分類號學(xué)校代碼10426密級學(xué)號2010052005碩士學(xué)位論文MASTERDEGREETHESIS納米通道電化學(xué)單分子分析檢測酶分子作者程濤指導(dǎo)教師魏慶莉李雪梅學(xué)科專業(yè)分析化學(xué)專業(yè)代碼070302研究方向生化分析2013年04月10日納米通道電化學(xué)單分子分析檢測酶分子學(xué)位論文完成日期2013年04月10日指導(dǎo)教師簽字答辯委員會成員簽字納米通道電化學(xué)單分子分析檢測酶分子摘要單分子檢測技術(shù)在分析領(lǐng)域的應(yīng)用十分的廣泛，本文主要是應(yīng)用單分子檢測技術(shù)研究酶的活性。本文的研究是基于溶血素納米孔道的單分子電化學(xué)檢測來討論限制性核酸內(nèi)切酶和凝血酶的活性。以溶血素通道為基礎(chǔ)，將膜片鉗放大技術(shù)與電化學(xué)檢測技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶和凝血酶單分子的檢測及傳感分析。利用核酸內(nèi)切酶對特定位點的限制性內(nèi)切以及凝血酶與凝血酶適體親和作用的原理，設(shè)計了不同的特定的DNA鏈，通過觀察分析限制性核酸內(nèi)切酶或凝血酶作用于DSDNA后，DNA通過納米孔道時的微電流變化，從而達到研究限制性核酸內(nèi)切酶和凝血酶活性的目的。本論文共分為五章第一章，概述了納米通道、核酸內(nèi)切酶以及納米粒子的簡介及作用并簡單介紹了單分子檢測技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)以及膜片鉗放大檢測技術(shù)等分析方法。著重對單分子檢測技術(shù)和納米通道進行了說明，對單分子檢測技術(shù)的前景做了介紹。第二章，采用單分子電化學(xué)檢測初步研究了DNA測序工作，主要研究了限制性內(nèi)切酶的活性。通過用溶血素和卵磷脂的自由組裝形成生物納米孔道，利用溶血素孔徑的特性來控制單鏈DNA和雙鏈DNA通過孔徑時不同的電流下降，來初步對DNA測序工作進行了解。在限制性內(nèi)切酶的作用下雙鏈DNA能順利的通過納米孔道，通過對比限制性內(nèi)切酶作用前后電流的變化進而對限制性內(nèi)切酶的活性進行研究。第三章，通過凝膠電泳技術(shù)和納米金標(biāo)記DNA在TEM下的圖像來研究限制性核酸內(nèi)切酶的活性，以及錯配堿基T與T在HG2條件下能形成THGT的穩(wěn)定存在。首先通過限制性內(nèi)切酶作用前后的DNA在凝膠電泳下進行分離，觀察分離的情況來研究限制性內(nèi)切酶的，其次當(dāng)DNA被納米金修飾后，觀察在限制性內(nèi)切酶作用前后，DNA上修飾的納米金在TEM表征下的不同來研究限制性內(nèi)切酶的活性。同時在以上的實驗中剪切位點有錯配堿基T與T的時候，限制性內(nèi)切酶不能作用，只有當(dāng)在HG2條件下，形成THGT的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)后，限制性內(nèi)切酶才能發(fā)生作用。第四章，通過溶血素納米孔道研究凝血酶單分子的活性。通過用溶血素和卵磷脂的自由組裝形成生物納米孔道，利用溶血素孔徑的特性來控制單鏈DNA和雙鏈DNA通過孔徑時不同的電流下降。研究了凝血酶與是凝血酶適體的親和作用，當(dāng)凝血酶作用下的SSDNA才能順利的通過溶血素納米孔道，同時也研究了頸環(huán)結(jié)構(gòu)的解鏈時間與電壓的關(guān)系。利用核酸適體實現(xiàn)單個酶分子的檢測，對單個酶分子的實時生物化學(xué)反應(yīng)和酶催化動力學(xué)進行研究，研究單個酶分子在許多非特異性結(jié)合位點中如何找到特異性位點，為解決生命科學(xué)中的重大問題提供理論依據(jù)。第五章，結(jié)論部分，對全文內(nèi)容進行了總結(jié)。關(guān)鍵詞核酸內(nèi)切酶；凝血酶；單分子檢測；溶血素；納米通道ELECTROCHEEMICALDETECTIONGOFSINGLEENZYMEMOLECULESBASEDONNANOCHANNELABSTRACTTHETECHNOLOGYOFSINGLEMOLECULEDETECTIONISWIDELYAPPLIEDINTHEFIELDOFANALYSIS,THISPAPERMAINLYRESEARCHSTHEACTIVITYOFENZYMEBYTHETECHNOLOGYOFSINGLEMOLECULEDETECTIONTHERESEARCHOFTHISPAPERISBASEDONTHESINGLEMOLECULARELECTROCHEMICALDETECTIONOFHEMOLYSINNANOPORESTODISCUSSTHEACTIVITYOFRESTRICTIONENDONUCLEASEANDTHROMBINUSINGTHEPRINCIPLEOFENDONUCLEASESRESTRICTIONOFASPECIFICSITEANDTHEAFFINITYFUNCTIONOFTHROMBINANDTHROMBINAPTAMER,THEDIFFERENTSPECIFICDNACHAINSAREDESIGNEDWHENRESTRICTIONENDONUCLEASEORTHROMBINACTSONTHEDSDNA,THEMICROELECTRICCURRENTWHENDNATHROUGHINGNANOPORESWILLBEDIFFERENT,SOASTOACHIEVETHEPURPOSEOFRESEARCHINGTHEACTIVITYOFRESTRICTIONENDONUCLEASEANDTHROMBINTHISTHESISISDIVIDEDINTOFIVECHAPTERSTHEFIRSTCHAPTER,THISPAPERSUMMARIZESTHEINTRODUCTIONANDFUNCTIONOFNANOCHANNEL,ENDONUCLEASEANDNANOPARTICLESOFANDSIMPLYINTRODUCESTHEANALYTICALMETHODOFSINGLEMOLECULEDETECTION,MICROGELELECTROPHORESISSANDTHEPATCHCLAMPAMPLIFIERDETECTIONTHISPAPERESPECIALLYILLUSTRATESTHESINGLEMOLECULEDETECTIONANDNANOCHANNEL,ATTHESAMETIMETHEPROSPECTSOFTHESINGLEMOLECULEDETECTIONISPRESENTEDTHESECONDCHAPTER,THESINGLEMOLECULEDETECTIONISUSEDTOPRELIMINARYSTUDYTHEDNASEQUENCINGANDMAINLYSTUDYTHEACTIVITYOFRESTRICTIONENZYMESUSINGTHECHARACTERISTICSOFHEMOLYSINAPERTURETOCONTROLTHEDIFFERENTCURRENTWHENTHESINGLESTRANDDNAANDDOUBLESTRANDEDDNATHROUGHTHEPORE,THISPAPERPRELIMINARYUNDERSTANDSTHEDNASEQUENCEBYUSINGTHEBIOLOGICALNANOPORESOFHEMOLYSINANDLECITHINFREEASSEMBEDUNDERTHEACTIONOFRESTRICTIONENZYMES,THEDOUBLESTRANDEDDNACANSMOOTHLYTHROUGHTHENANOPOREBYCOMPARINGTHECURRENTCHANGEBEFOREANDAFTERRESTRICTIONENZYMESFUNCTION,THERESTRICTIONENZYMESACTIVITYISSTUDIEDTHETHIRDCHAPTER,BYMICROGELELECTROPHORESISSTECHNOLOGYANDTHETHETEMIMAGESOFDNATAGGEDBYAUNPS,THERESTRICTIVEENDONUCLEASESACTIVITYISSTUDIED,ASWELLASTHEMISMATCHBASETANDTCANSTABLYEXISTUNDERTHECONDITIONOFHG2FIRSTLYSTUDINGTHEACTIVITYOFTHERESTRICTIONENZYMEBYOBSERVINGTHESEPARATION,WHICHISTHEDNAUNDERTHEMICROGELELECTROPHORESISSBEFOREANDAFTETHERESTRICTIONENZYMESACTIONSECONDLYAFTERTHEDNAISTAGGEDBYAUNPS,STUDINGTHEACTIVITYOFTHERESTRICTIONENZYMEBYOBSERVINGNANOPARTICLESSDIFFERENTCHARACTERSINTEMATTHESAMETIMEINTHEABOVEEXPERIMENTS,WHICHHAVEMISMATCHBASETANDTTHERESTRICTIONENZYMESCANNOTACTONTHEDNAONLYWHENUNDERTHECONDITIONOFHG2,FORMEDTHESTABLESTRUCTUREOFTHGT,THERESTRICTIONENZYMESCANWORKTHEFOURTHCHAPTER,THROUGHTHEHEMOLYSINNANOPORES,THEACTIVITYOFTHROMBINMOLECULEISSTUDIEDUSINGTHECHARACTERISTICSOFHEMOLYSINAPERTURETOCONTROLTHEDIFFERENTCURRENTWHENTHESINGLESTRANDDNAANDDOUBLESTRANDEDDNATHROUGHTHEPORE,THISPAPERPRELIMINARYUNDERSTANDSTHEDNASEQUENCEBYUSINGTHEBIOLOGICALNANOPORESOFHEMOLYSINANDLECITHINFREEASSEMBEDTHISPAPERRESEARCHSTHEAFFINITYOFTHROMBINANDTHROMBINAPTAMERWHENUNDERTHEACTIONOFTHROMBIN,THESSDNACANSMOOTHLYTHROUGHTHEHEMOLYSINNANOPORESATTHESAMETIME,THETIMEOFMELTINGTHECHAINSOFNECKRINGSTRUCTUREISRELEVANTTOTHEVOLTAGETHEFIFTHCHAPTER,ITWASSUMMARIZEDFORTHEWHOLETHESISKEYWORDSENDONUCLEASETHROMBINSINGLEMOLECULEDETECTIONHEMOLYSINNANOCHANNEL目錄第一章緒論11納米通道111自然態(tài)的通道1111生物膜離子通道1112溶血素跨磷脂雙層細胞膜形成的離子通道112人工合成的通道22核酸內(nèi)切酶321核酸內(nèi)切酶簡介322核酸內(nèi)切酶的分類323限制性核酸內(nèi)切酶作用324限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)及應(yīng)用43單分子檢測（SINGLEMOLECULESDETECTION,SMD）531DNA簡介5311DNA的成分5312DNA的空間結(jié)構(gòu)5313DNA的穩(wěn)定性632適體7321適體簡介7322適體的特點733單分子檢測的分類8331光譜分析法8332電化學(xué)檢測法8333生物動力學(xué)工具法9334單分子檢測的應(yīng)用前景94納米粒子1141納米粒子簡介11411納米粒子的性質(zhì)1142納米金粒子1243二氧化鈰納米粒子135凝膠電泳分析1551電泳簡介15511電泳技術(shù)與應(yīng)用15512聚丙烯酰胺凝膠電泳156膜片鉗放大檢測技術(shù)1761膜片鉗技術(shù)簡介1762電壓鉗位1763單通道電流記錄177立題依據(jù)和研究內(nèi)容18第二章基于溶血素納米孔道檢測NBBBVCI內(nèi)切酶單分子191前言192實驗部分2021試劑與儀器20211主要試劑20212儀器裝置2022實驗方法21221DNA儲備液及緩沖溶液21222樣品的制備21223卵磷脂的處理21224儀器操作21225制備磷脂雙分子層膜21226在磷脂雙分子層膜上形成納米孔道22227檢測P1、P2、P3通過納米孔道時的電流信號233結(jié)果與討論2431實驗原理2432實驗過程26321檢測P1穿過納米孔道時的電流變化26322檢測P2穿過納米孔道時的電流變化28323檢測P3穿過納米孔道時的電流變化2933討論P1、P2、P3穿過納米孔道時的電流脈沖304小結(jié)33第三章基于納米金膠標(biāo)記DNA的電化學(xué)檢測341前言342實驗部分3521試劑與儀器35211主要試劑35212儀器裝置3522實驗方法36221納米金膠的制備36223凝膠電泳樣品的制備36224透射電子顯微鏡分析（TEM）的樣品的制備362241巰基DNA的前處理與修飾362242制備TEM的樣品373結(jié)果與討論3831實驗原理3832利用凝膠電泳分離DNA38321制膠383211制備30凝膠383212制得50TAE緩沖液383213固定凝膠38322凝膠電泳分離DNA3933利用TEM表征反應(yīng)前后的溶液41331納米金溶液TEM表征41332G1、G2的TEM表征42333G3、G4的TEM表征43334G5、G6的TEM表征444小結(jié)47第四章基于溶血素納米孔道檢測凝血酶單分子481前言482實驗部分4921試劑與儀器49211主要試劑49212儀器裝置4922實驗方法50221DNA儲備液及緩沖溶液50222樣品的制備50223卵磷脂的處理50224儀器操作50225制備磷脂雙分子層膜50226在磷脂雙分子層膜上形成納米孔道5123實驗原理5124檢測頸環(huán)結(jié)構(gòu)S1穿過溶血素孔道的電流信號5225檢測凝血酶加入前后雜交頸環(huán)DNA穿過溶血素孔道的電流信號5426討論G1、G2、G3穿過納米孔道時的電流脈沖553小結(jié)59第五章結(jié)論60參考文獻61致謝65附錄攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄66獨創(chuàng)性聲明67第一章緒論1納米通道納米孔一般定義為內(nèi)徑為1100NM的微孔，若孔的深度遠大于孔徑，就稱之為納米孔道，一般孔徑應(yīng)大于洞孔深度，或者處于同一量級。納米通道根據(jù)其形成方式可以分為自然態(tài)的通道以及人工合成的通道。11自然態(tài)的通道111生物膜離子通道離子通道依據(jù)其活化的方式不同，可分兩類一類是電壓活化的通道，即通道的開放受膜電位的控制，如NA、CA、CL和一些類型的K通道；另一類是化學(xué)物活化的通道，即靠化學(xué)物與膜上受體相互作用而活化的通道，如ACH受體通道、氨基酸受體通道、CA活化的K通道等?；铙w細胞不停地進行新陳代謝活動，就必須不斷地與周圍環(huán)境進行物質(zhì)交換，而細胞膜上的離子通道就是這種物質(zhì)交換的重要途徑人們已經(jīng)知道，大多數(shù)對生命具有重要意義的物質(zhì)都是水溶性的，如各種離子，糖類等，它們需要進入細胞，而生命活動中產(chǎn)生的水溶性廢物也要離開細胞，它們出入的通道就是細胞膜上的離子通道。生物膜離子通道是各種無機離子跨膜被動運輸?shù)耐?。生物膜對無機離子的跨膜運輸主要有被動運輸和主動運輸兩種方式。被動運輸?shù)耐贩Q離子通道，主動運輸?shù)碾x子載體稱為離子泵。生物膜對離子的通透性與多種生命活動過程密切相關(guān)。例如，感受器電位的發(fā)生，神經(jīng)興奮與傳導(dǎo)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控功能，心臟搏動，平滑肌蠕動，骨骼肌收縮，激素分泌，光合作用和氧化磷酸化過程中跨膜質(zhì)子梯度的形成等。112溶血素跨磷脂雙層細胞膜形成的離子通道溶血素可以與磷脂雙子層自組裝形成自然態(tài)的生物納米孔道。溶血素的內(nèi)部孔道是剛性的，它可以使得小型的離子和帶電的分子通過，對于大分子物質(zhì)是不能通過的，因此以溶血素納米孔為基礎(chǔ)的生物膜在電化學(xué)檢測池中可以降電化學(xué)檢測池分割成由微孔相連的兩個部分。在一定的電壓下帶電的離子或帶電微型分子可以定向地從通道內(nèi)通過。不同的電壓下，孔道內(nèi)的電流是不一樣的，當(dāng)DNA或者RNA分子穿過時會產(chǎn)生下降電流，同時會有下降的脈沖，脈沖的寬度與鏈的長短成正比的，而且通過納米孔道時，脈沖的數(shù)量、時間等與組成DNA或RNA的堿基數(shù)量有關(guān)。生物大分子在外界壓力下穿過由玻璃等絕緣材料制作的納米孔或生物納米孔時會導(dǎo)致通過小孔離子流的阻塞，小孔電導(dǎo)率的瞬時變化反應(yīng)了這個過程，電流的減低量反映粒子的體積大小，而電流變化的次數(shù)則反映生物大分子的數(shù)目。12人工合成的通道盡管溶血素孔能夠滿足生物大分子的研究，但是由于其自身性質(zhì)的原因注定其本身的不穩(wěn)定性，使得形成的納米孔道同樣壽命比較短而且自身的孔徑的控制比較局限，這就促使人們對新一類的納米孔道的探索1。固態(tài)納米孔道具有孔徑穩(wěn)定，物理性能良好等優(yōu)勢。常用的固態(tài)納米孔道是應(yīng)用SI3N4晶體膜。制造固態(tài)納米孔道的技術(shù)里最常見的是聚焦粒子束技術(shù)，它專門應(yīng)用于光刻掩模版修補和集成電路修飾。人工合成的納米通道還有碳納米管、聚合膜通道、AL2O3膜通道，其中碳納米管通道在目前應(yīng)用比較廣泛，碳納米管的研究主要是基于石墨烯的研究，目前對于石墨烯的研究越來越多，在各個領(lǐng)域都有相關(guān)的報道，因此人工制造的碳納米管納米通道成了現(xiàn)在單分子檢測的熱點。2核酸內(nèi)切酶21核酸內(nèi)切酶簡介內(nèi)切酶，即限制性核酸內(nèi)切酶，亦稱限制性核酸酶。它是一種能催化多核苷酸的鏈斷裂的酶，只對脫氧核糖核酸內(nèi)一定堿基序列中特定位置發(fā)生作用，把這位置的鏈切開。通過內(nèi)切酶可以把某一個遺傳基因片段剪切下來，若再連接在別的生物細胞的遺傳基因上，便可使這生物細胞具有新的遺傳特性。當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開來的時候，以NEB為代表的許多公司開始尋找更多的限制性內(nèi)切酶。除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)在人們正在從數(shù)以千計的細菌及古細菌中尋找新的限制性內(nèi)切酶。而對已測序的原核基因組數(shù)據(jù)分析表明，限制性內(nèi)切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的細菌和古細菌似乎都能編碼限制性內(nèi)切酶。限制性酶的功能是在DNA分子的內(nèi)部拆卸水解，甲基化酶作用是修飾，DNA分子經(jīng)修飾后，就可逃避限制性酶的識別，從而避免了限制性酶對自身DNA的破壞。22核酸內(nèi)切酶的分類核酸內(nèi)切酶主要分為三類內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的；內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構(gòu)建來自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子；內(nèi)切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序。它在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。23限制性核酸內(nèi)切酶作用限制性核酸內(nèi)切酶（以下簡稱限制性酶）是一類識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內(nèi)切方式水解DNA，產(chǎn)生5P和3OH末端。1952年LURIA等及1953年BERTANI等研究噬菌體時發(fā)現(xiàn)了宿主控制性現(xiàn)象。ARBER及其同事用放射性同位素標(biāo)記證明，噬菌體在新品系中的損害伴隨有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，據(jù)此他們提出了限制性修飾酶假說。對于一個宿主細胞，限制性酶及DNA甲基化酶是其細胞中的一對酶，它們對DNA底物有相同的識別順序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子內(nèi)部拆卸水解，甲基化酶是修飾，DNA分子經(jīng)修飾后，就可逃避限制性酶的識別，而甲基化酶只修飾宿主自身的DNA，從而避免了限制性酶對自身DNA的破壞。24限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)及應(yīng)用限制性內(nèi)切酶是一種生物蛋白。限制性內(nèi)切酶儲存在含50的甘油緩沖液中，酶切時甘油的濃度不應(yīng)超過1/10體積。否則對酶活性有抑制作用。限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強度、PH等條件下才表現(xiàn)最佳的切割能力和位點的專一性，所以要用專一的反應(yīng)緩沖溶液。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展限制性內(nèi)切酶廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域如DNA測序、微生物的DNA分析、DNA切割技術(shù)、DNA的重組等。限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中占有極其重要的地位，幾乎每一個研究領(lǐng)域都離不開限制性內(nèi)切酶，其應(yīng)用非常廣泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，將龐大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重組和組建新質(zhì)粒；建立DNA的物理圖譜等。3單分子檢測（SINGLEMOLECULESDETECTION,SMD）單分子檢測是一種在分子水平上檢測靈敏度達到極限的技術(shù)，是對低含量物質(zhì)檢測起著至關(guān)重要的技術(shù)2。單分子檢測技術(shù)為分析化學(xué)的檢測提供了很多的可能性，極其有效的推動著分析化學(xué)的進展，目前單分子檢測技術(shù)在分析化學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得了不少的成果。單分子檢測不僅可以對不均勻的體系中的單個分子進行識別，同時也能對其進行分類、定量分析，同時它對生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能也能提供很多的重要信息。單分子檢測技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢將在分析化學(xué)、生物、醫(yī)藥、納米分析等領(lǐng)域開辟新的路徑和科研手段35。31DNA簡介1954年4月DNA雙螺旋提出后，整個生物學(xué)界呈現(xiàn)出少有的五彩繽紛的景象，被認為是20世紀(jì)以來生物科學(xué)中最偉大的成果，是生物學(xué)史上一個新紀(jì)元，為生物科學(xué)，農(nóng)業(yè)科學(xué)，醫(yī)學(xué)的發(fā)展開辟了新天地。生化方面在21世紀(jì)吸引無數(shù)眼球的熱門詞匯比如人類基因組計劃、基因芯片、個性化瘋子診斷、生物云計算，這些都和DNA測序有很大的關(guān)系