1、地鱉纖溶蛋白對荷S180和H22小鼠的抑瘤作用研究        【摘要】     目的研究地鱉蟲纖溶活性先導蛋白（EFP）對荷S180和H22小鼠腫瘤的抑制作用。方法通過體外實驗，構建荷瘤小鼠模型，藥物實驗分為陽性對照組（環(huán)磷酰胺），陰性對照組（生理鹽水），藥物高濃度組、中濃度組和低濃度組。實體瘤通過瘤重計算抑瘤率，腹水瘤通過細胞濃度計算抑瘤率。結果EFP對S180腹水瘤有較好的抑制率， 藥劑量為2.90mg/kg的抑制率為69.56%，明顯高于環(huán)磷酰胺(20mg

2、/kg)的51.75%的抑制率；EFP對S180實體瘤有較好抑制作用，藥劑濃度為1.45 g/kg時，抑制率為37.48%，高于環(huán)磷酰胺(20 mg/kg)的35.59%的抑制率，并呈現一定的藥物劑量依賴性；藥劑濃度為0.73 mg/kg時，對H22實體瘤抑瘤率為41%，高于環(huán)磷酰胺(20 mg/kg)的37%的抑制率。結論EFP對荷S180和H22小鼠腫瘤有較好的抑制作用。     【關鍵詞】  地鱉蟲纖溶活性先導蛋白； S180細胞； H22細胞； 抑瘤作用    The Antitumour Eff

3、ect of  Eupolyphaga Fibrinolyric Protein on S180 and H22 in vivoLIU Hao, HAN Yali, DING Hong, LI Ziwei(Faculty of Light and Chemical Industry,Guangdong University of Technology,Guangzhou 510006, China; Department of Biology,Jieyang College,Jieyang 522000, China)Abstract：ObjectiveTo investigate

4、the antitumor effect of Eupolyphaga fibrinolyric protein on S180 and H22 in vivo. MethodsTumor-bearing mouse model was built in vivo, and the experiments were divided into positive control group (cyclophosphamide), negative control group (saline), the high concentration drug group, the middle concen

5、tration drug of group,  the low concentration of drug group .The inhibition rate against ascites tumor was calculated by the tumer weights and the rate anainst solid tumor was calculated by the concentration of cellsResultsEFP had significant inhibition against S180 ascites tumor, when the dose

6、 of drug was 2.90 mg/kg, the inhibition rate was 69.56%, higher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (51.75%). EFP had preferably inhibition against S180 solid tumors, when the dose of drug was 1.45 mg/kg, the inhibition rate was 37.48%, higher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (35.59%),

7、and a certain dose-dependent .When the drug concentration was 0.73 mg/kg, the H22 solid tumor inhibition rate was 41%, higher than that of cyclophosphamide (20 mg/kg) (37%).ConclusionEFP has obvious antitumor effect on S180 and H22 in vivo.Key words：Eupolyphaga fibrinolyric protein；  S180 cell

8、line；  H22 cell line；  Antineoplastic activity   藥用地鱉在祖國醫(yī)學中是一味重要的活血化瘀藥材，具有破淤血、續(xù)筋骨、消腫止痛等藥用功效1，臨床主要用于淤血阻滯,癥瘕積聚,跌撲損傷等癥。中醫(yī)處方亦用其治療腫瘤，目前將其用于治療消化道腫瘤的較為普遍2。本實驗室在進行中藥抑瘤活性成分研究中,以地鱉蟲Eupolyphaga sinensis Walker為材料，分離純化到一組纖溶活性蛋白（fibrinolytic proteins from Eupolyphaga sinensis, EFP），并發(fā)現該活性蛋白對部

9、分腫瘤細胞有顯著的細胞毒性作用3。本文在建立了H22和S180荷瘤小鼠的基礎上，檢測了EFP提取物對該荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用, 旨在探討EFP的抑瘤作用,為地鱉抗腫瘤活性有效成分的進一步純化和作用機制的研究奠定基礎。1  材料1.1  藥物地鱉蛋白以韓雅莉等4方法制備，將凍存地鱉（-80）置4解凍，稱重，按11(V/V)與預冷0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH7.2)混和勻漿，再按15加入該緩沖液，靜置抽提（4，12 h），離心（4，8 000 r/min，15 min），棄沉淀，上清中加入適量硫酸銨，以鹽析法提取蛋白質，收集飽和度35%70%的鹽析組分（蛋白），蒸餾水透

10、析除鹽，過DEAE-纖維素陰離子柱，分段收集洗脫蛋白組分，以纖溶平板檢測各管液體的纖溶活性，合并具纖溶活性各管液體，真空冷凍干燥成粉末，置-20保存?zhèn)溆谩－h(huán)磷酰胺（CTX），山西普德藥業(yè)有限公司。1.2  動物與細胞清潔級KM小鼠，體質量（20±2）g，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。小鼠肉瘤細胞株（S180），由廣東省第二中醫(yī)院研究所提供；小鼠肝癌H22，由廣州生物醫(yī)藥與健康研究所提供。1.3  試劑RPMI 1640培養(yǎng)基,北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司；小牛血清, Hyclone，新西蘭PERBIO SCIENCE 公司 ；胰蛋白酶，北京鼎國

11、生物技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO），美國AMRESCOO公司產品；環(huán)磷酰胺（CTX），山西普德藥業(yè)有限公司。2  方法2.1  纖溶活性的測定參照文獻5的方法,制備纖維蛋白平板,在平板上打孔(直徑7.0 mm),加入待測樣品，對照孔加0.01 mol/L 20 l緩沖液,置37保溫至溶圈清晰可辨，約24 h, 考馬斯亮藍R250染色后，脫色液脫色后觀察，測量溶圈兩垂直直徑,以UK為標準品, 檢測地鱉纖溶活性蛋白的纖溶活性。以考馬斯亮藍法和蒽酮法測定凍干蛋白中糖含量和蛋白含量。2.2  S180腹水瘤與實體瘤實驗將凍存S180腫瘤細胞于37 1 min內復蘇，

12、1 000 r/min離心5 min，去上清，以RPMI1640含15%小牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞生長至對數期，1 000 r/min離心5min，適量生理鹽水稀釋瘤細胞懸液,細胞數為107 /ml, 取3只正常小鼠，每鼠腹腔注入0.2 ml腹水瘤細胞懸液, 制備惡性腹水瘤小鼠模型。10d后，選取生長良好的S180荷瘤小鼠(腹水型), 無菌條件下抽取腹水，以生理鹽水11稀釋制成瘤細胞懸液，每鼠腹腔注入0.2ml使之形成腹水型荷瘤狀態(tài)；將另40只小鼠,每鼠左側腋窩皮下接種0.2 ml瘤細胞懸液（約含瘤細胞106), 使之形成惡性實體瘤荷瘤狀態(tài)，每日觀察記錄。    接種

13、翌日小鼠腹腔注射藥物，將40只S180腹水瘤小鼠隨機分5組（8只/組），陽性對照組注射20 mg/kg環(huán)磷酰胺，陰性對照注射0.2 ml生理鹽水、藥物高劑量組注射1.45 mg/kg，中劑量組注射0.725 mg/kg，低劑量組注射0.363 mg/kg（EFP藥物劑量均參照本室EFP治療S180荷瘤小鼠的最佳劑量），均為1次/d，連續(xù)8 d。同樣，接種實體瘤24 h后對小鼠進行腹腔注射藥物處理，將40只S180荷瘤小鼠隨機分5組（8只/組），分組情況與注射藥物均與腹水瘤小鼠相同，均為1次/d，連續(xù)處理9 d。2.3  H22荷瘤小鼠模型建立及藥物處理將凍存H22腫瘤細胞與上述相同方

14、法復蘇、培養(yǎng)、制備H22腹水瘤小鼠模型，抽取H22荷瘤小鼠(腹水型)腹水制成瘤細胞懸液，取其0.2 ml注入無瘤小鼠右側腋窩下使之形成惡性實體瘤荷瘤狀態(tài)。24 h后,對其進行腹腔注射藥物處理，將40只小鼠隨機分5組（每組8只），陽性對照組，每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg/kg,陰性對照組小鼠腹腔注射0.2 ml生理鹽水，藥物處理組藥物劑量均參照本室EFP治療S180荷瘤小鼠的最佳劑量，藥物高劑量組每日注射1.81 mg/kg,中劑量組每日注射1.45 mg/kg,和低劑量組每日注射0.725 mg/kg，均為1次/d，連續(xù)處理7 d。    對上述實驗各組均于

15、每次給藥后測量小鼠體質量。S180腹水瘤小鼠于最后一次給藥24 h后，抽取腹水，測定每只小鼠腹水體積和細胞濃度。S180與H22實體瘤小鼠，均于最后一次給藥后24h后取瘤塊和脾臟，稱重。比較各組脾系數間差異；分析各組動物平均體重變化，依以下公式計算抑瘤率和器官系數。    抑瘤率()= (對照組平均細胞濃度-給藥組平均細胞濃度)對照組平均細胞濃度×100抑瘤率()= (對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)對照組平均瘤重×1002.4  統(tǒng)計學處理實驗結果采用完全隨機設計的方差分析, 組間差異用Excel進行t檢驗，以=0.05為檢驗水準，

16、通過SPSS 11.5數據統(tǒng)計軟件計算結果。2.5  細胞培養(yǎng)實驗2.5.1  含藥血清制備將25只小鼠分為陽性對照組、陰性對照組、藥物高劑量組（2.90 mg/kg）、中劑量組（1.45 mg/kg）和低劑量組（0.73 mg/kg），各組均腹腔給藥2次/d，0.2 ml/次, 連續(xù)3 d。末次給藥前禁食4 h，自由飲水，末次給藥后2 h眼球取血，室溫靜置2 h，分離血清，56 30 min滅活，分別以DMEM和1640不完全培養(yǎng)基稀釋至20%血清，220nm濾膜過濾除菌，-20冰箱保存?zhèn)溆谩?.5.2  MTT檢測小鼠肝癌H22用含10%胎牛血清、100 U/

17、 ml青霉素和100 U/ ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。置37,5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng),呈對數生長期細胞用于實驗。2.5.3  MTT法檢測含藥血清及EFP對細胞增殖的反應取對數生長的H22細胞，以1×106 ml-1×50 l/孔的接種量接種于96孔培養(yǎng)板,分別加入濃度為20%的含EFP血清（0.73，1.45，2.9 mg/kg)、環(huán)磷酰胺含藥血清（20 mg/kg），生理鹽水含藥血清各50 L；另一組加入不同濃度的EFP（1，0.5，0.2，0.1，0.05，0 mg/ml）和陽性對照順鉑（50 mg/ml）各50l，各有5個平行孔，同時設調零

18、孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），繼續(xù)培養(yǎng)44 h，加PBS配置除菌的MTT(5 mg/ml)，10 l孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清，加入DMSO 100 l孔，輕振混勻，10 min后酶標儀測定（波長490 nm和630 nm）A值。作組間t檢驗，依A值按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率:    抑制率（）=(對照組A值-含藥血清組A值)/空白血清組A值×1003  結果3.1  EFP分離純化與成分測定地鱉經勻漿、鹽析和透析得到EFP粗提物，將其過DEAE-52離子交換纖維素離子交換柱層析分離，經1 mol/L NaCl梯度洗

19、脫，洗脫液經核酸蛋白檢測儀檢測，出現了2個蛋白峰，其中峰1蛋白含量極低，峰2蛋白含量較高。因而，收集峰2樣品。峰2蛋白經SDS-PAGE檢測，根據標準蛋白計算EFP的3個蛋白亞基EFP1、EFP2、EFP3，相對分子質量分別為74.9KD，71.5KD，65.2KD。    參照尿激酶標準曲線測得凍干蛋白的纖溶活力為20 U/mg。經蒽酮法和考馬斯亮藍法測定地鱉纖溶蛋白凍干粉中糖含量為82.8%，蛋白質含量為17.2%。3.2  EFP對小鼠S180腹水瘤的抑制作用實驗結果表明高、中兩個EFP劑量組和環(huán)磷酰胺均能顯著抑制S180腹水的生成，減少瘤細胞數量

20、，高劑量EFP抑瘤率達69.56%；中劑量EFP抑瘤率為30.76%，小鼠的生長狀態(tài)良好，而低劑量EFP抑瘤效果很差，抑瘤率僅為3.98%。結果見表1。與生理鹽水組相比3個EFP處理組瘤細胞數量均明顯減少，其中，高劑量組最為顯著，中劑量組次之，低劑量組與環(huán)磷酰胺組相似。表明EFP對S180腹水瘤抑制效果明顯。表1  EFP對S180腹水瘤的抑制作用（略）3.3  EFP對小鼠S180、H22實體瘤的抑制作用實驗結果表明，高、中、低3個EFP劑量組和環(huán)磷酰胺均能抑制S180實體瘤的生長，高劑量EFP抑瘤率為37.48%，中劑量EFP抑瘤率為34.37%，低劑量EFP抑瘤率為2

21、5.77%，環(huán)磷酰胺抑瘤率35.59%。結果見表2，但該組小鼠體質量和脾重均最小，生理鹽水組其次，而EFP 3個藥物組體質量和脾增重最高，表明EFP毒性較低。結果見表2。表2  EFP對S180實體瘤的抑制作用（略）EFP對H22實體瘤作用結果見表3。高，中，低3個劑量結果來看，低劑量組的抑制率最高，達41%，中劑量組抑瘤率為36%，與環(huán)磷酰胺抑瘤率37%相似，高劑量抑瘤效果反而較差，抑瘤率僅為24%。環(huán)磷酰胺組小鼠體重和脾重最小，生理鹽水組其次，藥物組最高。表3  EFP對H22實體瘤的抑制作用（略）3.4  EFP含藥血清及EFP對細胞增殖的反應不同濃度的EF

22、P含藥血清和EFP分別作用于H22細胞株，于48 h采用MTT法檢測各組血清對H22細胞株增殖的抑制率（見表45）。結果表明，兩組EFP含藥血清組對H22細胞的增殖均有抑制作用，抑制作用呈一定的量效和時效關系，即隨著含藥血清濃度的增加，抑制率逐漸增加；而各組EFP對H22細胞的增殖則沒有抑制作用，反而對其具有明顯促進作用，說明EFP沒有細胞毒性。表4  EFP小鼠含藥血清對H22細胞抑制作用 （10%），表5  EFP對H22細胞抑制作用（略）。4  討論   目前臨床抗癌藥物主要為化療劑，其對腫瘤細胞有直接抑制和殺傷作用，但是，傳統(tǒng)的化療主要

23、著眼于對癌細胞的殺傷，藥物存在難以避免的毒副作用，如化療藥物對正常分裂細胞毒性很強，極易造成患者白細胞與血小板減少以及貧血等骨髓抑制癥狀，成為制約其進一步發(fā)展的障礙，再者，腫瘤細胞對化療劑易產生抗藥性，也是導致抗癌治療失敗的主要原因之一。近年來,研究發(fā)現中草藥無論在抑制腫瘤細胞,還是在腫瘤的病后調理、改善體征、減輕放、化療不良反應等方面均發(fā)揮了重要作用6。臨床實踐證明一些復方的覆蓋面較廣，但是作用較弱；而一些單味中藥定向作用于某些腫瘤，且抑瘤效果顯著7。   地鱉為我國傳統(tǒng)中藥，具有顯著活血化瘀與抑瘤功效,但其纖溶作用與抑癌作用有何內在相互聯(lián)系,目前尚未見有關報道，本實驗從

24、地鱉中分離純化得到的纖溶活性蛋白(EFP)，前期實驗已證明其具顯著抑制血管生成的作用8。 通過本文實驗證明,EFP無明顯細胞毒作用,而對荷瘤小鼠卻存在顯著的抑瘤效果,在EFP濃度2.90 mg·kg-1對S180腹水瘤、2.18 mg·kg-1對H22肝癌和0.731.45 mg·kg-1對S180實體瘤的荷瘤小鼠的腫瘤生長有明顯抑制作用, 在S180實體瘤實驗中，高濃度EFP對小鼠的抑瘤率與環(huán)磷酰胺相似，在H22實體瘤實驗中，在低濃度（0.73 mg·kg-1）下，抑瘤率最高，通過脾重測定，可知在高濃度下小鼠脾重最大，說明，地鱉蛋白對S180和H22腫

25、瘤細胞均具一定的抑制作用，且抑制效果和環(huán)磷酰胺相差無幾。實驗表明EFP對S180等細胞無殺傷效果，說明EFP抗腫瘤作用不是通過直接殺傷腫瘤細胞，我們認為EFP對小鼠移植瘤的生長抑制作用很可能與其纖溶酶活性有關，與纖溶酶抑制腫瘤血管生成關系密切。    許多疾病的病理過程都涉及到新生血管生成，包括腫瘤生長等疾病。早在1971年Folkman就提出了“腫瘤生長依賴血管生成”的觀點，并提出了“抑瘤與抗血管生成的概念”。近年來大量研究已證明腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到至關重要的作用，腫瘤組織既可通過腫瘤血管從宿主獲取營養(yǎng)和氧氣，又可通過腫瘤血管向機體的其他部位輸送轉

26、移細胞，繼續(xù)生長和誘導血管形成，導致腫瘤轉移9。中醫(yī)也認為腫瘤的發(fā)生是由于正氣不足，臟腑功能失調，氣滯、血淤、痰凝、毒聚而形成?，F代醫(yī)學證實，癌癥患者血液（漿）多呈高粘高凝狀態(tài)，這不僅阻礙藥物對腫瘤細胞的直接殺傷作用，而且有助于癌細胞的轉移、定居和增殖?；钛僦兴幰职├碚撎岢?，活血化淤中藥通過改善患者血液黏滯狀態(tài)，改善血液循環(huán),增加局部血流量,改善局部缺氧,而抑制瘤栓的形成，使腫瘤細胞不能在血循環(huán)中存活10，這樣對血瘤細胞起到了直接或間接的抑殺作用，從而達到防治惡性腫瘤血行轉移的目的，同時也使抗癌藥物及其它成分易于深入瘤體而充分發(fā)揮作用。    有關研究表明，活血化淤藥物影響腫瘤生長及轉移機制與抑制新生血管生成關系密切，有關研究證明纖溶活性蛋白酶及其活性產物,可以大量降解腫瘤細胞外基質,使腫瘤細胞喪失生存的環(huán)境基礎,而且導致腫瘤組織自身的降解,反而不利于腫瘤的侵襲轉移11，纖溶活性物質具有抑制內皮細胞增生，從而阻礙腫瘤血管的形成和腫瘤轉移灶建立的作用?；谏鲜隼碚?，我們認為EFP的抑瘤效應可能與其對腫瘤新生血管的抑制作用有關。為此，我們認為EFP很可能是地鱉中的一種有效、低毒的抗腫瘤成分，其主要有望在抑制腫瘤生長和轉移方面發(fā)揮效應，是一個具有應用前景的抗腫瘤天然藥物。