1,高效液相色譜法原理與應(yīng)用,參考書高效液相色譜及其應(yīng)用液相色譜檢測(cè)方法實(shí)用高效液相色譜法的建立,2,第1章色譜基本原理,一、色譜法概述色譜法的定義與特點(diǎn)色譜法的分離原理色譜法的特點(diǎn)色譜法的分類,3,1.色譜法的定義,茨維特的實(shí)驗(yàn),4,色譜分離效果圖,5,因此色譜法是一種分離方法。它的特點(diǎn)是：有兩相，一是固定相，一是流動(dòng)相，兩相作相向運(yùn)動(dòng)。Chromatography將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。,6,2、色譜法分離原理,當(dāng)流動(dòng)相中所攜帶的混合物流過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。,7,3、色譜法的分類,按流動(dòng)相狀態(tài)的不同，可分為,氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC),8,什么是氣相色譜法？,以氣體為流動(dòng)相的色譜法GasChromatogaphy，簡(jiǎn)稱GC適合分離分析易汽化（在-190-500范圍內(nèi)有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應(yīng)的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的分離。,9,應(yīng)用舉例（GC）,10,什么是液相色譜法？,以液體為流動(dòng)相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡(jiǎn)稱LC適合分離分析高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。,11,按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為：柱色譜（ColumnChromatography）將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜（PaperChromatography）用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（ThinLayChromatography）固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上,12,TLC的應(yīng)用,123456789,BandsDescription1PseudoginsenosideF112AmericanGinseng3GinsenosideRg14GinsenosideRf5Ginseng6GinsenosideRc7GinsenosideRb18Notoginseng9NotoginsenosideR1,人參、西洋參和三七藥材的鑒別,13,丹參藥材有效成分的HPLC圖譜1.Danshensu;2.Protocatechuicacid;3.Protocatechualdehyde;4.Caffeicacid;5.SalvianolicacidF;6.SalvianolicacidD;7.SalvianolicacidJ/isomer;8.SalvianolicacidE;9.Rosmarinicacid;10.Lithospermicacid;11.SalvianolicacidB;12.SalvianolicacidB/E/isomer;13.SalvianolicacidA;14.DihydrotanshinoneI;15.Tetrahydrotanshinone/isomer;16.Cryptotanshinone;17.TanshinoneI;18.TanshinoneIIA,14,15,拖尾峰伸舌峰鬼峰、假峰畸峰峰底基線漂移基線噪聲譜帶擴(kuò)張,16,死時(shí)間(tM):完全不保留組分流出系統(tǒng)的時(shí)間保留時(shí)間(tR):調(diào)整保留時(shí)間(tR):死體積(VM):保留體積(VR):調(diào)整保留體積(VR):,17,R:分離度tR:保留時(shí)間t0：死時(shí)間W：峰底寬度,2.色譜分離基本方程,18,不同R值的峰重疊情況示意圖,R1.5可以得到基線分離分離度R反映的是相鄰兩個(gè)峰的分開程度R太小，兩個(gè)峰無(wú)法徹底分離R太大，分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行業(yè)特殊規(guī)定,19,根據(jù)該公式優(yōu)化試驗(yàn)條件，提高分離度R。從數(shù)學(xué)推導(dǎo)來(lái)看，分別增大n，k值，都可以提高分離度。,色譜分離基本方程,20,分離選擇性（）對(duì)分離度（R）的影響,如果t0=1min,=1.64/1.58=1.04,=1.15/0.85=1.35,=0.95/0.63=1.50,改變分離選擇性的方法改用不同的流動(dòng)相改變流動(dòng)相的組成并非必須大于1.5！改變流動(dòng)相pH值盡量?jī)?yōu)化前幾種實(shí)驗(yàn)條件提高a值，改變柱溫避免改變固定相（買新柱子），以便降低成本應(yīng)用特殊的化學(xué)效應(yīng)改變固定相,21,柱效（n）對(duì)分離度（R）的影響,以上兩張譜圖k，,值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。直觀的看，峰的尖銳程度代表了柱效高低，峰越尖銳，其柱效越高，通常使用理論塔板數(shù)（n）的大小衡量柱效的高低,22,理論塔板數(shù)和理論塔板高度的計(jì)算方法,理論塔板數(shù)理論塔板高度HETP=L/n理論塔板數(shù)n越大，柱效越高；理論塔板數(shù)HETP越效，柱效越高,23,容量因子（k）對(duì)分離度（R）的影響,容量因子越大，分離度越大。k135791113k/k+10.500.750.830.880.900.920.931.00但當(dāng)容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時(shí)間將大大延長(zhǎng)。因此，k的最佳范圍是1k20。,改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖冎荔w積，其中死體積對(duì)k/(k+1)的影響很大。改變流動(dòng)相的配比是最簡(jiǎn)便、最有效的方法梯度洗提,容量因子,24,梯度洗提,梯度洗脫即程序控制流動(dòng)相的組成，使在整個(gè)分離過(guò)程中，溶劑強(qiáng)度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點(diǎn)：分離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。缺點(diǎn)：檢測(cè)器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。,25,26,裝置低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，只需一個(gè)泵，所用溶劑的元數(shù)沒(méi)有限制。高壓梯度（外梯度）：一般由兩臺(tái)高壓泵構(gòu)成，每臺(tái)泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。流量精密度高，溶劑的可壓縮性和熱力學(xué)體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的組成。,27,低壓溶劑梯度方框圖,高壓溶劑梯度方框圖,28,實(shí)現(xiàn)方式對(duì)于復(fù)雜樣品，線性梯度是最好的。正相色譜中，常用二氯甲烷加入正己烷來(lái)實(shí)現(xiàn)。反相色譜中，乙腈，甲醇加入水中是最常用的。,29,溫度的影響,n，k都會(huì)受到柱溫的影響不要使用過(guò)高溫度，以保護(hù)柱子，60度算高溫溫度對(duì)平衡常數(shù)有影響，有時(shí)會(huì)影響出峰順序，注意對(duì)化合物進(jìn)行定性后再定量升溫通?？梢约铀俜蛛x，縮短分析時(shí)間，但也不絕對(duì),30,三、色譜定性與定量方法,31,1.色譜定性分析,(1)純物對(duì)照定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)。,32,實(shí)現(xiàn)方法利用保留時(shí)間和保留體積定性,33,用相對(duì)保留值定性用已知物增加峰高法定性,34,應(yīng)用范圍：適用于簡(jiǎn)單混合物，對(duì)該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用簡(jiǎn)便，不需要其他儀器。缺點(diǎn)：定性結(jié)果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性,35,(2)與其它儀器或化學(xué)方法聯(lián)合定性,離線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法在線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法,36,離線聯(lián)用方式,收集方法：餾分收集器應(yīng)用范圍：無(wú)標(biāo)準(zhǔn)物時(shí)，可對(duì)較為復(fù)雜的混合物進(jìn)行定性分析缺點(diǎn)：麻煩,37,在線聯(lián)用方式,與其它儀器聯(lián)用定性混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口導(dǎo)入其它儀器中進(jìn)行定性。常用的聯(lián)用方法有：LC-FTIR、LC-MS其它儀器相當(dāng)于色譜儀的檢測(cè)器。使用范圍：復(fù)雜樣品的定性。優(yōu)點(diǎn)：不需要標(biāo)準(zhǔn)物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。缺點(diǎn)：需要特殊儀器或設(shè)備。,38,2色譜定量分析,(1)色譜定量基礎(chǔ)色譜定量分析是基于被測(cè)物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：,39,（2）定量要解決的問(wèn)題,峰面積的測(cè)量和計(jì)算校正因子的測(cè)量與計(jì)算色譜定量方法及其應(yīng)用,40,峰面積的測(cè)量與計(jì)算,積分儀或色譜工作站簡(jiǎn)便、速度快，精度高，可達(dá)0.2-2%，對(duì)小峰及不對(duì)稱峰的結(jié)果準(zhǔn)確，是色譜發(fā)展趨勢(shì)。手動(dòng)測(cè)量與計(jì)算,41,峰高乘半峰寬法：適于對(duì)稱峰峰高乘峰底寬度法：適于矮寬峰峰高乘平均峰寬法：適于不對(duì)稱峰峰高乘保留值法：適于狹窄峰，快速簡(jiǎn)便，常用于工廠控制分析。,42,重疊峰的測(cè)量,切線分峰垂線分峰,43,連線分峰計(jì)算機(jī)擬合分峰,44,校正因子的測(cè)量與計(jì)算,相對(duì)校正因子由于絕對(duì)校正因子與儀器的靈敏度有關(guān)，又由于靈敏度與實(shí)驗(yàn)條件相關(guān)，且每一檢測(cè)器的靈敏度都是不同的，它不容易測(cè)量準(zhǔn)確，亦無(wú)通用性，所以實(shí)際工作中使用相對(duì)校正因子。,45,質(zhì)量校正因子摩爾校正因子相對(duì)響應(yīng)值,被測(cè)組分的質(zhì)量,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量,分子量,46,定量方法,校正歸一化法含歸一化內(nèi)標(biāo)法含內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法外標(biāo)法含單點(diǎn)校正,47,校正歸一化法,推導(dǎo)：,48,應(yīng)用范圍：當(dāng)試樣中各組分都能流出色譜柱，且在檢測(cè)器上均有響應(yīng)，各組分峰沒(méi)有重疊時(shí)，可用此法。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，當(dāng)操作條件如進(jìn)樣量等變化時(shí)，對(duì)定量結(jié)果影響很小，該法適合于常量物質(zhì)的定量。缺點(diǎn)：對(duì)該法的苛刻要求限制了它的使用。,49,面積歸一化法,若各組分的定量校正因子相近或相同，則上式可簡(jiǎn)化為：,50,內(nèi)標(biāo)法,推導(dǎo)將一定量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中。,單點(diǎn)校正,51,適用范圍：當(dāng)只需測(cè)定試樣中某幾個(gè)組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時(shí)可用。優(yōu)點(diǎn)：受操作條件的影響較小，定量結(jié)果較準(zhǔn)確，使用上不象歸一化法那樣受到限制，此法適合于微量物質(zhì)的分析。缺點(diǎn)：每次分析必須準(zhǔn)確稱量被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物，不適合于快速分析。,52,內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法（多點(diǎn)校正內(nèi)標(biāo)法）,fi,sms/m為常數(shù)K，此時(shí)Ci%=K(Ai/As)，以Ci%對(duì)Ai/As作標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)點(diǎn)：不必測(cè)校正因子，消除了某些操作條件的影響，方法簡(jiǎn)便，適合液體試樣的常規(guī)分析。,53,外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）,用于常規(guī)分析優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，計(jì)算方便。缺點(diǎn)：結(jié)果的準(zhǔn)確度取決于進(jìn)樣量的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性。該法必須定量進(jìn)樣。,54,單點(diǎn)校正,當(dāng)被測(cè)試樣中各組分的濃度變化范圍不大時(shí)而用單點(diǎn)校正法。即配制一個(gè)與被測(cè)組分含量十分接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液，定量進(jìn)樣，計(jì)算被測(cè)物的含量。,55,（3）定量中的誤差問(wèn)題,樣品的代表性（樣品的前處理）進(jìn)樣系統(tǒng)的影響柱系統(tǒng)的影響測(cè)量誤差定量結(jié)果的誤差分析,56,HPLC主要類型及其選擇,化學(xué)鍵合相色譜法液固色譜法離子對(duì)色譜法離子色譜法體積排阻色譜法,57,一、化學(xué)鍵合相色譜法,1.分類正相鍵合相色譜法(Normalphasechromatography)：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強(qiáng)極性化合物反相鍵合相色譜法(Reversedphasechromatography)：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應(yīng)用最廣泛,58,正相色譜法與反相色譜法比較表,59,2.固定相,疏水基團(tuán)如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18）和苯基等極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。,60,常用固定相,61,62,不同廠商固定相的比較,63,3.流動(dòng)相,溶劑具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)溶劑的選擇與使用的檢測(cè)器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點(diǎn)不能太低溶劑的純度要高且價(jià)格便宜正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。,64,4.影響保留值的因素,溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)保留值的影響：正相：溶質(zhì)極性越強(qiáng)，官能團(tuán)越多，保留值越大反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。溶質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保留值大。,65,66,烷基鍵合固定相特性對(duì)保留值的影響：反相：鍵合相烷鏈長(zhǎng)，k大，選擇性好。,67,溶劑性質(zhì)：正相：溶劑極性越弱，保留越大反相：流動(dòng)相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強(qiáng)。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強(qiáng)，保留值越大。,68,鹽的影響：通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無(wú)機(jī)鹽使流動(dòng)相表面張力增大，對(duì)非離子性溶質(zhì)，使k增加，對(duì)離子型溶質(zhì)，k下降。對(duì)堿性有機(jī)物有改善峰形的作用。pH值：加入酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。,69,5應(yīng)用,70,二.液固色譜法LiquidSolidChromatography,1.固定相極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等2.流動(dòng)相硅膠為固定相時(shí)：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)合適的洗脫強(qiáng)度?？捎盟畬?duì)硅膠進(jìn)行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑,71,3.影響保留值的因素,樣品分子結(jié)構(gòu)溶質(zhì)分子的官能團(tuán)極性增加，保留值增加溶質(zhì)分子的官能團(tuán)數(shù)目增加，保留值增加保留值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān)保留值與吸附中心的幾何分布有關(guān)b吸附劑吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保留值越大吸附劑的活性越強(qiáng)，保留值越大，活性由流動(dòng)相中的含水量來(lái)控制c流動(dòng)相,72,4.應(yīng)用,中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離,73,74,三、離子對(duì)色譜法Ion-pairchromatography,1.基本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對(duì)離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動(dòng)相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對(duì)色譜,75,76,77,2.固定相、流動(dòng)相和離子對(duì)試劑,固定相多為C18,C8反相鍵合相流動(dòng)相是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對(duì)試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等,78,3.影響保留值的因素,pH的影響：改善分離選擇性的有效方法。反相中，對(duì)于陰離子的分離，pH下降，k減小。離子對(duì)試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對(duì)試劑烷基鏈越長(zhǎng)，疏水性越大，k越大。溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強(qiáng)度增大，k下降。洗脫強(qiáng)度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時(shí)相關(guān)離子強(qiáng)度：反相中，離子強(qiáng)度增加，溶質(zhì)k下降,79,4.應(yīng)用,有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等,反相離子對(duì)色譜分析有機(jī)酸固定相：C18烷基鍵合相流動(dòng)相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羥基苯甲酸；4.3-羥基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸,80,液相色譜常用類型總結(jié)：,81,第3章高效液相色譜法的建立與應(yīng)用,82,我國(guó)藥典收載高效液相色譜法項(xiàng)目和數(shù)量比較表：,83,高效液相色譜儀的分析原理高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理,高壓泵,進(jìn)樣器,檢測(cè)器,色譜工作站,色譜柱,84,HPLC有以下特點(diǎn),高壓壓力可達(dá)150300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速流速為0.110.0ml/min。高效可達(dá)10000塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。,85,HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)：,速度快通常分析一個(gè)樣品在1530min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。,86,Inwhichmaterials?Inwhatconcentration?Whichsample?Withwhichtechnique?,一.高效液相色譜法的建立,1.了解樣品,87,Whatisthesample?ConcentrationoftheinterestedcomponentContaminantCharacteristicsofthesampleStructureMolecularweightpKaSolubility,88,溶于水排阻色譜，水為流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量2000不溶于水排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物分配色譜不溶于水異構(gòu)體吸附色譜樣品分子大小差異排阻色譜反相液一液色譜相對(duì)分子質(zhì)量溶于水，不離解2000排阻色譜，水為流動(dòng)相堿陽(yáng)離子交換色譜溶于水，可離解酸陰離子交換色譜溶于水，離子與非離子反相離子對(duì)色譜,89,2.選擇合適的分析方法,AnalyticaltechniqueColumnMobilephaseDetectorSamplepreparation,90,3.分析條件的優(yōu)化,流動(dòng)相種類與配比梯度溫度流速檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)樣量,91,二、高效液相色譜法的應(yīng)用,樣品測(cè)定1流動(dòng)相比例調(diào)整：由于我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有規(guī)定柱的長(zhǎng)度及填料的粒度，因此每次新開檢新品種時(shí)幾乎都須調(diào)整流動(dòng)相（按經(jīng)驗(yàn)，主峰一般應(yīng)調(diào)至保留時(shí)間為615分鐘為宜）。所以建議第一次檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)少配流動(dòng)相，以免浪費(fèi)。弱電解質(zhì)的流動(dòng)相其重現(xiàn)性更不容易達(dá)到，請(qǐng)注意充分平衡柱。,92,樣品測(cè)定,2樣品配制：溶劑；容器：塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品液中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物會(huì)被玻璃容器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。,93,樣品測(cè)定,3記錄時(shí)間：第一次測(cè)定時(shí)，應(yīng)先將空白溶劑、對(duì)照品溶液及供試品溶液各進(jìn)一針，并盡量收集較長(zhǎng)時(shí)間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度、理論板數(shù)及是否還有雜質(zhì)峰在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)才洗脫出來(lái)，確定是否會(huì)影響主峰的測(cè)定。,94,樣品測(cè)定,4進(jìn)樣量：藥品標(biāo)準(zhǔn)中常標(biāo)明注入10l，而目前多數(shù)HPLC系統(tǒng)采用定量環(huán)（10l、20l和50l），因此應(yīng)注意進(jìn)樣量是否一致。（可改變樣液濃度）,95,樣品測(cè)定,5計(jì)算：由于有些對(duì)照品標(biāo)示含量的方式與樣品標(biāo)示量不同，有些是復(fù)合鹽、有些含水量不同、有些是鹽基不同或有些是采用有效部位標(biāo)示，檢驗(yàn)時(shí)請(qǐng)注意。,96,方法研究,1波長(zhǎng)選擇：首先在可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)上測(cè)量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)，如最靈敏的測(cè)量波長(zhǎng)并避開其它物質(zhì)的干擾。從紫外光譜中還可大體知道在HPLC中的響應(yīng)值，如吸收度小于0.5時(shí)，HPLC測(cè)定的面積將會(huì)很小。2流動(dòng)相選擇：盡量采用不是弱電解質(zhì)的甲醇-水流動(dòng)相。,97,食品分析,98,99,100,2.環(huán)境分析,101,102,3.藥物分析,103,104,人參皂苷的分析,105,5.農(nóng)藥分析,106,第4章儀器使用細(xì)節(jié),107,1.HPLC用水,專門的純水機(jī)或超純水機(jī)；去離子水重蒸；二次或三次重蒸水；采用類似家用的純水機(jī)；市場(chǎng)上瓶裝的純凈水或蒸餾水；其它途徑；,108,2.樣品,溶解樣品用溶劑最好是流動(dòng)性，或者用溶劑強(qiáng)度與流動(dòng)相相近的溶劑。進(jìn)樣樣品要求無(wú)微粒，樣品溶液均要用0.45m的濾膜過(guò)濾。,109,3.流動(dòng)相的配制,流動(dòng)相通常按體積比配制。流動(dòng)相在使用前一般都需要過(guò)濾，尤其使用了加緩沖鹽的流動(dòng)相時(shí)。如果沒(méi)有自動(dòng)脫氣裝置，流動(dòng)相配好后應(yīng)該采用合適的方法脫氣，如超聲波脫氣，真空脫氣、氦氣脫氣等。,110,在HPLC系統(tǒng)中使用的注射器針頭有別于氣相色譜，是平頭注射器。一方面，針頭外側(cè)緊貼進(jìn)樣器密封管內(nèi)側(cè)，密封性能好，不漏液，不引入空氣；另一方面，也防止了針頭刺壞密封組件及定子。盡快轉(zhuǎn)動(dòng)閥，不能停留在中途，否則過(guò)高的壓力在柱頭上引起損壞。六通閥進(jìn)樣器的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。使用部分裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的75，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同；使用完全裝液法進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20l的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100l的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。,4.六通閥的使用,111,防止微粒阻塞進(jìn)樣閥和減少對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。為防止緩沖鹽和其它殘留物質(zhì)留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣器，通常用不含鹽的稀釋劑、水或不含鹽的流動(dòng)相沖洗，在進(jìn)樣閥的Load和Inject位置反復(fù)沖洗，。,112,5.泵的保養(yǎng),使用流動(dòng)相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗；流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀；避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；,113,色譜柱問(wèn)題及解決方法：保留值和分離度的重現(xiàn)性：影響方法的準(zhǔn)確度與精密度譜峰拖尾：分離質(zhì)量下降，精密度下降色譜柱壽命,6.色譜柱,114,115,樣品溶劑對(duì)分離結(jié)果的影響,116,柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；要注意流動(dòng)相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測(cè)定結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱；若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；,117,高效液相色譜柱發(fā)展史,19世紀(jì)70年代中期，HPLC儀開始出現(xiàn)，主要填料：10m的無(wú)定型硅膠顆粒。70年代后期，發(fā)展了反相液相色譜。80年代，HPLC被廣泛應(yīng)用于化合物的分離，主要填料：粒徑為510m球形硅膠。90年代早期，粒徑為5m的高純硅膠，即所謂的B型硅膠被發(fā)展，并成為這個(gè)行業(yè)填料的標(biāo)準(zhǔn)，這種B型硅膠含有微量的金屬。90年代后期，為了滿足快速分離的需求，發(fā)展了3m或3.5m的球形硅膠，其作用和性能逐漸的獲得了人們的認(rèn)同和接受。21世紀(jì)早期，為適應(yīng)超快速的分離要求，粒徑小于2m的填料被開發(fā)出來(lái)，發(fā)展出了整體柱、無(wú)機(jī)和有機(jī)雜化硅膠。目前，市場(chǎng)上流行的分析用的HPLC硅膠基質(zhì)填料主要為B型硅膠。,118,PLC色譜柱及其填料的特征,HPLC色譜柱的基質(zhì)材料硅膠與聚合物現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征色譜柱結(jié)構(gòu)固定相鍵合相色譜柱接頭鍵合相穩(wěn)定性,119,硅膠基質(zhì)材料,目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。高機(jī)械強(qiáng)度和高的比表面積?？衫弥苯拥膹V泛的表面鍵合反應(yīng)來(lái)滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。高效。重現(xiàn)性好。pH適用范圍為pH28。具有容易導(dǎo)致強(qiáng)堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。,120,聚合物基質(zhì)材料,交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。pH穩(wěn)定性好：pH113?？梢栽诤軐挼姆秶鷥?nèi)進(jìn)行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。在中等pH條件下對(duì)強(qiáng)堿性物質(zhì)具有更好的峰形。填料的體積隨著流動(dòng)相的不同而改變，如膨脹或收縮。分離效率相對(duì)硅膠而言比較低重現(xiàn)性不好,121,硅膠外形,球形硅膠:現(xiàn)代HPLC填料粒徑小(5m,3m,5m柱床穩(wěn)定性差比表面積較小價(jià)格便宜,122,硅膠純度,硅膠純度對(duì)強(qiáng)極性化合物的分離最重要。以前的純度較低的硅膠（稱為A型硅膠）,A型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來(lái)，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。純度高、酸性較弱的硅膠(稱為B型硅膠)，這種硅膠是以無(wú)金屬的工藝制備而來(lái)，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。金屬雜質(zhì)引起對(duì)螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對(duì)稱峰或拖尾峰。,123,硅膠純度,124,硅膠孔徑,125,硅膠粒徑,126,HPLC色譜柱結(jié)構(gòu),127,鍵合相,鍵合相:反相:70%;C18,65%;C8,15%;Cyano,5%,苯基柱5%,正相:20%;硅膠、-NH2、-CN其它(手性柱,離子交換柱):10%反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。C18和C8在反相色譜終應(yīng)用得最為廣泛。,128,封尾,封尾是用如三甲基硅烷等小分子