1、人MASP1 N端片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)作者：蔡學(xué)敏, 趙娜, 左大明, 張麗蕓, 陳政良【摘要】 目的: 在大腸桿菌中表達(dá)人甘露聚糖結(jié)合凝集素（MBL）相關(guān)絲氨酸蛋白酶1（MASP1）N端片段。方法: 采用PCR技術(shù)從含人MASP1 cDNA的質(zhì)粒pGEMMASP1中擴(kuò)增MASP1N端基因片段, 將其插入原核表達(dá)載體pGEX4T1, 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌誘導(dǎo)表達(dá)MASP1N端蛋白, 通過GSTrap親合層析柱純化目的蛋白, 以SDSPAGE和Western blot進(jìn)行鑒定, 并以ELISA分析了目的蛋白與重組MBLCLR、 重組MBL的結(jié)合活性。結(jié)果: 從pGEMMASP

2、1中擴(kuò)增得到約860 bp的基因片段, 構(gòu)建成重組載體經(jīng)酶切出現(xiàn)約4900 bp和860 bp片段,測序結(jié)果與預(yù)期的完全一致。純化蛋白經(jīng)SDSPAGE可見Mr 60000蛋白帶, 該蛋白可與抗GST抗體反應(yīng)并能與重組人MBLCLR、 重組人MBL蛋白結(jié)合。結(jié)論: 獲得了表達(dá)人MASP1 N端片段的大腸桿菌菌株和重組人MASP1 N端片段/GST融合蛋白, 為MASP1分子的進(jìn)一步研究提供了條件。 【關(guān)鍵詞】 甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶1 N端片段 原核表達(dá)Abstract AIM: To express the Nterminal fragment of human mannan2 /

3、 21binding lectin (MBL) associated serine proteases1 (MASP1N) in E.coli. METHODS: The target sequence in pGEMMASP1 plasmid that contains human MBLMASP1 cDNA was amplified by PCR, inserted into prokaryotic expression vector pGEX4T1 and identified by restriction mapping and sequencing. The recombinant

4、 expression vector was transformed into E.coli BL21 (DE3) cells. The expressed product was purified by GSTrap Immobilized Metal Affinity Chromatography(IMAC) and identified by SDSPAGE and Western blot assay, its bindingactivity with the collagenlike region of human MBL(MBLCLR) and with recombinant h

5、uman MBL was analyzed by an indirect enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）. RESULTS: The DNA fragment of 860 bp, which encode the Nterminal region of human MASP1, was amplified from pGEMMASP1 plasmid and the recombinant expression vector, pGEX4TMASP1N, was constructed, whose restriction maps and s

6、equence were consistent with those expected. The component of Mr 60 000 in the purified recombinant product was found by SDSPAGE and could be recognized by antiGST antibody in Western blot assay. The purified recombinant product could react with human MBLCLR and human MBL in the indirect ELISA. CONC

7、LUSION: The prokaryotic cell strain that expresses efficiently recombinant human MASP1N(rhMASP1N) protein and the purified rhMASP1N protein were successfully obtained, which provides the basis for further research of MASP1 molecule.Keywordsmannanbinding lectin associated serine protease1; Nterminal

8、fragment; prokaryotic expression甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannanbinding lectin, MBL）是由肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白, 在血循環(huán)中與MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶（MBLassociated serine protease, MASP）形成復(fù)合物而發(fā)揮功能。MBL的糖識別域（carbohydraterecognition domain, CRD）能選擇性識別多種病原體表面的糖結(jié)構(gòu), 而膠原樣區(qū)（collagenlike region, CLR）為其效應(yīng)功能區(qū), 結(jié)合MASP的功能定位于此區(qū)。MBL與糖基配體結(jié)合后, 勿需C1和抗體參與即可通過MASP激活補(bǔ)體

9、系統(tǒng), 此即補(bǔ)體激活第三途徑凝集素途徑1-3。MASP1屬于絲氨酸蛋白酶（serine proteases, SP）超家族成員, 為含6個功能區(qū)的單肽鏈分子: 從N端至C端依次為CUB區(qū)（complement subcomponent C1r/C1slike domain）、 EGF區(qū)（epidermal growth factorlike domain）、 CUB區(qū)、 CCP區(qū)（complement control protein domain）、 CCP區(qū)和SP區(qū)。初步研究表明, MASP1 N端的CUB和EGF區(qū)涉及與MBL CLR的結(jié)合3。為了深入研究MBL與MASP1結(jié)合的活性位點(diǎn),

10、 闡明MBL與MASP1相互作用從而激活凝集素途徑的機(jī)制, 我們構(gòu)建了MASP1N端片段（包括CUBEGFCUB區(qū)）的原核表達(dá)載體, 在大腸桿菌中高效表達(dá)MASP1N端蛋白。1 材料和方法1.1 材料 質(zhì)粒pGEX4T1、 感受態(tài)大腸桿菌TOP10F和BL21(DE3)由本室保存。含人MASP1全長編碼區(qū)cDNA的pGEMMASP1質(zhì)粒、 重組人MBLCLR蛋白、 重組人MBL蛋白和抗人MBLCRD抗體由本室構(gòu)建或制備4-6。限制性內(nèi)切酶EcoR、 Xho, T4 DNA連接酶, Taq DNA聚合酶, dNTP, 低Mr蛋白Marker, DL 2000及HRP羊抗鼠IgG抗體均購自大連寶生

11、物公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒, 小量DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自杭州維特潔公司。抗GST mAb購自北京TIANGEN公司。GSTrap親和層析柱購自Amersham Biosciences公司。1.2 MASP1N端片段原核表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計1對特異引物:上游引物序列為5GCGAATTCCACACCGTGGAGCTAAAC3, 含有EcoR酶切位點(diǎn); 下游引物序列為 5GCCTCGAGCATTTCCTGCAGCCCTGTATG3, 含有Xho酶切位點(diǎn)。引物由上海博亞公司合成。以pGEMMASP1質(zhì)粒為模板, 采用上述引物擴(kuò)增MASP1N端包括2個CUB區(qū)和EGF區(qū)的

12、編碼基因片段（長度857 bp, 編碼280個氨基酸）, 以PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物, 用EcoR和Xho雙酶切MASP1N端基因片段和pGEX4T1質(zhì)粒DNA, 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠回收試劑盒回收各片段, 以T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10F大腸桿菌, 涂菌液于含100 mg/L 氨芐青霉素的LB平板中, 挑取單個菌落, 接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中, 37振蕩培養(yǎng)12 h。提取質(zhì)粒, 以限制性內(nèi)切酶EcoR和Xho酶切鑒定, 并進(jìn)行DNA序列測定（由上海博亞公司完成）。鑒定正確的質(zhì)粒命名為pGEX4TMASP1N。1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將

13、鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX4TMASP1N轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中, 涂菌液于含100 mg/L氨芐青霉素的LB平板中, 挑取單個菌落, 接種于含同等濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中, 37振蕩培養(yǎng)過夜活化。按1%轉(zhuǎn)種于同種培養(yǎng)液中, 37振蕩培養(yǎng)至A600=0.61.0, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。取1 mL菌液,制成蛋白電泳樣品, 進(jìn)行SDSPAGE鑒定。大量培養(yǎng)工程菌, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后, 離心收集菌體。用1/10培養(yǎng)液體積的緩沖液A（10 mmol/L imidazole, 300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO

14、4, pH8.0）懸浮沉淀細(xì)菌, 超聲破碎, 10000 g離心10 min（4）, 分別收集上清和沉淀, 制樣進(jìn)行SDSPAGE分析。1.4 重組表達(dá)蛋白的復(fù)性與純化 將收集的沉淀用預(yù)冷的5 mL/L TritonX100約30 mL洗滌2次, 每克菌約用6 mL 8 mol/L 尿素溶解, 4、 12000 r/min離心20 min。上清液用雙蒸水進(jìn)行梯度透析復(fù)性: 先于500 mL含8 mol/L尿素的溶液中4透析過夜, 然后分別在含5、 4、 3、 2、 1、 0.5 mol/L尿素的溶液中透析, 每6 h換液1次, 而后置于ddH2O中透析, 最后在PBS中透析過夜, 收集蛋白溶液

15、經(jīng)0.45 m濾膜過濾后上GSTrap層析柱, 使用AKATA Prime蛋白層析系統(tǒng), 用Binding buffer（pH7.2, NaCl 140 mmol/L, KCl 2.7 mmol/L, Na2HPO4 10.1 mmol/L, KH2PO4 1.8 mmol/L）沖洗后, 用Elution buffer（50 mmol/L TrisHCl, 10 mmol/L 還原型谷胱甘肽, pH8.0）進(jìn)行洗脫, 每次洗脫時的流速控制在1 mL/min, 收集各洗脫液, 取樣進(jìn)行SDSPAGE。1.5 重組蛋白的鑒定1.5.1 重組蛋白與抗GST mAb的結(jié)合 Western bolt分析

16、: 純化重組蛋白經(jīng)SDSPAGE后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上; 將膜置于含3 g/L脫脂奶粉的溶液中4封閉過夜, 然后加抗GST抗體, 37反應(yīng)2 h; 洗膜后, 加15000 HRP羊抗鼠IgG, 37反應(yīng)1 h; 洗膜后, 用DAB顯色試劑盒顯色。1.5.2 重組蛋白與MBLCLR的結(jié)合試驗 洗滌液為含0.5 mL/L Tween20的0.15 mol/L、 pH7.4 PBS（PBST）, 稀釋液（結(jié)合緩沖液）為含2.5 g/L BSA的PBST。將純化重組蛋白從20 mg/L至0.6 mg/L倍比稀釋, 以BL21(DE3)pGEX4T1表達(dá)蛋白作同樣稀釋作為陰性對照, 加入酶聯(lián)板, 10

17、0 L/孔, 4過夜包被; 加入50 g/L脫脂奶粉, 37封閉2 h, 洗滌; 加入2 mg/L BiotinMBLCLR蛋白, 100 L/孔, 37作用1 h, 洗滌; 加12000稀釋的HRPAvidin, 37反應(yīng)1 h, 洗滌; 加入OPDH2O2底物液顯色, 2 mol/L硫酸終止反應(yīng), 測定A490值。1.5.3 重組蛋白與重組人MBL的結(jié)合試驗 包被和封閉方法同上, 洗滌; 加入0.5 mg/L的重組人MBL蛋白, 100 L/孔, 37作用1 h, 洗滌; 加入12000稀釋的抗MBLCRD抗體, 37反應(yīng)1 h, 洗滌; 加入15000稀釋的羊抗小鼠抗體, 37反應(yīng)1 h

18、, 洗滌; 加入OPDH2O2底物液顯色, 2 mol/L硫酸終止反應(yīng), 測定A490值。2 結(jié)果2.1 pGEX4TMASP1N重組表達(dá)載體的構(gòu)建 使用特異引物對進(jìn)行PCR, 從含人MASP1 cDNA的質(zhì)粒pGEMMASP1中擴(kuò)增得到約860 bp的目的基因片段, 將其插入pGEX4T1原核表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)載體, 經(jīng)EcoR和Xho雙酶切, 只有第5泳道可見約4900 bp和860 bp條帶, 前者為雙酶切后的載體片段, 后者為雙酶切后的目的DNA片段（圖1）。DNA測序結(jié)果與預(yù)期的完全一致, 表明重組表達(dá)載體pGEX4TMASP1N構(gòu)建成功。圖1 重組質(zhì)粒的鑒定（略）Fig 1 Id

19、entification of the recombinant plasmid1: DL 2000 DNA marker; 2-5: pGEX4TMASP1N/EcoR I+Xho I.2.2 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá) 將鑒定正確的重組表達(dá)載體pGEX4TMASP1N轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 37振蕩培養(yǎng)過夜。按1%比例轉(zhuǎn)種于同樣培養(yǎng)液中, 37振蕩培養(yǎng)至A600=0.61.0, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 誘導(dǎo)表達(dá)4 h。SDSPAGE分析表明, 與pGEX4T1/BL21(DE3)菌比較, 重組子pGEX4TMASP1N在Mr 60000處有1條較濃的蛋白帶, 與預(yù)

20、期的Mr相符。放大培養(yǎng)后收集細(xì)菌,超聲破碎, 離心分離上清和沉淀, 分別進(jìn)行SDSPAGE分析, 發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要存在于沉淀中, 表明MASP1NGST融合蛋白為包涵體表達(dá)（圖2）。圖2 SDSPAGE分析重組表達(dá)產(chǎn)物（略）Fig 2 Analyses of the recombinant product by SDSPAGE1: Low molecular weight protein marker; 2: Total protein of pGEX4T1/BL21(DE3); 3: Ultrasound supernatant of pGEX4TMASP1N/BL21(DE3) befor

21、e induction; 4: Ultrasound supernatant of pGEX4TMASP1N/BL21(DE3) after induction; 5: Ultrasound deposit of pGEX4TMASP1N/BL21(DE3) after induction.2.3 重組蛋白的純化與鑒定 將收集的MASP1N BL21(DE3)菌體裂解液通過GSTrap層析柱純化后, 進(jìn)行SDSPAGE分析并用抗GST抗體對重組蛋白進(jìn)行Western blot分析, 發(fā)現(xiàn)在Mr 60000處有條帶（圖3）。純化的重組表達(dá)產(chǎn)物可與重組人MBLCLR蛋白結(jié)合, 也能和重組人MBL蛋

22、白結(jié)合（圖4）, 表明所獲表達(dá)產(chǎn)物具有結(jié)合MBL的活性, 確實(shí)是MASP1N蛋白。圖3 SDSPAGE和Western blot分析純化重組表達(dá)產(chǎn)物（略）Fig 3 Analysis of the purified recombinant product by SDSPAGE and Western blot1: Low molecular weight protein marker; 2: Recombinant MASP1N/GST purified by GSTrap; 3: Western blot analysis of the recombinant MASP1N/GST puri

23、fied by GSTrap.圖4 MASP1N蛋白與重組人MBL及重組人MBLCLR蛋白的結(jié)合（略）Fig 4 Binding of MASP1N pritein to rhMBL and rhMBLCLR proteins3 討論 人MASP1肽鏈包括6個結(jié)構(gòu)域, N端的CUB區(qū)、 EGF區(qū)和CUB區(qū), 隨后是2個CCP區(qū)和C 端SP區(qū)。本實(shí)驗中, 我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了人MASP1N蛋白, 包括N端2個CUB區(qū)和EGF區(qū), 即成熟MASP2肽鏈的N端280個氨基酸殘基。選用的pGEX4T1表達(dá)載體是一種融合表達(dá)質(zhì)粒, 含有高效Ptac 啟動子、 lacIq基因, 除了能表達(dá)外源蛋白外

24、, 還可使谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶（glutathiones transferase, GST）與外源蛋白融合表達(dá)從而增加表達(dá)產(chǎn)物的可溶性及產(chǎn)量。外源蛋白與GST蛋白的融合表達(dá)可以保護(hù)外源蛋白不易被降解, 外源蛋白與GST之間還具有腸激酶和凝血酶的識別位點(diǎn), 可以方便的切下GST, 使表達(dá)的目的蛋白的構(gòu)象及活性與天然蛋白更接近。我們將收集的工程菌體裂解液通過GSTrap柱純化后, 進(jìn)行SDSPAGE及Western blot分析, 發(fā)現(xiàn)有Mr約60000蛋白的表達(dá), 此蛋白與MASP1N/GST融合蛋白Mr計算值相符。將重組表達(dá)產(chǎn)物純化, 發(fā)現(xiàn)其能與重組的人MBLCLR和完整MBL蛋白結(jié)合, 表明所獲表

25、達(dá)產(chǎn)物確實(shí)具有MASP1結(jié)合MBL的活性。 在血漿中, 作為酶原的MASP與MBL分子結(jié)合形成復(fù)合體, 當(dāng)MBL的CRD識別、 結(jié)合病原微生物的糖結(jié)構(gòu)后, MASP酶原即活化, 從而激活補(bǔ)體凝集素途徑而發(fā)揮天然抗感染免疫效應(yīng)7。MASP1除能直接裂解C2外, 還具有凝血酶樣作用, 可裂解合成肽底物中的精氨酸或賴氨酸殘基所形成的肽鍵8, 裂解和激活凝血因子XIII和纖維蛋白原9。初步研究表明, N端的3個結(jié)構(gòu)域即2個CUB區(qū)和1個EGF區(qū)是MASP1與MBLCLR結(jié)合的區(qū)域, 能以Ca2+依賴方式與MBL相互作用10, 11, 但這種相互作用的詳細(xì)情況尚未明了。具有生物學(xué)活性的MASP1N蛋白的

26、獲得, 為進(jìn)一步探索MBL的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系、 MBL與MASP相互作用的機(jī)制提供了實(shí)驗材料?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Gadjeva M, Thiel S, Jensenius JC, et al. The mannan binding lectin pathway of the innate immune responseJ. Curr Opin Immunol, 2001, 13(1): 74-78.2 Kilpatrick DC. Mannanbinding lectin and its role in innate immunityJ. Transfus Med, 2002, 12(6): 335-342.3 陳政良. 補(bǔ)體激活第三途徑凝集素途徑J. 國外醫(yī)學(xué)·分子生物學(xué)分冊, 1999, 21(5): 295-298.4 陳政良, 盧 曉, 張麗蕓, 等. 人MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶1 cDNA的克隆與鑒定J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2000, 16(5): 417-419.5 蔡學(xué)敏, 左大明, 趙 娜, 等. 人MBLCLR表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 200