1、    載多肽和蛋白質(zhì)藥物的納米粒給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展        摘要：目的綜述近幾年在輸送多肽和蛋白質(zhì)藥物的納米粒給藥系統(tǒng)方面的研究進(jìn)展。方法分析有關(guān)文獻(xiàn)資料，從納米粒給藥系統(tǒng)的載體材料選擇、制備方法、體外釋藥及應(yīng)用等方面進(jìn)行了概述。結(jié)果納米粒給藥系統(tǒng)可有效延長多肽和蛋白質(zhì)藥物的釋放，同時可提高此類藥物的生物利用度。結(jié)論納米粒給藥系統(tǒng)在輸送多肽和蛋白質(zhì)藥物方面有著廣闊的研究和應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：多肽；蛋白質(zhì)；納米粒給藥系統(tǒng)中分類號：R94文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1001-2

2、494(2000)07-0437-04近年來, 隨著基因工程及生物技術(shù)的發(fā)展, 出現(xiàn)了許多用于預(yù)防和治療疾病的多肽與蛋白質(zhì)藥物1。但由于多肽與蛋白質(zhì)藥物能迅速被胃腸道消化酶降解破壞，臨床應(yīng)用受到很大限制, 加之此類藥物的生物半衰期普遍較短，故需頻繁注射給藥, 造成患者心理和身體的痛苦，即使皮下或肌內(nèi)注射給藥，低的生物利用度仍不可避免。另外, 由于多數(shù)多肽與蛋白質(zhì)類藥物具有較低的分配系數(shù)和很小的擴(kuò)散性能，使得藥物不易被親脂性膜所攝取，很難通過生物屏障。許多學(xué)者嘗試了對藥物進(jìn)行化學(xué)修飾、制成前體藥物、應(yīng)用吸收促進(jìn)劑、使用酶抑制劑防止酶解、采用醫(yī)學(xué)工程技術(shù)如離子電滲法增加藥物透皮吸收及設(shè)計各種給藥系

3、統(tǒng)解決上述問題。其中，納米粒給藥系統(tǒng)具有獨(dú)特的藥物保護(hù)作用及控制釋放特性。而日益受到關(guān)注。本文對載多肽與蛋白質(zhì)藥物納米粒給藥系統(tǒng)研究中較重要的環(huán)節(jié)，如載體材料的選擇、制備工藝及影響因素、體內(nèi)外釋放特性、體內(nèi)過程及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。1載多肽與蛋白質(zhì)藥物納米粒給藥系統(tǒng)的制備1.1納米粒定義及藥物的特性納米粒(nanoparticle)是粒徑小于1m的聚合物膠體給藥體系。按制備過程不同可分為納米球(nanospheres) 和納米囊(nanocapsules)。制備優(yōu)良的納米粒給藥系統(tǒng)，首先必須要考慮多肽與蛋白質(zhì)藥物的特性，如化學(xué)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、生物半衰期、給藥方式以及藥動學(xué)和此類藥物的生物節(jié)律性。其中

4、，穩(wěn)定性由于受到納米粒制備過程中諸如有機(jī)溶劑的使用、加熱及超聲方法的影響較突出，而改善其穩(wěn)定性的方法主要包括：加入鹽或電解質(zhì)，以提高熱穩(wěn)定性和減少可逆變性；加入親水高分子化合物如甘露糖、明膠、羧甲基纖維素鈉等，可在藥物表面形成水化層起到保護(hù)作用；加入磷脂類化合物；進(jìn)行化學(xué)修飾提高多肽的熱穩(wěn)定性，延長體內(nèi)半衰期23。1.2制備納米粒載體材料的選擇制備納米粒的載體材料可分為生物降解型和非生物降解型兩種。生物降解型包括：聚(-羥基酸)，如聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物和聚(羥基丁酸)等；交鏈聚酯，如聚丙交酯、聚(-己內(nèi)酯) 及聚氰基丙烯酸烷基酯等；聚原酸酯；聚酐和多肽。非生物降解型包括：聚甲基

5、丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚酰胺等。因多肽與蛋白質(zhì)的擴(kuò)散速度非常慢，給藥系統(tǒng)釋放藥物主要依賴載體聚合物材料的降解，而生物降解高分子材料在體內(nèi)水解酶的作用下水解為單體，最終的產(chǎn)物為水及二氧化碳，避免了釋完藥物后通過手術(shù)取出載體材料的麻煩，故生物降解型載體材料應(yīng)用日益廣泛。眾多學(xué)者對生物降解材料的化學(xué)水解降解機(jī)制做了研究，證實(shí)了酶催化降解的可能。1.3載藥納米粒的制備方法納米粒給藥系統(tǒng)的制備方法由于載體材料的不同而存在很大差異，Allemann等4對納米粒制備方法及后處理方法做了系統(tǒng)的闡述，本綜述就某些方法做必要的補(bǔ)充。Niwa等5采用W/O乳化-蒸發(fā)方法制備了載有親水性多肽藥物促黃體激素釋放激素類似

6、物 (nafarelin acetate,NA)的納米球，包封率較o/w法提高了數(shù)倍，其缺點(diǎn)是需要大量的油及有機(jī)溶劑。Maria等6設(shè)計了雙乳化-溶劑蒸發(fā)法制備載有L-門冬酰胺酶(L-asparaginase)的納米球，并采用超聲乳化技術(shù)制得粒徑200 nm左右的納米粒,藥物包封率達(dá)到40%。Niwa等7利用沉淀法制備了載NA的納米球，制備中使用了二氯甲烷和丙酮的混合溶劑，聚合材料為丙交酯-乙交酯嵌段共聚物(PLGA)，得到粒徑為200 nm左右、包封率為10的納米粒，并討論了通過加入磷脂類物質(zhì)提高藥物的包封率，雖有所改善，但是對親水性藥物包封不理想。沉淀法對包封親脂性多肽與蛋白藥物(如環(huán)孢素

7、A, cyclosporine A)具有獨(dú)特的優(yōu)勢，操作簡單，且粒徑小，包封率高，具有重要的意義。另外，值得注意的是在親水多肽-胰島素(insulin)非注射給藥研究中，以聚氰基丙烯酸異丁酯(PIBCA)為載體，采用界面縮聚技術(shù)，不僅包封率高，而且很好地保護(hù)藥物，從而使這方面的研究得到更深入開展。納米粒給藥系統(tǒng)的制備方法多種多樣，方法選擇必須考慮藥物與載體材料的性質(zhì)，選取合適的溶劑或共溶劑及與之相適應(yīng)的儀器，以達(dá)到最優(yōu)組合。2載藥納米粒給藥系統(tǒng)的體外釋放研究研究納米粒給藥系統(tǒng)的體外釋放，須考慮以下幾個可能的機(jī)制：由于聚合物材料的融蝕或降解而釋放藥物。多肽與蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)孔洞自發(fā)擴(kuò)散釋放。藥物從

8、聚合材料表面釋放。由于波動磁場或聲場的誘導(dǎo)而產(chǎn)生脈沖式釋放。通常，以上機(jī)制同時存在。相比較而言，藥物經(jīng)孔洞自發(fā)擴(kuò)散釋放機(jī)制顯得不太重要，因為多肽與蛋白質(zhì)類藥物如能輕易從由于相分離及藥物溶解而造成的水性通道擴(kuò)散出來，那么納米粒系統(tǒng)的藥物包封率就可能極低。實(shí)際上，聚合物表面的藥物釋放及聚合物材料降解而造成的藥物釋放是最重要的，這就是“爆釋效應(yīng)”(burst effect)常被觀察到的原因。納米粒釋放多肽與蛋白質(zhì)類藥物的典型曲線可分為三相：起始突釋相、擴(kuò)散控釋相和降解控釋相。起始突釋相是指位于粒子表面或近表面的蛋白質(zhì)、多肽在幾小時內(nèi)快速釋放; 擴(kuò)散控釋相是蛋白質(zhì)通過粒子表面孔道擴(kuò)散釋放。為獲得藥物的

9、連續(xù)釋放，擴(kuò)散控釋相必須與降解控釋相重疊，聚合物降解形成的孔隙使包裹的蛋白質(zhì)連續(xù)釋放。國外學(xué)者研究了聚氰基丙烯酸烷酯 (PACA)納米粒的體外釋藥特性，其所選模型藥物為生長激素釋放因子(GRF)。結(jié)果顯示，GRF從納米粒中的釋放不是由于多肽從聚合物骨架中被動擴(kuò)散引起的，而是因為聚合物骨架的不斷生物融蝕造成的。實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)，藥物的釋放依賴于介質(zhì)中酯酶的濃度，在鼠血漿中，由于酯酶濃度高,而使GRF的釋放明顯加快。另外，隨著GRF的釋放，實(shí)驗介質(zhì)的濁度隨之下降,此現(xiàn)象可解釋為：PACA的生物融蝕是由于聚合物的側(cè)醚鏈經(jīng)酯酶水解造成的，而水解結(jié)果是生成了水溶性的化合物，從而使體系的濁度下降；同樣，因為聚合

10、物生物融蝕非常慢，造成體系濁度非常緩慢的下降以致藥物釋放時間大大延長,這些事實(shí)都可證明GRF的釋放是由于聚合物的生物融蝕直接造成的。Tasset等8制備了載降鈣素 (calcitonin) 的PIBCA納米粒，用同樣方法證實(shí)了上述結(jié)論。某些多肽與蛋白質(zhì)類藥物如胰島素給藥受體內(nèi)生理環(huán)境影響，呈現(xiàn)周期性或波動性，因此需要一種脈沖式釋藥系統(tǒng)。有報道利用波動磁場來實(shí)現(xiàn)脈沖式釋藥，其基本原理為：在磁場存在下，由于磁力作用使聚合物鏈分離，導(dǎo)致大量的水滲透進(jìn)入體系中溶解部分包封的胰島素，并使聚合物骨架膨脹，增大了胰島素的被動擴(kuò)散；撤去磁場時, 在膨脹骨架中部分溶解的胰島素，只能以經(jīng)典擴(kuò)散方式釋放，從而達(dá)到了

11、控制藥物釋放的目的。另外，改變粒子表面的孔洞大小也可以調(diào)節(jié)藥物的釋放。有人研究了載多肽與蛋白質(zhì)類藥物的微粒 (粒徑1m) 給藥系統(tǒng)，并總結(jié)了多種制備方法并討論了影響包封率、粒徑及藥物釋放的因素，可作為納米粒相關(guān)研究的良好借鑒，尤其是影響釋藥的因素及減小“爆釋效應(yīng)”的措施9。3納米粒給藥系統(tǒng)的體內(nèi)研究及應(yīng)用3.1納米粒給藥系統(tǒng)的體內(nèi)靶向性納米粒由于粒徑小，進(jìn)入體循環(huán)后主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)( RES)中的白細(xì)胞、單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞吞噬，而RES系統(tǒng)主要包括肝、脾和骨髓。載藥納米粒進(jìn)入血管后，靶向作用于RES系統(tǒng)，這對于治療RES系統(tǒng)疾病(如內(nèi)臟利什曼病、細(xì)胞內(nèi)感染)有特殊的意義。但多數(shù)疾病病因并不

12、在RES系統(tǒng)中，因此如何使納米粒達(dá)到非RES系統(tǒng)的靶向給藥,是近幾年納米粒靶向給藥的研究重點(diǎn)。RES吞噬納米粒的機(jī)制為：納米粒進(jìn)入循環(huán)后,被血漿調(diào)理素的蛋白吸附，調(diào)理素能吸附外來物質(zhì)并加速RES對這些物質(zhì)的吞噬，最主要的調(diào)理素為補(bǔ)體和免疫球蛋白。由于RES系統(tǒng)對這種調(diào)理素具有特異的識別能力，故吸附了調(diào)理素的納米粒大部分被RES系統(tǒng)識別，并被具有吞噬功能的細(xì)胞所吞噬而達(dá)不到靶器官。根據(jù)文獻(xiàn)報道4，采取相應(yīng)措施減少RES系統(tǒng)對納米粒的吞噬，延長體內(nèi)循環(huán)時間的方法，主要集中在以下幾方面：直接降低RES系統(tǒng)的攝取活性。有人使用聚苯乙烯納米粒或用葡聚糖硫酸鹽溶液對RES 系統(tǒng)進(jìn)行抑制，結(jié)果雖較明顯，但經(jīng)

13、常對系統(tǒng)抑制則會損害其正常功能。高分子物質(zhì)包裹納米粒。常用的高分子物質(zhì)有聚乙二醇(PEG)、混合磷脂、非離子表面活性劑、分泌物IgA及血清成分等，其主要目的是提高納米粒表面的親水性及降低納米粒與調(diào)理素間的相互作用。研究結(jié)果證實(shí)，用PEG及非離子表面活性劑包衣的納米粒被肝、脾攝取減少，延長納米粒體內(nèi)循環(huán)時間效果明顯。體外磁性導(dǎo)向。有學(xué)者通過制備含磁性物質(zhì)(Fe3O4)的載藥納米粒，并外加磁場來達(dá)到靶向給藥?？贵w包衣納米粒。使用抗體包衣后不僅可延長循環(huán)時間， 而且可將納米粒選擇性地導(dǎo)向靶位。3.2納米粒給藥系統(tǒng)在輸送多肽與蛋白質(zhì)藥物方面的應(yīng)用3.2.1注射給藥納米粒經(jīng)靜脈給藥可被RES系統(tǒng)快速吞噬

14、、消除，使得包裹的藥物難以發(fā)揮正常藥效，故這方面的研究重點(diǎn)是在于如何延長納米粒的循環(huán)時間，以及如何保持藥物活性。納米粒經(jīng)皮下及肌內(nèi)注射給藥可起到明顯的緩釋作用，并提高多肽、蛋白質(zhì)類藥物的生物利用度。Damge10 等報道載有胰島素的生物降解PIBCA納米囊，經(jīng)皮下注射后，降血糖作用可持續(xù)24 h。Gautier11等進(jìn)行了生物降解的聚氰基丙烯酸異己酯(PIHCA)包封GRF的體內(nèi)研究，發(fā)現(xiàn)載GRF的納米粒經(jīng)皮下給藥后較普通制劑出現(xiàn)的“爆釋效應(yīng)”明顯減輕，且GRF的血漿水平持續(xù)24 h，緩釋作用顯著，AUC024結(jié)果比較(游離GRF為27 ng*min*ml-1,GRF納米粒為505 ng*mi

15、n*ml-1)表明，納米粒提高了此多肽藥物的生物利用度，這是由于包封在納米粒中的GRF避免了酶的大量降解，而游離GRF則無此保護(hù)，會很快在注射部位被代謝消除。載GRF的納米粒體內(nèi)緩釋作用也可通過標(biāo)記納米粒的方式證實(shí)，即采用放射自顯影技術(shù)，觀察給藥24 h后注射部位的納米粒情況，采用上述技術(shù)也可證實(shí)經(jīng)皮下注射的生物降解型聚合物是通過尿和糞便排泄的。Tasset等8同樣證實(shí)了載降鈣素的PIBCA納米粒，經(jīng)皮下注射后，達(dá)到明顯的緩釋釋放藥物的作用，同時提高了藥物的生物利用度，值得注意的是，由于制備方法不同而得到的鍵合型藥物載體納米粒具有更好的延緩釋放性能。3.2.2口服給藥由于多肽與蛋白質(zhì)類藥物的特

16、殊理化性質(zhì)，此類藥物直接口服后效果很差，其主要原因為:胃中的酸催化降解。胃腸道中的消化酶作用。胃腸道粘膜的低通透性。通過吸收屏障后肝的首過作用。納米粒作為多肽與蛋白質(zhì)類藥物的載體，經(jīng)口服后主要通過小腸的Peyer's結(jié)而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)（主要是被Peyer's結(jié)中的M細(xì)胞攝?。?同時，由于納米粒的粒徑較小，可穿過腸系膜的細(xì)胞間通路進(jìn)入循環(huán)。上述機(jī)制主要依賴于粒子的粒徑、親脂性、電荷及聚合物的組成。Damge等10用PACA制備胰島素納米囊，經(jīng)糖尿病鼠口服給藥后，第二天血糖下降50%60%，降血糖維持時間隨胰島素劑量加大而延長。但同樣劑量的胰島素納米囊給正常鼠口服后并沒有引起血糖下降

17、，主要是因為正常鼠體內(nèi)具有自調(diào)節(jié)現(xiàn)象，但如何解釋具有長期的降血糖效果時遇到了困難。Lowe等12也對載胰島素的PIBCA納米囊的口服吸收做了研究，并對納米囊的小腸吸收機(jī)制及藥物與納米囊的作用方式等做了闡述，發(fā)現(xiàn)納米囊并不能促進(jìn)胰島素的吸收，只不過起到部分保護(hù)的作用。同樣，Bonduelle13等使用PIHCA為載體材料通過界面縮聚法制備環(huán)孢素A的納米囊，包封率高達(dá)88，進(jìn)一步的動物口服實(shí)驗表明，此種給藥系統(tǒng)能顯著提高藥物的生物利用度，并有效地減少肝和脾對藥物的攝取，同時，使藥物在腎臟中的分布減少，從而降低了環(huán)孢素A的腎毒性。載藥納米?？诜h(yuǎn)沒有達(dá)到人們的要求。一些學(xué)者試通過合用酶抑制劑(如抑肽

18、酶)，口服吸收促進(jìn)劑(如膽酸鹽)及表面活性劑(如普朗尼克F-68)等促進(jìn)納米粒的穿透作用，其結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。值得注意的是，許多學(xué)者在研究肽類物質(zhì)的口服吸收時，發(fā)現(xiàn)了經(jīng)生物降解聚合物包封的免疫制品(如疫苗)口服后具有明顯效果，使其倍受關(guān)注?？傊d多肽與蛋白質(zhì)類藥物的納米?？诜o藥研究雖已取得了很多寶貴的經(jīng)驗，但眾多影響粒子吸收的因素還不清楚，小粒子透過粘膜的機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)，這些有礙于納米粒口服給藥的應(yīng)用。3.2.3眼部給藥由于眼的特殊構(gòu)造、淚液的沖刷以及角膜皮層的親脂結(jié)構(gòu)，多數(shù)水溶液形式的滴眼液用后生物利用度差，其它的形式如眼膏及植入劑又使用不便和難以被患者接受，眼部給藥長期困擾著人們

19、。因此，如何延長滴眼液在眼部停留的時間，提高藥物的生物利用度，是相關(guān)研究的關(guān)鍵。國外學(xué)者研究了標(biāo)記的聚己基丙烯酸烷酯(PHCA)納米粒眼部給藥后的組織分布。研究表明，由于納米?？膳c角膜和結(jié)膜表面活性粘附，從而延緩了被清除的速度，可在眼部停留較長時間。研究證實(shí)聚氰基丙烯酸丁酯( PBCA )納米粒主要集中在眼部的內(nèi)眼角及眼外區(qū)而不是角膜表面。研究發(fā)現(xiàn)PBCA 經(jīng)角膜吸收后能引起細(xì)胞膜的破損，而使用聚(-己內(nèi)酯)(PECL)為載體的納米囊卻無此缺點(diǎn)，且PECL 在盲管中聚集，從而延長藥物的作用時間?；谏鲜龅睦碚?，Pilar等14制備了載環(huán)孢素A的PECL納米囊，并對包封率、體外釋放及影響因素、體

20、內(nèi)的組織分布等做了較系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明，不僅環(huán)孢素A的包封率很高(50%，藥物/聚合物)，而更重要的是PECL納米囊大大促進(jìn)了環(huán)孢素A的穿透，使藥物生物利用度顯著提高，為研制新的眼部給藥系統(tǒng)開辟新的途徑。PECL納米囊眼部給藥系統(tǒng)在某些領(lǐng)域，如減小聚合材料的毒性、設(shè)計滅菌方法以及長期穩(wěn)定性方面還要進(jìn)行深入的研究。4結(jié)論與展望在過去20年中, 對納米粒給藥系統(tǒng)，特別是作為多肽與蛋白質(zhì)藥物輸送的載體進(jìn)行了廣泛的研究。納米粒的制備方法可選擇性大，載體材料豐富，人們可以根據(jù)藥物的特性，選擇最佳的方法和最合適的材料以達(dá)到高的包封率及良好的體內(nèi)、外釋藥過程。在純化、滅菌及提高納米粒制劑穩(wěn)定性方面同樣取得

21、了滿意的結(jié)果。納米粒作為輸送多肽與蛋白質(zhì)類藥物的載體是令人興奮的，這不僅因為納米?？筛倪M(jìn)許多肽類藥物的藥動學(xué)參數(shù)，而且在一定程度上可以有效地促進(jìn)肽類藥物穿透生物屏障。在納米粒應(yīng)用方面，最重要的仍然是通過包封藥物來改進(jìn)肽類藥物的注射給藥，已證實(shí)了經(jīng)注射給藥的納米粒給藥系統(tǒng)的可能性，但需注意RES系統(tǒng)的吞噬作用。雖然口服納米粒后的吸收機(jī)制有待深入研究，且即使藥物能透過胃腸粘膜屏障，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的藥物濃度極其有限, 但用納米粒包封低擴(kuò)散性的藥物可提高其口服吸收的事實(shí)，表明了納米?？诜o藥仍具有研究價值。不可否認(rèn)，大量數(shù)據(jù)證實(shí)納米粒在口服輸送抗原方面的巨大潛力。這主要取決于口服給藥后, M細(xì)胞對粒子的

22、攝取特征及有限劑量的抗原即可獲得足夠免疫力的優(yōu)勢。納米粒在其它方面的應(yīng)用（如眼部）同樣有發(fā)展前景?？傊?，納米粒給藥系統(tǒng)作為多肽與蛋白質(zhì)類藥物發(fā)展的工具有著廣泛的應(yīng)用前景，但最終的成功依靠醫(yī)藥工業(yè)的巨大發(fā)展：不斷研制出新的藥物及載體材料，不斷開發(fā)它們的治療潛力、安全性，探討藥物與載體材料的相互作用方式，而目前最重要的任務(wù)是闡明納米粒的吸收機(jī)制和RES系統(tǒng)吞噬納米粒的機(jī)制。馬利敏（北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院藥劑科，北京100044）李玉珍（北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院藥劑科，北京100044）張強(qiáng)（北京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑研究室，北京100083）參考文獻(xiàn)1王浩.多肽與蛋白質(zhì)類藥物給藥系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀J.中國醫(yī)藥工

23、業(yè)雜志，1994，25(9):421426.2方宏清.多肽類藥物制劑研究現(xiàn)狀J. 藥學(xué)進(jìn)展, 1998, 22(1):1620.3Matsushima A, Kodera Y, Inada Y.Chemical modification of protein drugs with PEG derivativesJ.Drug Delivery Syst,1995,10(1):512.4Allemann E.,Guvny R,Doelker E.Drug-loaded nanoparticles-preparation methods and drug targeting issuesJ.Eur

24、J Pharm Biopharm,1993,39(5) : 173191.5Niwa T, Takeuchi H, Hino T, et al. Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: preparation of DL-PLGA nanospheres with NA by a novel emulsion-phase seporation method in an oil systemJ.Int J Pharm, 1995,121(1):4554.6Maria MG,Blanco D,Cruze MEM,et al. Form

25、ulation of L-asparaginase-loaded PLGA nanoparticles: influence of polymer properties on enzyme loading activity and in vitro releaseJ.J Controlled Release,1998, 52(1/2):5362.7Niwa T , Takeuchi H, Hino T, et al.In vitro drug release behavior of DL-PLGA nanospheres with NA prepared by a novel spontane

26、ous emulsification solvent diffusion methodJ.J Pharm Sci,1994,83(5):727732.8Tasset Ch , Barette N,Thysman S.Polyisobutycyanoacrylate nanoparticles as sustained releade system for calcitoninJ.J Controlled Release,1995,33(1):23-30.9Cleland JL，Jones AJS.Stable formulations of recombinart human growth hormone and interferon-r for microencapsulation in biodegradable microspheresJ.Pharm Res,1996, 13(10):14641475.10Damge C , Michel C, Apr