密級 論文編號 中國農業(yè)科學院 學位論文 褐飛虱體內類酵母共生菌的營養(yǎng)功能 及其分子基礎的研究 I 摘 要 本文主要是針對褐飛虱 其體內類酵母共生菌營養(yǎng)相互關系研究中存在的若干問題進行研究，進一步詳盡解讀二者的共生關系。 利用本實驗室研制出的稻飛虱全純人工飼料飼喂技術，研究和建立缺菌稻飛虱的獲 取與保持技術；在此基礎上，采用人工飼料生測技術、現(xiàn)代儀器分析技術和蛋白質（酶）等研究手段，比較缺菌褐飛虱與正常褐飛虱的不同，初步分析與類酵母共生菌關系密切的營養(yǎng)物質相關代謝酶的基因，探討類酵母共生菌與褐飛虱在氨基酸方面的營養(yǎng)供求關系。同時對類酵母共生菌在褐飛虱卵期的分布和其體外培養(yǎng)進行了研究，其 主要結果如下： 1. 褐飛虱類酵母共生菌從母體進入卵后的發(fā)展情況 褐飛虱卵期的石蠟切片結果可知：在卵的初期（ 1）類酵母共生菌主要以菌胞的形式存在，而且隨著胚動過程由卵的后端移至前端，再移回卵后端，此過程中菌胞大小變化 不大；隨著卵的發(fā)育，菌胞開始逐漸變大，到 5 天時已經開始向左右延伸，不再是規(guī)則的圓球狀，菌的數(shù)量開始有明顯的增多，到 時菌胞在蟲體的上腹部已經明顯分為左右兩部分，共生菌在蟲體腹部逐漸散開；到初孵 1 齡若蟲時，共生菌幾乎遍布蟲體的整個腹部腹面，腹部背面也可見少數(shù)菌體。 2 齡初期可清晰的看到共生菌在腹部的每個腹節(jié)中又聚集呈一個個小菌胞。 每個類酵母共生菌個體都有明顯的細胞壁包被，細胞壁的外圍又有明顯的界限使之與外界隔開，并且菌群周圍和菌體之間多以一種小泡狀細胞包圍。同時，在電鏡下發(fā)現(xiàn)一種棒狀物，總是與 密 相鄰，并發(fā)生部分交叉，周圍也多以小泡狀細胞圍繞，推測二者之間可能存在某種緊密聯(lián)系。另外，并不是所有的 聚集在一起，少數(shù)菌體游離在 群之外單獨存在，表明褐飛虱體內 群沒有蚜蟲體內含菌體外層的完整被膜保護層。 2. 褐飛虱減菌技術 通過對同齡試蟲的不同高溫處理和對不同齡期試蟲的相同高溫處理得出：要想得到理想的高溫減菌試蟲，需要綜合考慮處理溫度，處理時間，試蟲蟲齡，實驗季節(jié)等多種因素。適合本地區(qū)（浙江杭州）的處理方法為：選用 35 溫對低齡若蟲連續(xù)處理 3 天。同時發(fā)現(xiàn)，試蟲體內的共生菌數(shù)量多少與 褐飛虱能否羽化密切相關，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)推測出試蟲羽化所需最低共生菌數(shù)量要 5000 /重。 人工飼料中添加一定劑量的一種或兩種抗生素的減菌效果雖不是很理想，但抗生素在一定程度上有利于保持高溫處理試蟲的缺菌特性 。 3. 類酵母共生菌與氨基酸營養(yǎng)的關系 利用全純人工飼料飼喂技術，研究了各種氨基酸對缺菌褐飛虱生長和共生菌數(shù)的影響以及蟲體氨基酸分析和主要轉氨酶的活性變化等幾個方面： （ 1） 缺失不同氨基酸對高溫 (35C)處理后的缺菌褐飛虱相對生長率、體內共生菌數(shù)量有不同 度的影響，其中 10 種必需氨基酸對缺菌褐飛虱生 長的影響明顯大于 10 種非必需氨基酸， 飼料中必需氨基酸的缺少對褐飛虱（特別是高溫處理褐飛虱）體內共生菌數(shù)量有一定的刺激作用。 （ 2） 分析了缺菌試蟲體內氨基酸組成的變化，發(fā)現(xiàn)在攝取氨基酸營養(yǎng)相同的條件下（用全純飼料 養(yǎng)），高溫處理試蟲體內蛋白質氨基酸組成無明顯變化，而游離氨基酸總量明顯上升，且必需氨基酸所占比例顯著下降， 其中組氨酸（ 異亮氨酸（ 亮氨酸（ 賴氨酸（ 蛋氨酸（ 苯丙氨酸（ 摩爾百分含量均顯著下降，表明必需氨基酸的相對缺乏可能是體內蛋白質合成受阻的一個 重要原因，推測這可能是由于試蟲體內共生菌數(shù)減少致使所合成的必需氨基酸減少而引起 。 同時，人工飼料中 缺失試驗中試蟲的氨基酸分析進一步表明多數(shù)必需氨基酸與共生菌存在緊密聯(lián)系。 （ 3） 處理試蟲體內谷氨酰胺合成酶（ 谷丙轉氨酶（ 性明顯提高，谷草轉氨酶 (性顯著降低，結合谷氨酰胺（ 著上升，推測類酵母共生菌可能利用谷氨酰胺為“原料”進行氨基酸的合成。 （ 4） 采用簡并 法從類酵母共生菌基因組中擴增出與 成代謝過程中的關鍵酶 異丙基蘋果酸合成酶和 成過程中的起始酶 成酶高度相關的基因片斷，初步判斷類酵母共生菌的基因組中含有這兩個代謝酶的相關基因序列。 4. 類酵母共生菌的體外培養(yǎng) 通過正交試驗設計，參考多種真菌培養(yǎng)基的組成成分和濃度配制了三批培養(yǎng)基對褐飛虱類酵母共生菌進行體外培養(yǎng)。結果得到一種形態(tài)與褐飛虱體內的 其相近的酵母樣菌，但通過18分片斷的相似性比較得出，二者的相似率小于 95。 根據(jù)微生物分類上的一般標準，初步判斷：所培養(yǎng)出的酵母樣菌體不是來自于褐飛虱體內的類酵母共生菌。 關鍵詞： 褐飛虱，類酵母共生菌，高溫，氨基酸，體外培養(yǎng) t in It is to On of be as to PH on LS be so it to to LS PH be on At LS in PH LS in as 1. LS in of LS LS in of to of go to LS in to in LS .5 to of in PH LS of to to in of LS an a of or LS of LS LS LS LS a LS 2. of of PH be by to 5 36 by of LS in LS in LS PH in it to or in to It LS on It 000mg PH to of or in to LS PH so as it to IV by 3. LS of to PH of PH on 1) PH by 35C) on 0 of of PH of PH LS in on 2) in PH on no on in of of of of of an on of PH on eu he 3) of LS as to 4) by CR LS it LS of 4. LS in 0 of to LS in a LS of 8LS 5%, LS in V 目 錄 摘 要 . I . 一章 文獻綜述：同翅目昆蟲體內共生菌的研究進展 . 1 生菌的基本特性 . 1 蟲體內共生菌的基本特征 . 1 飛虱體內類酵母共生菌的基本特征 . 3 蟲與共生菌營養(yǎng)關系的研究途徑 . 6 養(yǎng)生物學途徑 . 6 子生物學途徑 . 6 生菌對宿主昆蟲的營養(yǎng)作用 . 6 素營養(yǎng)的合成 . 6 與脂類物質的合成 . 9 生素的合成 . 10 供能源 . 11 主對共生菌的調控 . 11 主蚜蟲對共生菌控制的機制 . 11 主稻飛虱對共生菌控制的機制 . 12 束語 . 12 第二章 論 文研究目的、意義和技術路線 . 14 研究的目的和意義 . 14 技術路線 . 15 第三章 類酵母共生菌在褐飛虱卵期 的分布 . 16 料與方法 . 16 試材料 . 16 驗方法 . 16 果與分析 . 17 論 . 23 第四章 褐飛虱高溫減菌技術的研究 . 24 料與方法 . 24 料 . 24 法 . 24 果與分析 . 25 同溫度處理下試蟲及其體內共生菌數(shù)的變化 . 25 35高溫對不同齡期試蟲及其體內共生菌數(shù)的影響 . 27 溫處理對不同季節(jié)試蟲共生菌影響的差異 . 29 003 年 7份田間溫度變化及各代褐飛虱初羽化成蟲體內共生菌數(shù)的變化 . 30 論 . 32 第五章 褐飛虱類酵母共生菌的抗生素減菌技術 . 34 料與方法 . 34 試昆蟲及飼養(yǎng)方法 . 34 同抗生素對褐飛虱體內共生菌數(shù)及宿主昆蟲的影響 . 34 生素對經高溫處理后試蟲的影響 . 34 據(jù)分析 . 35 果與分析 . 35 生素對試蟲及其體內類酵母共生菌數(shù)的影響 . 35 抗生素對高溫處理試蟲的減菌效果 . 38 論 . 39 第六章 人工飼料中氨基酸缺失對褐飛虱及體內共生菌的影響 . 40 料與方法 . 40 試昆蟲及其處理 . 40 飛虱相對生長速度的測定 . 40 飛虱體內共生菌的觀察 . 40 據(jù)分析 . 40 果與分析 . 41 工飼料飼養(yǎng)試蟲體內共生菌的數(shù)量變化動態(tài) . 41 蟲相對生長速度的變化 . 42 蟲體內類酵母共生菌數(shù)量的變化 . 45 論 . 47 第七章 高溫處理對褐飛虱體內氨基酸組成及氨基代謝酶的影響 . 48 料與方法 . 48 試昆蟲及其處理 . 48 飛虱體內氨基酸含量的測定 . 48 生素對試蟲體內游離氨基酸組成的影響 . 49 飛虱體內主要氨基轉移酶活性測定 . 49 據(jù)分析 . 49 果與分析 . 49 組分飼料上褐飛虱試蟲體內氨基酸含量的比較 . 49 失 工飼料上試蟲體內氨基酸的變化 . 54 失 工飼料上試蟲體內游離氨基酸的變化 . 57 抗生素處理試蟲體內游離氨基酸的變化 . 60 飛虱體內 氨酶活性的變化 . 62 論 . 63 第八章 氨基酸代謝過程中相關酶的基因片斷克隆 . 66 料與方法 . 67 酵母共生菌的分離和基因組提取 . 67 成酶基因片斷的引物設計 . 68 斷擴增 . 68 物回收 . 68 收產物 載體連接 . 69 化大腸桿菌 . 69 粒 小量提取（堿裂解法） . 69 源片段插入的檢測 . 70 列測定 . 70 果與分析 . 70 成過程中關鍵酶的 果 . 70 成過程中起始酶的 果 . 71 論 . 73 第九章 類酵母共生菌體外培養(yǎng)的初步研究 . 74 料與方法 . 74 種來源 . 74 養(yǎng)基配制 . 74 外培養(yǎng)物的鑒定 . 76 果與分析 . 76 論 . 78 第十章 結 論 . 82 參考文獻 . 86 附錄 . 97 致 謝 . 102 作者簡歷 . 103 中國農業(yè)科學院博士論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述：同翅目昆蟲體內共生菌的研究進展 同翅目昆蟲體內普遍存在共生菌。由于此類昆蟲以吸食植物的汁液為食，而植物汁液的營養(yǎng)很不均衡，一般認為昆蟲體內的共生菌與昆蟲的營養(yǎng)需求有密切關系，主要是為宿主昆蟲提供必需氨基酸、維生素，以及固醇類物質（ 1980； ， 1984； 1985； 1999； 傅強等， 2001c； ， 2003） 。人為地減少蟲體內共生菌的數(shù)量，會導致宿主昆蟲生長發(fā)育延遲、存活率和羽化率降低、羽化后成蟲體重減輕、產卵量下降等不良反應（ 1979； ， 1981b；戴華國等， 1997；傅強等， 2001；呂仲賢等，2001）。 鑒于此類昆蟲在農業(yè)上的重要性，昆蟲體內共生物的研究具有很大的理論意義和潛在的利用價值。深入研究共生菌與宿主昆蟲的共生關系，可以闡明 昆蟲生息繁衍的本質，揭示昆蟲與共生菌的協(xié)同進化機制， 同時有望通過人為調控共生菌與宿主昆蟲的共生關系或對 內共生菌進行基因改造， 開拓害蟲防治的新途徑。 目前，有關同翅目昆蟲體內共生菌的研究 主要集中 在蚜蟲和飛虱，下面就兩種昆蟲體內共生菌的基本特性和營養(yǎng)功能等方面進行介紹。 生菌的基本 特性 昆蟲體內的共生菌主要分為三類：細菌、立克次氏體和酵母（ 1949）。已知蚜蟲和飛虱體內與營養(yǎng)有關的共生菌類型不同，蚜蟲體內共生菌屬于細菌類，而飛虱共生菌屬于真菌類。下文將對兩種共生菌的基本特征分別進行介紹。 蟲體內共生菌的基本特征 態(tài)特征及胞內共生現(xiàn)象 蚜蟲體內的菌胞共 生細菌 蚜蟲體內的主要共生菌：菌體球形或卵球形、平均直徑 米（ ， 2002）、細胞壁 ， 1995）、縊裂生殖（ ， 1980）。 昆蟲胞內共生現(xiàn)象的主要特征為： 1）微生物生活在寄主細胞內，且被局限在一個細胞的細胞質內，該細胞稱為含菌細胞（ 簡稱菌胞。 2）微生物一般通過 二均裂的方式進行繁殖， 并通過昆蟲母系傳遞在昆蟲代間垂直傳遞（ 1980）。 3）這種共生關系對昆蟲及其微生物伙伴都是必不可少的（ 1988）。 在位置 同翅目昆蟲的共生菌，除了在短期的卵巢感染階段外，很少在含菌細胞以外發(fā)現(xiàn)（ 980） 。少量進入血腔的細菌會被吞噬細胞吞噬或破壞（ ， 1973； 1971） 。在所有蚜蟲體內， 在于蚜蟲血腔的含菌細胞中，含菌細胞在蚜蟲體腔中的兩葉狀結構被稱中國農業(yè)科學院博士論文 第一章 文獻綜述 2 為含菌體（ ， 1987， 1988， 1989）。若蚜體內的含菌體被一薄層扁平的細胞形成的保護套保護，進入大齡若蟲或成蚜后，保護層破裂，菌胞分散在整個腹腔（ ， 1987； 1990