第十六章基因診斷與基因治療,廣州中醫(yī)藥大學生物化學教研室,第一節(jié)基因診斷GeneticDiagnosis,內(nèi)容,基因診斷概述基因診斷的方法基因診斷的應用,1.基因診斷概述,（1）為什么要進行基因診斷,遺傳因素(geneticfactors)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用已越來越被人們所認識。隨著分子生物學、分子遺傳學的迅速發(fā)展，人們對疾病發(fā)病機制的認識逐漸深入到基因水平，推動了診斷和防治技術的新發(fā)展。從分析基因變異著手對疾病進行診斷的方法應運而生，并正在逐步發(fā)展和完善，顯現(xiàn)出了強大的生命力。,全球十大致命疾病,（一）心臟病北美、歐洲、大洋洲主要疾病，特別是老年人，僅美國每年就有75萬人死于此病。（二）惡性腫瘤(癌)百余種，至今尚未發(fā)現(xiàn)特效治療方法。（三）腦血管病變(亦叫中風或腦溢血)對老年人危害嚴重。（四）胃腸炎(包括痢疾)此病在不發(fā)達的國家和地區(qū)死亡率很高。（五）流行性感冒及肺炎無特殊預防和治療方法，發(fā)病于世界各地。,（六）支氣管炎(包括肺氣腫和氣喘)（七）糖尿病多見于發(fā)達國家，無根治的辦法。（八）肝硬化與過量飲酒及某些維生素的缺乏有關。（九）結(jié)核病19世紀回升（十）感染性疾病及外傷在不發(fā)達國家，兒童死亡率較高。意外性死亡包括車禍等,2005年城市居民前十位死因為：惡性腫瘤、腦血管病、心臟病、呼吸系統(tǒng)疾病、損傷及中毒、消化系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌營養(yǎng)和代謝疾病、泌尿生殖系統(tǒng)疾病、精神障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，前十位死因合計占死亡總數(shù)的92.0%。,2005年農(nóng)村居民前十位死因為：呼吸系病、腦血管病、惡性腫瘤、心臟病、損傷及中毒、消化系病、泌尿生殖系病、內(nèi)分泌營養(yǎng)和代謝疾病、肺結(jié)核、精神障礙，前十位死因合計占死亡總數(shù)的91.9%。,疾病分類：非基因病基因病,非基因病：,基因?。盒呐K病腫瘤腦血管病糖尿病帕金森病哮喘關節(jié)炎阿爾茨海默病,（2）基因診斷(GeneticDiagnosis)的概念,應用分子生物學和分子遺傳學的技術方法，在DNA或RNA水平，通過檢測致病基因（內(nèi)源或外源）的存在、基因結(jié)構缺陷或表達異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。,Fourtypesofdiagnosis,nucleus,Clinicalmanifestation,（3）基因診斷的特點,屬于“病因診斷”，針對性和特異性強精確性和靈敏度高，微量標本即可進行診斷檢測標本適應性廣診斷感染性疾病早期、快速,（4）基因診斷的意義,遺傳性疾病的診斷與產(chǎn)前及植入前診斷（優(yōu)生優(yōu)育）確定與疾病有關聯(lián)的狀態(tài)，如疾病易感性、可能的抗藥性、發(fā)病類型和階段等傳染性疾病早期（產(chǎn)生抗體前）診斷以及帶病毒人的檢出分析基因型，使器官移植組織配型精確法醫(yī)鑒定（DNA指紋法）,基因診斷的內(nèi)容和技術（一）基因診斷的分子基礎,遺傳病的特定基因通常存在結(jié)構變異，其堿基序列與正?；虿煌?，可以通過DNA測序或多態(tài)性分析進行診斷。有些疾病的基因結(jié)構正常，但表達異常，（例如RNA的合成量異?；蜣D(zhuǎn)錄后加工異常），可以通過對RNA進行定量分析、檢測RNA轉(zhuǎn)錄合成缺陷、轉(zhuǎn)錄后加工缺陷、外顯子變異等進行診斷。,傳染病的發(fā)生是病原體侵入、病原體基因表達的結(jié)果，可以通過設計病原體核酸探針、尋找病原體特異基因或特異序列進行診斷。,（二）基因異常的直接診斷,直接診斷是指檢測與疾病有直接因果關系的致病基因，從而對疾病做出正確診斷。直接診斷的必要條件是：致病基因異常的確是導致疾病發(fā)生的根本原因；致病基因的定位已經(jīng)明確；致病基因的異常結(jié)構或異常表達已經(jīng)在分子水平上闡明。,（三）基因異常的間接診斷,許多疾病的致病基因從結(jié)構到產(chǎn)物及突變情況等尚未在分子水平上闡明，可以采用間接診斷，即分析與該致病基因關聯(lián)的遺傳標志（geneticmarker），也稱為基因連鎖分析?；蜻B鎖（genelinkage）：是指在細胞分裂時，位于同一條染色體上的基因遺傳給同一個子代細胞的現(xiàn)象,如果確定某遺傳病的致病基因與某一特異性DNA片段緊密連鎖，就可以用該片段作為該遺傳病的遺傳標志，判斷家族成員或胎兒是否為患者或致病基因的攜帶者。eg：將非洲人基因組DNA用限制酶Hpa切割，與珠蛋白基因探針雜交，可以檢出7.6kb和13kb兩種相關限制性片段，其中13kb片段在健康人群檢出率只有3%，在鐮狀細胞貧血患者檢出率卻高達87%，提示13kb片段可以作為間接診斷非洲人鐮狀細胞貧血的遺傳標志。,基因診斷的常用技術方法,核酸分子雜交技術、PCR技術、基因芯片技術、DNA測序。,（1）核酸分子雜交,利用具有一定互補序列的兩種核酸單鏈（探針和目標）在液相或固相體系中可締合成異質(zhì)雙鏈的原理，用以分析被測樣品中特定目標序列的方法。具體方法有印跡雜交(包括Southern和Northern印跡雜交)、斑點雜交(Dotblot)和原位雜交(Insitublot)等。,A.Southern印跡雜交,檢測DNA,B.Northern印跡雜交,檢測RNA操作過程類似Southern印記雜交，主要區(qū)別是在變性劑存在下，以瓊脂糖凝膠電泳分離RNA。,C.等位基因特異寡核苷酸探針（ASO）斑點印跡雜交分析法,主要適用于檢測已知點突變,受檢者基因組DNA或含突變位點的PCR擴增產(chǎn)物與標記的ASO探針雜交,ASO1,ASO2,Normal,Hetero,Homo,鐮狀細胞貧血：b-珠蛋白基因點突變GAG(Glu)-GTG(Val)bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC,Hetero,bAprobe,bSprobe,Homo,Normal,D.原位雜交insituhybridization,用核酸分子探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交并對其進行檢測的方法。分類：DNA-DNARNA-DNARNA-RNA,（2）聚合酶鏈反應技術（PCR）,在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸（dNTP）存在的條件下，由耐熱DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）在體外反復酶促合成雙鏈DNA的反應稱為聚合酶鏈式反應。反應分為三步：DNA模板變性單鏈DNA模板與引物退火引物延伸(denaturing)(annealling)(extension),為適應DNA診斷的需要，除上述常規(guī)PCR外，又逐步發(fā)展了不同目的特殊類型的PCR技術：逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）反向PCR（inversePCR）嵌套式PCR（nestingPCR）多重PCR（multiplexPCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）不對稱PCR（asymmertricPCR）錨定PCR（anchoredPCR）原位PCR（insituPCR）定量PCR（quantitativePCR）長片段PCR（longfragmentPCR）,（3）PCR/單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）,PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，可分析確定致病基因的存在。,PCR-SSCP分析法適用于致病基因內(nèi)尚未明確的點突變，可將檢測范圍縮小至某一外顯子或某一片段，再對外顯子或片段進行測序即可確定突變位點。,（4）限制性片段長度多態(tài)性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP),在人類基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對突變（稱為中性突變），中性突變導致個體間核苷酸序列的差異，稱為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別切割位點上，酶解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱為RFLP。,鐮狀細胞貧血：b-珠蛋白基因第六密碼子GAG(Glu)GTG(Val)MstIICCTNAGGbACCTGAGGAG1.15kb0.2bSCCTGTGGAG1.35kb,1.15kb,1.35kb,A.導致某一限制性位點喪失或獲得的點突變,bA/bS,bA,bS,b-地中海貧血：b-珠蛋白基因3末端缺失0.6kb|BgIIIBgIII5.2kb|BgIIIBgIII4.6kb,Homo,Hetero,Normal,5.2kb,4.6kb,B.導致某一限制性位點移位的大片段缺失或插入,C.基因缺失,a-地中海貧血：不同數(shù)量(1-4個)a-珠蛋白基因缺失aa14kbBamHIBamHIaa/aaaa/-aa/a-a-/-/-10kba,D.重復序列,等位基因組合,1/1,1/2,1/3,1/4,2/2,2/3,2/4,3/3,3/4,4/4,（5）DNA序列測定,DNA序列測定是診斷基因突變最直接可靠的方法。PCR技術的應用，使從過去的克隆后測序進入擴增產(chǎn)物直接測序的新階段（PCR-Sequencingmethod）。新近發(fā)展的DNA自動測序儀采用4種