃度與吸光度的關(guān)系 18 表 2色法標準品溶液濃度與吸光度的關(guān)系 19 表 2波長法標準品溶液濃度與吸光度的關(guān)系 19 表 2酰胺法穩(wěn)定性實驗結(jié)果 21 表 2色法穩(wěn)定性實驗結(jié)果 22 表 2酰胺法測定的加樣回收率結(jié)果 22 表 2色法測定的加樣回收率結(jié)果 22 表 2酰胺法的精密度 23 表 2色法的精密度 23 表 2現(xiàn)性實驗結(jié)果 23 表 3準品溶液濃度與吸光度的關(guān)系 28 表 3態(tài)吸附實驗吸收度變化 32 表 3酰胺樹脂富集后總黃酮的純度與得率的關(guān)系 39 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 1 第一章 緒 論 究的目的和意義 花粉是植物的雄性細胞，是植物的“精子”。蜜蜂采集回巢的花粉，稱為蜂花粉。蜂花粉中除含有一般花粉的成分外，還含有蜜蜂在采集時加進去的少量花蜜和分泌物，因此蜂花粉與一般花粉的成分略有差異。其外表也不同于粉末狀的花粉粒，而是經(jīng)蜜蜂加工過的多為扁圓形的、上面帶有蜜蜂后肢嵌挾痕跡的花粉團，富含包括黃酮類物質(zhì)在內(nèi)的多種營養(yǎng)成分，是當今世界最具有使用價值的天然產(chǎn)物之一 ，在營養(yǎng)、保健、化妝品、醫(yī)療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 我國早在神農(nóng)本草經(jīng)中就有花粉的記載和應(yīng)用，并將“蒲黃”列為上品，“無毒，久服輕身，益氣力延年”。在木草綱目中記載松花即松花粉，“酒服令輕身，令人收黃 (松花粉 )和白沙糖印為餅膏，充果餅食之”，具有“潤心肺，益氣，除風(fēng)止血”之功效，在古今秘苑中，記有李商隱的詩句“借問健身何物好，無心搖落玉花黃”，玉花黃即是玉米的花粉，可見我國用花粉保健治療之早。世界許多國家的人們均在食用花粉，并贊美花粉是永葆青春和健康的源泉。蘇聯(lián)科學(xué)家調(diào)查蘇聯(lián)百歲 以上的老人發(fā)現(xiàn)，有 150位老人是以養(yǎng)蜂為業(yè)，常食蜂蜜沉渣，這些沉渣幾乎是純花粉，使之長壽。 近年來，蜂花粉的開發(fā)利用研究在國內(nèi)外已廣泛地開展，已引起人們的重視。許多國家的植物學(xué)家、營養(yǎng)學(xué)家和醫(yī)藥工作者均很關(guān)注蜂花粉的開發(fā)利用研究，各自在自己的領(lǐng)域內(nèi)進行了大量的實驗工作，取得了滿意的效果和寶貴的數(shù)據(jù)，做出高度評價。在歐美一些國家中，將花粉加工制成各種制劑，食用和藥用，歐洲稱之為“完全營養(yǎng)食品；日本的花粉研究者則認為：任何植物性的食物營養(yǎng)價值均難與花粉抗衡，并稱之為“健康美容之源”。由于花粉的神奇功效，蜂花粉的 開發(fā)利用研究風(fēng)行于世界，方興未艾。歐、美一些國家興起花粉熱，利用花粉食品，提高食品業(yè)營養(yǎng)價值。我國也利用花粉作食品添加劑和醫(yī)藥保健品，提高食品的營養(yǎng)價值和防病治病。 蜂花粉的成分相當全面、復(fù)雜。各種蜂花粉因植物來源不同，所含成分種類及含量也不同。不同季節(jié)生產(chǎn)的蜂花粉其成分及含量也有差異，但差異不大。一般蜂花粉所含營養(yǎng)成分大致是：蛋白質(zhì) 20% 25%，碳水化合物 40% 50%，脂肪 5% 10%，礦物質(zhì) 2% 30%，木質(zhì)素 10% 15%，未知物質(zhì) 10% 15%（王開發(fā)， 1993）。 蜂花粉中幾乎含有人類迄今發(fā)現(xiàn) 的所有的氨基酸，而且含量高，部分以游離形式存在，能直接被人體所吸收。一個活動量較強的成年人，每日食用 20 25花粉中所含碳水化合物，主要是葡萄糖、果糖、蔗糖、半纖維素、纖維素等。這些都是人體的主要能源，是心臟、大腦等器官活動不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。蜂花粉中類脂含量較高，平均含量 其中皂化類脂含量 非皂化類脂含量 蜂花粉中所含脂類中不飽和脂肪酸占 60% 91%，遠比一些動植物油脂中的含量高，例如豬油含不飽和脂肪酸為 菜籽 油為 不飽和脂肪酸是人體不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，具有降低血中膽固醇和甘油三酯，增強毛細血管通透性及促使動物精子形成等特殊作用。蜂花粉是天然的多種維生素濃縮物，含量高、種類全（宋心方， 2000）。浙江省醫(yī)學(xué)院胡欣等人對我國 11 個地區(qū) 14個品種 23 個樣品蜂花中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 2 粉 (100g)的抗壞血酸含量進行了分析，結(jié)果抗壞血酸含量在 圍之間，平均值為 據(jù)報道，蜂花粉中還含有膽堿和肌醇，并且含量較高。據(jù)報道，每 100有肌醇 的蜂花 粉每 10000究證明，生長素是花粉重要的營養(yǎng)成份之一（王開發(fā)， 1997），其中人生長素是 191 個氨基酸殘基組成的一條多肽鏈。生長素促進生長作用最顯著是對骨、軟骨及結(jié)締組織的影響，對代謝作用是增加肌肉對氨基酸的攝取，促進蛋白質(zhì)、 合成，并可以促進脂肪轉(zhuǎn)化，增加血中游離脂肪酸量。王開發(fā) 1991 年利用激素放射免疫測定盒測定花粉中人生長素的含量，不同種類花粉的人生長素含量相差很大，高者如蠶豆花粉達 低者如蘋果花粉僅有 生長素含量高者為蠶豆、蠟燭果、 紫云英等花粉，而含量低者有蘋果、茶、沙梨等。花粉中還含有 6種植物生長調(diào)節(jié)激素，它們是生長素、赤霉素、細胞分裂素、油菜素內(nèi)酯、乙烯和生長抑制劑，它們對生物的生長、發(fā)育起著極為重要的作用。蜂花粉中除含有鈣、磷、鉀、鈉、鎂、硫等外，還含有多種微量元素，如鐵、銅、錳、鉆、鋅、碘、硒等 20余種，其中有人體必需的 10 余種，對人體保健和生長發(fā)育有著重要意義；此外，蜂花粉中還含有多種活性酶，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)各類植物花粉中己有 80 余種酶存在，其中主要的是水解酶及轉(zhuǎn)化酶，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、果膠酶、過氧化氫酶、細胞色素、氧化酶等 。能改善細胞的氧化還原能力，激活酶的活性中心，防止細胞中酶自身的破壞，從而控制衰老及某些疾病的發(fā)生；蜂花粉中還含有豐富的有機酸，如三萜烯酸、沒食子酸、原兒茶酸、以及抗前列腺增生的主要成分環(huán)氧肟酸等。 值得一提的是 蜂花粉是由蜜蜂采集的植物花粉，而植物花粉含有種類繁多的黃酮類物質(zhì)，包括糖苷和糖苷配基以及 肉桂酸衍生物 等（ 1989； 1984）。 蜂花粉含有豐富的黃酮類化合物（劉起華 ， 1999）， 這類化合物具有抗動脈硬化、降低膽固醇、解痙和防輻射作用，是花粉中重要的營養(yǎng)成份之一，而且含量豐 富。 在蜂花粉諸多成份之中，黃酮類物質(zhì)和他們的生物學(xué)活性已成為研究熱點，目的是為了以此建立蜂花粉的質(zhì)量參數(shù)（ J. 2001），并評估他們的營養(yǎng)和生物學(xué)的特征 （ 1993； 2003）。 目前從花粉中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有 :黃酮醇、槲皮酮、山奈酚、楊梅黃酮、木犀黃素、異鼠李素、原花青素、二氫山奈酚、柚 (苷 )配基、芹菜 (苷 )配基等（ 王開發(fā)， 1999）。 任玉翠等（ 1990）對 12 種花粉（ 100g)進行分析，得出油菜蜂花粉黃酮苷含量最高 瓜最低 同的花粉總黃酮含量差異很大，高者達 9%，低者為 其中含總黃酮豐富的花粉為：板栗、茶花、蠶豆、飛龍掌血、紫云英、蕓芥、胡桃等。在復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程中，黃酮類化合物的自身氧化而使其具有較強的抗氧化性，黃酮類化合物對于羥基自由基有較好的消除作用而能延緩人體衰老（董世林， 1994）。黃酮類化合物的生理作用具有多樣性及其保健作用（丁利君， 2002），使花粉越來越受到人們的青睞。早在 20世紀 90年代，德國聯(lián)邦衛(wèi)生局已將花粉列為藥品。 蜂花粉的治療特性使它被廣泛應(yīng)用 ， 因此蜂花粉 提取物被用于慢性的前列腺炎 ， 應(yīng)為其具有 抗炎和抗 雄激素作用（ 2002， 2003）。 因為蘆丁（槲皮素糖甙）是花粉黃酮中最豐富的成份，所以蜂花粉可以減少毛細血管的脆性（ P. 1998）。 蜂花粉中眾多生物活性物質(zhì)的存在，對加強人體的代謝與物質(zhì)的合成，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，對生長與發(fā)育，對維持多種生理器官功能，有著重要的調(diào)節(jié)作用和廣泛的醫(yī)療效能。蜂花粉具有延緩衰老的作用，主要是作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，促使下丘腦和各種垂體增強活動能力，延長活力時間。老年人服用蜂花粉，可刺激 下丘腦的神經(jīng)元，有利于本己疲勞或功能出現(xiàn)衰退的神經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 3 組織得到恢復(fù)，從而減緩了衰老進度。國內(nèi)外專家通過大量研究證實，蜂花粉有改善精神狀態(tài)和提高精力、體力的作用?；ǚ蹖δX的作用，主要是為腦細胞的發(fā)育提供了豐富的特有營養(yǎng)物質(zhì)，增強了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能和平衡調(diào)節(jié)，使大腦和機體保持旺盛的活力。蜂花粉具有提高免疫能力和抗癌作用，食用蜂花粉，能刺激胸腺分泌量增大，提高 就大大提高了機體的免疫能力，從而預(yù)防各種疾病特別是腫瘤的發(fā)生?；ǚ圻€能夠提高人體血清免疫球蛋白 到促進巨噬細胞的 吞噬作用，增強了抵御細菌、病毒的能力，還具有中和毒素的功能。蜂花粉是前列腺疾病的克星。瑞典醫(yī)生首次采用蜂花粉治療前列腺炎，如今，日本、德國等好多國家均采用蜂花粉治療前列腺疾病，我國流行最廣的治療前列腺病特效藥“前列康”，其主要成分就是蜂花粉。蜂花粉對治療貧血有特效，蜂花粉有利促使受創(chuàng)的骨髓盡快恢復(fù)功能，能加快造血組織的修復(fù)和血細胞的新生，對保證造血功能的正常運轉(zhuǎn)發(fā)揮著積極的良好作用。蜂花粉對肝臟細胞有良好的保護作用。蜂花粉富含維生素 增強毛細血管強度，防治毛細血管通透性障礙、腦溢血、視網(wǎng) 膜出血、高血壓、靜脈曲張等均有良好的效果。食用蜂花粉不但能增加食欲，而且能促進消化系統(tǒng)對食物的消化吸收，還起到增強消化系統(tǒng)功能的作用。蜂花粉的有效成分可使皮膚直接吸收，它能改善皮膚營養(yǎng)狀態(tài)，促進皮膚的新陳代謝，防止皮膚干燥脫屑，增加了皮膚的彈性，從而有利消除皺紋，延緩衰老和皺裂。除以上作用外，蜂花粉對婦女更年期綜合癥和月經(jīng)不調(diào)有奇效，也是妊娠婦女的最佳天然營養(yǎng)食品，并可能有效地預(yù)防感冒，尤其對流感預(yù)防效果更佳。 在人們回歸自然，追求綠色健康的生活觀念的指導(dǎo)下，具有生物活性的天然產(chǎn)物逐漸受到人們的青睞與厚愛。 運用現(xiàn)代化的科學(xué)技術(shù)手段對天然活性成分進行分離、純化、結(jié)構(gòu)的鑒定、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，是天然產(chǎn)物在新世紀研究發(fā)展的趨勢，而具有生物活性的黃酮研究則是其中的一個重要的組成部分?，F(xiàn)在方興未艾的天然植物黃酮的研究與開發(fā)促進了蜂花粉的綜合開發(fā)利用。天然植物黃酮產(chǎn)業(yè)正經(jīng)歷著由局部走向全部，其應(yīng)用也從輔助型的食品添加劑向作為防治心腦血管疾病的新型藥物的方向轉(zhuǎn)變。與銀杏黃酮相比，花粉黃酮的開發(fā)利用顯然更具優(yōu)勢，因為銀杏葉黃酮的開發(fā)利用與其創(chuàng)造的經(jīng)濟效益均已接近飽和，這為花粉黃酮的開發(fā)和應(yīng)用提供了一個很好的契機。 進行蜂 花粉黃酮提取研究的三大理由： 與已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的銀杏黃酮、大豆異黃酮相比，油菜蜂花粉中的黃酮含量更高， 我國蜂花粉年產(chǎn)量約 3000 噸 , 蜂花粉是可再生資源，采集蜂花粉不會對生態(tài)環(huán)境造成破壞。因此對花粉中的黃酮類物質(zhì)進行提取分離和應(yīng)用研究將具有較高的經(jīng)濟價值。 蜂花粉黃酮提取物的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價值體現(xiàn)在以下幾個方面：首先，花粉黃酮是一種優(yōu)良的保健食品功能因子，其作為醫(yī)藥中間體極具市場潛力；此外，花粉黃酮還可作為天然食品抗氧化劑、天然植物飼料添加劑、生物殺蟲劑等，并可廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)。 我國年產(chǎn)蜂花粉超過 3000 噸 ，大部分以原料花粉粗加工的方式進入市場，產(chǎn)品附加值低，市場占有率低。進行蜂花粉的深加工，對其功效成分進行分離、提取和富集，以提高其產(chǎn)品附加值是當今的趨勢，也是 蜂花粉產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必由之路，通過蜂花粉深加工產(chǎn)品的不斷面世，可刺激市場需求，擴大市場份額，帶動蜂花粉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，以促進養(yǎng)蜂業(yè)的持續(xù)發(fā)展，從而使數(shù)以萬計的人從蜂花粉等蜂產(chǎn)品中獲取利潤，改善生活水平。我國具有豐富的蜜粉源植物資源，很多蜜粉源植物分布在老、少、邊、窮地區(qū)，在當?shù)亻_發(fā)蜂產(chǎn)業(yè)可以直接起到脫貧致富的作用。此外，中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 4 蜜粉源植物可持續(xù)利用，無需特別投入，在 涵養(yǎng)水土、保護生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著特殊的作用，因此，蜂花粉黃酮的開發(fā)和利用具有極為重要的經(jīng)濟和社會意義。 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 蜂花粉中的黃酮類物質(zhì) 是植物生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，是花粉中重要的生理活性物質(zhì)，包括十幾種糖苷及配糖體， 具有良好的保健、藥用功效，但是蜂花粉黃酮的研究還處于相當滯后的狀態(tài)，對于花粉黃酮的檢測有為數(shù)不多的報道，但蜂花粉總黃酮的檢測方法并無統(tǒng)一標準。此外，對于蜂花粉黃酮的提取、精制工藝的研究更是少之又少，在國內(nèi)外基本上為空白。聚酰胺柱層析對各種黃酮類化合物有較好的分離效果，可用于分 離各種類型的黃酮類化合物，廣泛應(yīng)用于石油化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護等領(lǐng)域，資料顯示，聚酰胺柱層析對各種黃酮類化合物有較好的分離效果，可用于分離各種類型的黃酮類化合物，包括苷及苷元、查耳酮與二氫黃酮等。鄒淑仙 (2001)采用聚酰胺柱色譜從膿瘡草提取物中分離出六種黃酮類化合物。李勇軍等（ 2000）采用硅膠和聚酰胺柱層析進行分離，從頭花寥中分離出了槲皮素、槲皮苷、陸地棉苷、槲皮素 怡紅 (1999)采用改性聚酰胺層析柱分離了銀杏黃酮，但未見將聚酰胺柱層析法用于分離純化蜂花粉黃酮的報道。 聚酰胺層析法的研究 1. 吸附原理： 固體內(nèi)部分子所受的力是對稱的，故彼此處于平衡。但在界面上的分子同時受到不相等的兩相分子的作用力，因此界面分子的力場是不飽和的，即存在一種固體的表面里，它能從外面吸附分子、原子或離子，并在吸附劑表面附近形成多分子層或單分子層。我們把從流動相 (氣體或液體 )濃縮到固體表面從而達到分離的過程稱為吸附作用。固體吸附劑自溶液中吸附規(guī)律比較復(fù)雜，主要是由于溶液中除了溶質(zhì)之外還有溶劑，因此至少要考慮三種作用力 :即在界面層上于溶質(zhì)之間的作用力；固體與溶劑之間的作用力以及在溶液中溶質(zhì)與溶 劑之間的作用力。在達到吸附平衡后，其吸附量不僅受吸附劑的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、形狀、顆粒大小、孔隙的影響，而且于溶液中溶質(zhì)的性質(zhì)、濃度、固液兩相重量比以及溶劑本身和液相中存在的各有關(guān)成分和相互作用強弱有關(guān)，并對吸附過程的具體條件如 也有直接影響。解吸是吸附的逆過程，影響吸附過程的因素也會影響解吸過程。吸附樹脂對分子的吸附作用力只要改變體系的親水疏水平衡條件，改變吸附劑與吸附質(zhì)之間的分子引力，改變介質(zhì)的介電常數(shù)，范德華力就會根本改變，原來的吸附就會崩解，吸附質(zhì)由吸附劑進入溶劑，成為解吸或脫附的過程。對解吸的要求是吸 附質(zhì)與解吸劑的親和力大于吸附劑的親合力。吸附飽和后的樹脂應(yīng)選用最能溶解吸附質(zhì)的溶劑進行解吸。選用溶解黃酮效果最好溶劑作解吸劑，最好是水溶性低沸點極性有機溶劑，使解吸劑易于蒸餾濃縮回收，解吸后殘留在樹脂內(nèi)部的解吸劑容易被水帶出，并且所選解吸劑分子應(yīng)足夠小，易于進入樹脂內(nèi)部，進行解吸，樹脂吸附黃酮后，一般用乙醇、甲醇等低沸點的有機溶劑解吸。此法用于除去黃酮類化合物中的水溶性雜質(zhì)。當含黃酮的溶液通過樹脂時，黃酮類化合物被吸附在樹脂上，而其它水溶性雜質(zhì)可用水洗除。然后用不同濃度的甲醇或乙醇將黃酮化合物洗脫下來。從大 體積的稀水溶液中收集黃中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 5 酮類化合物采用樹脂法是很適宜的。 樹脂吸附法的關(guān)鍵在于所用樹脂與花粉黃酮成分有較強的親合力，而又可用洗脫劑選擇性地洗脫。此外還有要求樹脂易再生，能反復(fù)使用，穩(wěn)定性好，二次污染小。在實際應(yīng)用中，適合的吸附樹脂不僅具有較大的吸附量和解吸附率，還要有較快的吸附速度。 2. 聚酰胺 是通過酰胺基聚合而成的一類高分子化合物，分子中含有豐富的酰胺基。其對物質(zhì)的分離是建立在氫鍵吸附的基礎(chǔ)上，通過其酰胺羥基與黃酮類化合物分子上的酚羥基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用（北京醫(yī)學(xué)院， 1983）。特點是吸附容量較 高，分辨能力也較強 (， 1970)。其吸附強度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。溶劑分子與聚酰胺或黃酮化合物形成氫鍵締合的能力越強，則聚酰胺對黃酮類酚性物的吸附作用將越弱。 聚酰胺對黃酮類化合物分離效果的好壞除與所選用的洗脫體系有關(guān)外，還取決于所用聚酰胺的顆粒大小。顆粒愈小，分離效果愈佳，但顆粒太小又會大大降低分離速度。 3. 柱層析分離技術(shù) 柱層析是常用的現(xiàn)代化分離手段，廣泛應(yīng)用于石油化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護等領(lǐng)域，其填料的不同 可分離純化高分子化合物和蛋白質(zhì)、多糖、多肽以及小分子化合物，利用物質(zhì)中的各組分在不同的物相體系中表現(xiàn)出的吸附、溶解、親合作用等熱力學(xué)和動力學(xué)性質(zhì)的差異，通過吸附層析分離技術(shù)是當前植物化學(xué)應(yīng)用最為廣泛的分離提純方法。 粉黃酮類化合物的研究 蜂花粉是由蜜蜂采集的植物花粉，在蜜蜂生長發(fā)育階段用來喂養(yǎng)蜜蜂幼蟲的。植物花粉含有種類繁多的黃酮類物質(zhì)，包括糖苷和糖苷配基以及肉桂酸衍生物等。黃酮類化合物大部分是以糖苷的形式存在，是一個糖分子的一個或多個羥基通過在半縮醛 鍵與一個非糖分子連接，非糖的部分稱為糖苷配基，在體內(nèi)通過葡萄糖苷酶的作用而產(chǎn)生，是一類具有抗氧化、抗腫瘤、抗過敏、抗炎癥等多種生物活性的多酚類化合物。在蜂花粉諸多成份之中，黃酮類物質(zhì)和他們的生物學(xué)活性已成為研究熱點，目的是為了以此建立蜂花粉的質(zhì)量參數(shù)，并評估他們的營養(yǎng)和生物學(xué)的特征。 1. 花粉黃酮的成分、結(jié)構(gòu)和含量的研究 黃酮類化合物是以黃酮 ( 2圖 1為母核，黃酮母核上連有羥基、甲氧基、氫氧基等取代基，是植物經(jīng)過光合作用產(chǎn)生的，按結(jié)構(gòu)可分為黃酮類 ( 、黃烷醇類( 、異黃酮類 (、二氫黃酮類 (、二氫黃酮醇類 (橙酮類(、黃烷酮類 (、花色素類 ( ，查耳酮類 (、色原酮( ?；ǚ壑悬S酮類化合物是其重要的營養(yǎng)成份之一，而且含量豐富。目前從花粉中發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有 :黃酮醇、槲皮酮、山奈酚、楊梅黃酮、木犀黃素、異鼠李素、原花青素、二氫山奈酚、柚 (苷 )配基、芹菜 (苷 )配基等。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 6 圖 1 2黃酮 ) 早報導(dǎo)從花粉提取出類黃酮，以后日本的久道周次和德國的威爾曼 (都先后報導(dǎo)對多種花粉含黃酮類檢測的結(jié)果（王開發(fā)， 1999）。 黃烷醇類（ 植物花粉中普遍存在，并被證實在花粉發(fā)芽和花粉管生長中具有重要的生理學(xué)的功能。 研究表明新西蘭和葡萄牙的蜂花粉中含有罕見的草質(zhì)素糖苷， . 1996）發(fā)現(xiàn)了新的黃酮醇苷。他們從 歐毛（ 粉中發(fā)現(xiàn)了 737從荊豆（ 粉中發(fā)現(xiàn)了 838從野蘿卜（ 粉中發(fā)現(xiàn)了 888這些成 分被證實在花粉發(fā)芽和花粉管生長中具有重要的生理學(xué)的功能。 通過 究了新西蘭的罌粟花粉，證實其含有黃酮醇和類胡蘿卜素成分，并認為黃酮類物質(zhì)對花粉的功效起了重要的作用。 2002）研究了桃金娘科（ 粉，發(fā)現(xiàn)其不但含有豐富的黃酮苷配基（ 還有常見的黃酮糖苷（ 有獨特的 3， 4， 5， 5， 7此外還發(fā)現(xiàn)的微量的黃酮醇雙糖苷 （ 這些糖苷對花粉的生物活性起了顯著地作用。 2001）對 11 個西班牙蜂花粉樣品中的多酚、黃酮和游離黃酮苷元化合物進行檢測。通過反相 度洗脫共分離出 15 個成分，在 15 種化合物中鑒別出 13 種，分三大類：（ 1）安息香酸衍生物（ 3,4 二羥基苯甲酸，原兒茶酸， 4羥基苯甲酸乙酯，香蘭酸，丁香酸；（ 2）羥基肉桂酸（ 對香豆酸，正香豆酸，反肉桂酸；（ 3）黃酮醇和黃酮（ 蘆丁、槲皮素、莰非醇、楊 梅酮、異鼠李素。最主要的成分是黃酮苷元（大多數(shù)是黃酮醇）。 82%的樣品存在至少 14 種酚類化合物，主要以蘆丁、槲皮素、楊梅酮和反式肉桂酸為主。用分光光度法以蘆丁為標樣測定黃酮含量大于 00g。 i （ 2004）分析了西班牙不同的養(yǎng)蜂區(qū)域收集的五個樣品，用帶有二極管陣列和 測器的 定了花青素成分。鑒別出八種花青素，最主要的是矮牽牛配基 還有飛燕草苷元（ ,花青素（ 矮牽牛配基 ,芍藥色素（ 錦葵苷元 花青素 6” 6 研究表明收集區(qū)域之間的地理差異可引起花青素含量的微小變化。 花粉中黃酮類是不低的，一般達 g/100g。我國早在 1983 年由湖南中藥研究所從長苞香蒲花粉 中分離出異鼠李素、槲皮素、異鼠李 粉中蘆丁含量比較豐富，如蕎麥花粉 17 g/100g、榛樹花為 25 g/100g 等。槲皮素、山柰酚、異鼠李素在多種花粉中均有報道。特別是對郁金香等花粉的研究十分深入，已鑒定出 6中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 7 種黃酮醇類化合物。任玉翠等（ 1990）對 12 種花粉（ 100g)進行分析，得出油菜蜂花粉黃酮苷含量最高 瓜最低 同的花粉總黃酮含量差異很大，高者達 9%，低者為 其中含總黃酮豐富的花粉為：板栗、茶花、蠶豆、飛龍掌血、 紫云英、蕓芥、胡桃等。劉嘉寶（ 2001）鑒定出云南松花粉的黃酮類化合物成分主要為黃酮和黃酮醇類，其次是二氫黃酮醇類，另外還有少量黃烷醇類的花青素。 2. 花粉黃酮測定方法的研究 黃酮是蜂花粉中重要的功效組分，也是保健食品中的有效成分。由于蜂花粉黃酮類化合物的種類多，黃酮苷含量的準確測定比較困難，目前還沒有完全統(tǒng)一的標準。國內(nèi)外學(xué)者對黃酮類物質(zhì)的定量分析方法較多，有比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜 膠束毛細管電泳法 (高效液相色譜法（ 高效液相色 譜 膠束毛細管電泳法 (定結(jié)果比較準確、分離效果好，各有自己的優(yōu)點，但是儀器設(shè)備昂貴，所以很難被普遍采用。在花粉黃酮的檢測方法中，以比色法、紫外分光光度法和 研究較多。 （ 1）比色法 比色法 是在堿性溶液中加 35用顏色和含量關(guān)系進行比色測定的方法。這是早期常用的方法，由于此法設(shè)備廉價，操作簡單，現(xiàn)在國內(nèi)有許多文獻報道的仍然采用此法。如：梁惠花等（ 2003）以蘆丁為對照物，測定油菜蜂花粉中總黃酮含量為 (，平均回收率為 n=6)。魏永生等（ 2004）以蘆丁為對照物，測定出總黃酮平均含量為 王開發(fā)等（ 2004）測定馬來西亞的油棕（ 粉油棕黃酮類含量為 100g。 比色法用于組成單一的標準對照物時，結(jié)果準確，但當應(yīng)用于組成復(fù)雜的植物試樣時，比如花粉黃酮提取液，由于受到花色素、鞣酸及其它酚性成分等多種物質(zhì)的干擾，而且底液常常出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，因此測定結(jié)果明顯偏高，而且測定結(jié)果重現(xiàn)性不好。為克服底液強 吸收帶來的干擾，研究人員對傳統(tǒng)的比色法進行了改進，陳鄭鑌（ 2004）在使用傳統(tǒng)的硝酸鋁顯色法時先用聚酰胺對樣液進行吸附，以減少非黃酮類物質(zhì)的顯色干擾。鄭敏燕（ 2004）采用雙波長分光光度法，使用 510 測定波長， 584 參比波長，采用比色法測定油菜蜂花粉中的總黃酮平均含量為3. 22%，平均回收率 98. 2% , 1. 23% ( n= 5)，由于扣除了底液混濁等背景干擾，取得了滿意的實驗結(jié)果。 （ 2）紫外分光光度法 紫外分光光度法 是利用黃酮類化合物在紫外區(qū)有較強吸收，采用適當?shù)膶φ掌?進行總黃酮的測定。 2001）以蘆丁為標樣測定西班牙蜂花粉中黃酮含量大于 00g。為了消除一些水溶性大的強極性物質(zhì)的干擾，將樣品用聚酰胺進行了分離提純，再采用紫外分光光度法測定，此為聚酰胺 嘉寶（ 2001）以黃芩苷為標樣，波長為 278聚酰胺 果表明破壁云南松花粉中總黃酮含量達到 51000g。此法優(yōu)化了單純的紫外分光光度法，提高了測定結(jié)果的準確性。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 8 （ 3）高效液相色譜法 一種方法是采 用樣品直接進樣，梯度洗脫，高效液相色譜分析，測定樣品所含黃酮苷類成分。魏永生等（ 2004）以槲皮素、山奈酚、異鼠李素為對照品，采用 ，測定出青海油菜蜂花粉中黃酮類化合物平均含量為 由于黃酮苷種類多，不可能一次分離，而且很多都沒有標準對照物可對照，很難定量。 另一種方法是通過測定水解苷元含量來計算黃酮苷的量。此法是 20 世紀 90 人提出的，其測定原理是 :蜂花粉黃酮主要成分是以黃酮苷形式存在，經(jīng)酸水解后生成黃酮醇類化合物，其主要是槲皮素、異鼠李素和 山奈酚三種組分。用 離測定這三種苷元的含量，再用計算方式轉(zhuǎn)換成相應(yīng) :蜂花粉黃酮苷的含量。鄭敏燕（ 2004）將黃酮提取物中的黃酮苷水解為黃酮苷元后，利用 測定其中槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量，結(jié)果表明，青海油菜蜂花粉中槲皮素、山奈酚、異鼠李素的平均含量分別為 、 、換算成總黃酮含量為 雖然測定的仍然是近似值，但該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，結(jié)果比較準確。不過由于水解方法、測定波長、計算方法不同所得結(jié)果也有差異。 M G（ 1997）和 F（ 1989）研究證實；每一種花粉都有自己獨特的黃酮類或酚的 線，可以通過 譜與標準花粉的 譜進行比較檢測出來。花粉中黃酮和其它酚類在種類和含量上的差異，可以導(dǎo)致作為抗氧化劑或清除自由基效果的不同。 3. 花粉黃酮提取方法的研究 文獻中有很多關(guān)于黃酮類化合物提取方法的研究，如水提法（僅限于黃酮苷類物質(zhì)）；堿性水或堿性稀醇提取法，其原理是將具有酚羥基的黃酮類物質(zhì)用堿水或堿性稀醇浸出，經(jīng)酸化后得出黃酮類物質(zhì)；有機溶劑提取法，這是國內(nèi)外使用最廣泛的方法。有機溶劑主 要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等。此方法主要用于提取脂溶性基團占優(yōu)勢的黃酮類物質(zhì)，對設(shè)備要求簡單，產(chǎn)品得率高，但成本較高，雜質(zhì)含量也較高。常見的可以分為三種方法 :冷浸法、滲漉法、回流法。王蘭珍等（ 1997）人用 70%乙醇冷浸從元寶楓葉粉中提取黃酮類物質(zhì)，提取率和黃酮含量都很高，提取物易于濃縮和干燥；李苑等（ 1999）以 50%或 60%乙醇按 16:1（ V/M）的比例，用滲漉法提取陳皮苷等黃酮類物質(zhì)效果最佳；用回流法從水飛薊中提取水薊賓，其純度比較高（陳毓莖，1997）。微波法：其原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒 次超高頻率的快速震動，使物料內(nèi)分子間相互碰撞、擠壓，有利于藥材有效成分的浸出。此法對黃酮類物質(zhì)的提取也取得了不錯的效果，具有反應(yīng)高效性和強選擇性等特點，操作簡單、副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高及產(chǎn)物易提純等優(yōu)點。范志剛等（ 2000）人用微波法提取雪蓮中黃酮類物質(zhì)，提高了雪蓮的利用率。酶解法：一般用于黃酮類物質(zhì)被細胞壁包圍不易提取的物料。其原理是能夠充分破壞以纖維素為主的細胞壁結(jié)構(gòu)及其細胞間相連的果膠，使植物中的果膠完全能夠分解成小分子物質(zhì)，減小提取的傳質(zhì)阻力，使物料中的黃酮類物質(zhì)能夠充分地釋放出來。王曉等（ 2002）人用復(fù)合酶提取山楂葉中黃酮類物質(zhì)，提取率比常用的方法提高了 2%超臨界萃取法：超臨界 取技術(shù)是以 溶劑進行提取的，是一種不同于傳統(tǒng)黃酮類物質(zhì)提取的新工藝，它的提取率與提取溫度、提取壓力、 其它工藝相比較，該技術(shù)具有提取率高、無殘留溶劑、無污染，活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞的特點。同時，還可以通過控制臨界溫度和壓力達到選擇性提取和分離純化的目的。缺點是超臨界提取所需設(shè)備價格昂貴、生產(chǎn)成本高、提取物中烷基酚含量較中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 9 高、對極性大的物質(zhì)提取不理想。目前還難以進行 規(guī)模化生產(chǎn)，但本法在生產(chǎn)銀杏黃酮的技術(shù)上取得了重大突破（王欣， 2000），中科院生態(tài)環(huán)境研究中心同相關(guān)單位合作，用此法提取銀杏黃酮獲得成功，得到黃綠色精提物，收率 含黃酮類 35%以上（駱祥峰， 2000）。陳從貴等（ 2002）研究探討超臨界 出溶劑浸提與超臨界相結(jié)合的生產(chǎn)工藝，既可降低生產(chǎn)成本，保證產(chǎn)品質(zhì)量，又可大幅度降低設(shè)備造價，為超臨界液體萃取技術(shù)的應(yīng)用創(chuàng)造條件。 在已查到的國內(nèi)外文獻中花粉黃酮的提取方法只涉及到了醇提法。如魏永生等（ 2004）采用正 交試驗設(shè)計研究了青海油菜蜂花粉中黃酮類化合物的最佳提取條件，即選用 95%的乙醇作為溶劑以 10 倍總量的乙醇用量，水浴熱回流提取。鄭敏燕（ 2004）以 95%乙醇為溶劑，采用索氏提取器提取青海產(chǎn)油菜蜂花粉中的黃酮類化合物。 4. 黃酮類化合物分離純化的研究 黃酮類化合物的分離純化方法很多，有柱層析、薄層層析、鉛鹽沉淀、硼酸絡(luò)合、梯度萃取、溶劑萃取以及近年來應(yīng)用的高效液相色譜、液滴逆流層析、氣相層析、微乳薄層色譜等。柱層析法：李文魁等（ 1996）以甲醇 聚酰胺層析柱法對各種黃酮苷類進行分離，取得了 很好的效果，而且層析量大，適合制備性分離 ; 個黃酮和黃酮苷， 人已用此法分離出具有抗血小板活性的黃酮單苷（張睿，2003），李教社等（