納米銀在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及其生物學(xué)特性研究,奚廷斐中國(guó)藥品生物制品檢定所,2,一、納米銀在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用二、納米銀生物學(xué)特性的研究,3,納米銀材料具有很穩(wěn)定的物理化學(xué)性能,在電學(xué)、光學(xué)和催化等眾多方面具有比普通銀更優(yōu)異的性能,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于陶瓷材料、環(huán)保材料和涂料等許多領(lǐng)域。,一、納米銀在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,4,銀離子具有很強(qiáng)的殺菌性,在所有金屬中其殺菌活性名列第二(汞名列第一,但有毒副作用、現(xiàn)已不用)。多年來(lái)的研究表明,銀離子對(duì)12種革蘭氏陰性菌、8種革蘭氏陽(yáng)性菌、6種霉菌均有強(qiáng)烈的殺滅作用。但近年來(lái)的研究表明，納米銀顆粒的抗菌性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)的銀離子殺菌劑,如硝酸銀和磺胺嘧啶銀，具有更好的殺菌效果。所以納米銀在醫(yī)學(xué)上也得到了廣泛應(yīng)用。,5,2004年以來(lái)，已有89種含納米銀的醫(yī)療產(chǎn)品取得了我國(guó)各級(jí)食品藥品監(jiān)督管理局的注冊(cè)批件，進(jìn)入臨床應(yīng)用。,6,7,含納米銀醫(yī)療產(chǎn)品種類,1、納米銀抗菌敷料納米銀創(chuàng)可貼、燒燙傷貼、潰瘍貼等2、納米銀抗菌導(dǎo)管超滑抗菌導(dǎo)尿管3、納米銀抗菌器械抗菌手術(shù)刀、手術(shù)鉗、手術(shù)鑷、手術(shù)針等,8,4、納米銀婦科用品納米銀婦用抗菌器、納米銀抗菌洗液、納米銀婦用抗菌栓、納米銀婦用抗菌凝膠等5、納米銀計(jì)劃生育用品納米銀避孕套、納米銀宮內(nèi)節(jié)育器等6、其它納米銀骨水泥、納米銀外用抗菌噴霧器、納米銀口腔抗菌沖洗器等,9,長(zhǎng)春市科新生化藥械研究所深圳市清華源興納米醫(yī)藥科技有限公司湖南湘佳醫(yī)用器材有限公司深圳市源興納米醫(yī)藥科技有限公司沈陽(yáng)得康醫(yī)藥科技有限公司武漢名實(shí)生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司河南英泰醫(yī)療科技有限公司內(nèi)蒙古東銀科技有限公司內(nèi)蒙古國(guó)創(chuàng)高科生物醫(yī)學(xué)工程有限公司南京希科納米醫(yī)藥技術(shù)有限公司,國(guó)內(nèi)生產(chǎn)納米銀醫(yī)療產(chǎn)品的公司,10,泰州艾力特生物科技有限公司長(zhǎng)春吉大高科技股份有限公司湛江新同德制藥有限公司桂林天和藥業(yè)股份有限公司貴州榮發(fā)制藥有限責(zé)任公司貴州佳宜醫(yī)藥科技有限公司貴州紅躍藥業(yè)有限公司廣東同德藥業(yè)有限公司福州康爾威醫(yī)療器械有限公司吉林邦安寶醫(yī)用設(shè)備有限公司深圳市愛杰特醫(yī)藥科技有限公司,11,二、納米銀生物學(xué)特性研究,12,2003年以來(lái)，已有很多研究報(bào)告了納米材料具有特殊的生物學(xué)性質(zhì)：（1）從生物體整體而言，納米材料在生物體內(nèi)的分布途徑及靶器官具有特殊性（2）從細(xì)胞水平來(lái)講，與常規(guī)材料不同，納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)一些方式直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變甚至喪失，影響細(xì)胞的正常工作。,13,納米材料這些生物學(xué)特性可能會(huì)導(dǎo)致生物負(fù)效應(yīng)。（1）納米材料在生物體內(nèi)的分布途徑及靶器官具有特殊性，可以分布和蓄積在常規(guī)材料無(wú)法到達(dá)的靶器官。所以，其毒性發(fā)生的部位、引起的毒性反應(yīng)、造成的病理變化和毒性作用機(jī)理與常規(guī)材料有明顯差異。（2）納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)各種方式直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變甚至喪失，影響細(xì)胞的正常功能。,14,所以，即使化學(xué)結(jié)構(gòu)完全相同，但只要一個(gè)物質(zhì)的尺度達(dá)到納米級(jí)，也要把該物質(zhì)作為一種新物質(zhì)，采用更加適合納米材料的技術(shù)和手段，對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。,15,但是，對(duì)于納米銀這種已進(jìn)入臨床使用的納米醫(yī)用材料來(lái)講，它是否具有上述生物學(xué)特性、如果有是否造成生物負(fù)效應(yīng)了？對(duì)于這些問(wèn)題的答案還不了解。,16,因此以納米銀顆粒為研究對(duì)象，對(duì)它的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。（1）模擬臨床給藥方式，考察納米銀在體內(nèi)的吸收、分布、蓄積、代謝情況，觀察納米材料有無(wú)特殊靶器官。（2）針對(duì)上述兩種納米材料的特殊靶器官進(jìn)行研究，力爭(zhēng)在細(xì)胞水平甚至分子水平上解釋兩種納米材料與靶器官細(xì)胞作用的機(jī)理。,17,試驗(yàn)方法,18,將120只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別為空白對(duì)照組、納米銀1次組、納米銀10次組、微米銀組；每組分別注射1ml細(xì)胞培養(yǎng)液（空白對(duì)照溶液）、納米銀混懸液和微米銀混懸液，其中納米銀10次組分10次注射，每次注射0.1ml；銀的注射總量均為62.8mg/kg，注射方式為皮下注射。分別在2周、4周、8周、12周、18周、24周時(shí)，每組任選5只動(dòng)物，轉(zhuǎn)移到代謝籠中飼養(yǎng)，收集動(dòng)物24h糞便和尿液；之后分別從這些動(dòng)物股動(dòng)脈取約3ml血液；然后斷髓處死動(dòng)物，解剖取注射部位、腦、心、肝、脾、肺、腎、一根股骨、卵巢、子宮、腎上腺。,19,將所有臟器、血液和排泄物，用HNO3和HClO4消解，利用ICP-MS測(cè)試消解液中的Ag含量，再根據(jù)測(cè)試結(jié)果計(jì)算每個(gè)臟器中的Ag含量。分別在2周、12周、24周時(shí)，每組任選3只動(dòng)物，解剖后用手術(shù)刀從取出動(dòng)物的注射部位皮膚、腎、肝、脾、腦、肺中取一小塊，處理后進(jìn)行超微病理分析。,20,結(jié)果討論,21,納米銀和微米銀皮下注射后在體內(nèi)的分布注射后的納米銀和微米銀在大鼠體內(nèi)的分布代謝主要可分為3個(gè)部分：（1）蓄積在注射部位（2）被代謝排泄到體外（3）從注射部位遷移出并分布到體內(nèi)其它臟器。,22,注射部位排泄物,23,遷移到體內(nèi)的銀,24,納米銀和微米銀顆粒在體內(nèi)分布上的差異,25,26,圖1-8腎臟銀含量變化曲線圖,27,28,29,圖1-11腦部銀含量變化曲線圖,30,圖1-12肺部銀含量變化曲線圖,31,納米銀體內(nèi)分布途徑的推測(cè)要想使納米銀在體內(nèi)這么多臟器中分布，一般必須是通過(guò)生物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)，尤其是血液循環(huán)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。而且已有研究報(bào)道進(jìn)入皮膚的納米材料可以遷移到淋巴液或血液中。因此為了驗(yàn)證納米銀是否也是通過(guò)血液而分布全身的，在試驗(yàn)中的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從各組待殺動(dòng)物的股主動(dòng)脈抽取了1ml動(dòng)脈血，通過(guò)消解定容，最后利用ICP-MS測(cè)定了其中的銀含量。,32,圖1-13血液中銀含量變化曲線圖,33,進(jìn)入體內(nèi)的納米銀顆粒可能是以兩種狀態(tài)分布到全身。第一，納米銀在體內(nèi)可能被體液溶解，產(chǎn)生Ag，這些Ag再分布于全身。第二，因?yàn)榧{米銀表面帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)的正電荷因靜電吸附而形成的牢固結(jié)合，所以納米銀顆粒具有良好的親蛋白性，可與血漿蛋白或其它生物蛋白反應(yīng)，材料表面覆有一層生物蛋白膜或者血漿蛋白膜，這些覆蛋白膜的納米銀流動(dòng)性更好，通過(guò)蛋白的代謝，分布于全身。,34,所以僅根據(jù)本試驗(yàn)的ICP-MS的測(cè)試結(jié)果，是無(wú)法分辨出進(jìn)入體內(nèi)的銀是以離子形式存在還是以顆粒形態(tài)存在，也就不能判斷納米銀是否具有能夠在體內(nèi)遷移的生物學(xué)特性。所以進(jìn)一步對(duì)各組動(dòng)物體內(nèi)各臟器的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀測(cè)。,35,2.2超微病理分析結(jié)果,36,（1）腎在對(duì)照組和微米銀組動(dòng)物腎臟超微病理圖片中未發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)。但納米銀組動(dòng)物的腎小管上皮細(xì)胞的胞漿中可發(fā)現(xiàn)高電子密度的球形物質(zhì)，尺寸在納米級(jí)，推測(cè)為納米銀顆粒；這些納米銀顆?？赡芊植荚谌苊阁w和線粒體中。此外，在納米組動(dòng)物的腎小球、腎小囊腔、血管腔中也發(fā)現(xiàn)有相似的納米尺度高電子密度的球形物質(zhì)。,37,38,2周12周24周20000Bar300nm20000Bar300nm40000Bar100nm腎小管上皮細(xì)胞中的納米銀顆粒,39,（2）肝在對(duì)照組和微米銀組動(dòng)物肝臟超微病理圖片中未發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)。但納米銀組動(dòng)物的肝細(xì)胞胞漿中可發(fā)現(xiàn)高電子密度的球形物質(zhì)，尺寸在納米級(jí)，推測(cè)為納米銀顆粒；這些納米銀顆?？赡芊植荚谌苊阁w和線粒體中。此外，在納米組動(dòng)物的肝血竇、竇周隙中也發(fā)現(xiàn)有相似的納米尺度高電子密度的球形物質(zhì)。,40,20000Bar300nm40000Bar100nm由上圖可以發(fā)現(xiàn)在肝血竇的竇周隙中有納米銀顆粒，因此可以推斷納米銀顆粒可以從血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙遷移到竇周隙中。,41,2周12周24周40000Bar100nm20000Bar300nm40000Bar100nm超微病理照片顯示在肝細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有納米銀顆粒。推測(cè)是部分納米銀顆粒依然會(huì)以單分散的形式存在，并進(jìn)入了肝細(xì)胞內(nèi)。,42,（3）脾在對(duì)照組和微米銀組動(dòng)物脾臟超微病理圖片中未發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)。但納米銀組動(dòng)物的脾索淋巴細(xì)胞胞漿中可發(fā)現(xiàn)高電子密度的球形物質(zhì)，尺寸在納米級(jí)，推測(cè)為納米銀顆粒；這些納米銀顆?？赡芊植荚谌苊阁w和線粒體中。此外，在納米組動(dòng)物的脾血竇中也發(fā)現(xiàn)有相似的納米尺度高電子密度的球形物質(zhì)。而且發(fā)現(xiàn)納米銀組動(dòng)物脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量較多。,43,40000Bar100nm20000Bar300nm脾索中的納米銀顆粒,44,2周12周24周40000Bar100nm40000Bar100nm20000Bar300nm超微病理照片顯示在淋巴細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有納米銀顆粒。推測(cè)是部分納米銀顆粒依然會(huì)以單分散的形式存在，并進(jìn)入淋巴細(xì)胞內(nèi)。,45,（4）腦在對(duì)照組和微米銀組動(dòng)物腦部超微病理圖片中未發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)。但納米銀組動(dòng)物的腦部超微病理圖片可以看到比較多壞死的神經(jīng)元，而且腦神經(jīng)元中可發(fā)現(xiàn)高電子密度的球形物質(zhì)，尺寸在納米級(jí)，推測(cè)為納米銀顆粒。這些納米銀顆?？赡芊植荚诰€粒體中。此外，納米組動(dòng)物的血腦屏障外的星形細(xì)胞腳板腫脹，顯示血腦屏障被破壞。在被破壞的血腦屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有相似的納米尺度高電子密度的球形物質(zhì)。,46,納米組微米組空白對(duì)照組納米銀組動(dòng)物的血腦屏障外側(cè)的星形細(xì)胞腳板明顯腫大，這顯示血腦屏障被破壞。與微米銀組和空白對(duì)照組之間有明顯差異。,47,48,40000Bar100nm40000Bar100nm正在通過(guò)血腦屏障的納米銀顆粒,49,推測(cè)可能有兩種途徑：（1）第一，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞吞和胞吐的轉(zhuǎn)運(yùn)作用通過(guò)血腦屏障。（2）松弛內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接或溶解內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜的方式破壞BBB而進(jìn)入腦細(xì)胞。但是僅通過(guò)本試驗(yàn)的研究結(jié)果很難斷定，納米銀顆粒是如何從血液中遷移出來(lái)的，還需要進(jìn)一步的研究證明。,50,abc10000Bar1m5000Bar1m20000Bar300nm正常神經(jīng)元和固縮神經(jīng)元中的納米銀顆粒a正常神經(jīng)元b固縮神經(jīng)元c固縮神經(jīng)元中有納米銀顆粒,51,2周12周24周40000Bar100nm40000Bar100nm40000Bar100nm納米銀組動(dòng)物神經(jīng)元中的納米銀顆粒,52,（5）肺在對(duì)照組和微米銀組動(dòng)物肺部超微病理圖片中未發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)。但納米銀組動(dòng)物的肺泡上皮細(xì)胞的胞漿中可發(fā)現(xiàn)高電子密度的球形物質(zhì)，尺寸在納米級(jí)，推測(cè)為納米銀顆粒。此外，在納米組動(dòng)物的血管腔中也發(fā)現(xiàn)有相似的納米尺度高電子密度的球形物質(zhì)。,53,2周12周24周40000Bar100nm40000Bar100nm40000Bar100nm肺泡上皮細(xì)胞中的納米銀顆粒,54,在本研究中對(duì)各個(gè)臟器超微病理分析照片中可以發(fā)現(xiàn)高電子密度的球形物質(zhì)，尺寸在納米級(jí)。將這些照片與原始的納米銀顆粒照片比較，可以發(fā)現(xiàn)各臟器血管腔中的高電子密度物質(zhì)從電子密度和尺寸這兩方面與納米銀基本一致，可以推斷這些高電子密度的球形物質(zhì)是納米銀顆粒。所以，可以推斷納米銀在體內(nèi)依然還是以顆粒狀態(tài)存在的，并以顆粒狀態(tài)在全身分布。,55,結(jié)論（1）皮下注射后，納米銀與微米銀在體內(nèi)的分布、蓄積和排泄有明顯差異。在試驗(yàn)期間，最高曾經(jīng)有約0.15的納米銀分布于動(dòng)物體內(nèi)各臟器；但只有不到0.02的微米銀分布到體內(nèi)，與空白對(duì)照相比無(wú)顯著性差異。這證明相比于微米銀，納米銀更易分布到體內(nèi)其它臟器。（2）體內(nèi)各臟器中，納米銀在腎、肝、脾、腦、肺等部位的分布明顯高于微米銀。到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，還有部分納米銀蓄積于腎、肝、脾、腦、肺中，所以這些器官是納米銀作用的靶器官。（3）納米銀主要是以顆粒狀形態(tài)通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)遷移到腎、肝、脾、腦、肺等部位的。（4）遷移到體內(nèi)的分散的納米銀顆粒，可以通過(guò)腎小管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)