1、真菌2572的抗白細(xì)胞介素6受體活性成分研究         09-08-27 11:50:00     編輯：studa20                  作者：鄒迎曙 張洋 姜蓉 李元 吳劍波 【摘要】  目的 從真菌25

2、72的代謝產(chǎn)物中分離白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)拮抗劑。方法 利用多種色譜技術(shù)對活性部位進(jìn)行分離純化，并根據(jù)MS、NMR等光譜方法對化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果 從真菌2572代謝產(chǎn)物活性部位中得到兩個化合物2572A和2572B。結(jié)論 2572A已知為6-epi-5-hydroxymycosporulone，有IL-6R拮抗活性，2572B為核黃素，活性較弱。  【關(guān)鍵詞】  白細(xì)胞介素6受體拮抗劑； 6-epi-5-hydroxymycosporulone； 核黃素； 結(jié)構(gòu)研究  

3、0;  ABSTRACT  Objective  To isolate IL-6R antagonists from the cultured broth of the fungus 2572. Methods  The compounds were separated by multi-chromatography and t

4、heir chemical structures were elucidated by spectral analysis.  Results  Two known compounds, 2572A and 2572B were purified from the fermented extracts.  Conclusions  

5、60;2572A and 2572B were identified to be 6-epi-5-hydroxymycosporulone and riboflavin, respectively. And 2572A shows IL-6Ra activity whereas 2572A has weak activity.     KEY WO

6、RDS  Human interleukin 6 receptor antagonist;  6-epi-5-hydroxymycosporulone;  Riboflavin; Structure identification      白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種功能廣泛的細(xì)胞因子，它的生物學(xué)功能十分復(fù)雜，并在多種疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Castlemans病、多發(fā)性骨髓瘤等癥中扮演重要角色1。IL-6通過形成IL-6/IL

7、-6R/gp130六聚體復(fù)合物后，方可進(jìn)行信號的傳導(dǎo)，發(fā)揮其生物學(xué)活性，而白細(xì)胞介素6受體(IL-6R)是介導(dǎo)這個六聚體復(fù)合物形成的重要中介分子2。本實驗選用以基因重組白細(xì)胞介素可溶性受體(sIL-6R)為靶位的IL-6R高通量篩選模型，從真菌2572的代謝產(chǎn)物中分離得到了兩個化合物2572A和2572B，本文報道了這兩個結(jié)構(gòu)和IL-6R拮抗活性研究。     1  實驗材料     1.1  菌株與培養(yǎng)基     2572菌種來自本所

8、菌種篩選中心。    種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油1%，葡萄糖2%，蔗糖1%，黃豆餅粉0.2%，蛋白胨(F403)1%，聚乙二醇(6000)0.25%，KH2PO4 0.03%，NaNO3 0.3%，(NH4)2SO4 0.3%，pH6.0。     1.2  儀器與試劑     酶標(biāo)比色計(Biorad)，X5型大孔吸附樹脂(天津南開大學(xué)化工廠)，ODS/C18柱色譜介質(zhì)(日本Shimadzu公司)，Sephadex L

9、H-20(上?；瘜W(xué)試劑廠)，Sephadex G-10(Solarbio)，質(zhì)譜儀(AccuTof CSLCMS)，核磁共振儀(Bruker AM-400)，所有化學(xué)試劑均為市售分析純試劑，高效液相色譜儀(Shimadzu LC-10Avp)，柱型號為Inertsil ODS-2(4.6mm×150mm)，HPLC檢測條件：流動相為30%乙腈水，檢測波長215nm，柱溫25。     2  方法與結(jié)果     2.1 

10、0;發(fā)酵     斜面(YM培養(yǎng)基)26培養(yǎng)7d，接種于100ml種子培養(yǎng)基中(500ml培養(yǎng)瓶)，26振蕩(250r/min)培養(yǎng)48h，以2%轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基，26振蕩培養(yǎng)96h，發(fā)酵液pH6.0。     2.2  提取分離與純度鑒定     將12L發(fā)酵液過濾，濾液通過X5型大孔樹脂，棄去流出液，分別用30%、50%和80%丙酮洗脫，測活性發(fā)現(xiàn)活性部位主要集中于30%丙酮洗脫液中；收集30%洗脫液并揮去丙酮，用乙酸乙酯萃取；將乙酸乙酯部分用少量甲醇

11、溶解，上樣于Sephadex LH-20柱，50%甲醇洗脫，HPLC檢測，按峰收集，得白色粗品A；將粗品A以少量甲醇溶解，上樣于ODS/C18反相柱，以40%甲醇水系統(tǒng)洗脫，得一白色純品2572A，凍干后為50mg，HPLC檢測2572A保留時間為11.72 min；將萃取后的水部分冷干上Sephadex G-10柱，水洗脫，收集后端黃色段成分，冷干后再上ODS/C18反相柱，10%甲醇水(0.05%TFA)系統(tǒng)洗脫，得黃色純品2572B，凍干后8mg，HPLC檢測其保留時間為6.95min。      09-08-27 1

12、1:50:00     編輯：studa20    2.3  理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)鑒別     2572A為白色無定形粉末，易溶于甲醇。其ESI-MS(positive)示：m/z 225M+H+，247M+Na+，分子量為224。又由HRMS：m/z 225.0769M+H+(Calcd.225.0763)確定分子式為C11H12O5。     根據(jù)13C-NMR譜及DEPT譜(表1)可知，該化合物有

13、4個季碳(197.2， 171.9， 158.6和59.9)， 5個表1        2572A的1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù) -： 碳譜及氫譜上均無顯示。CH(150.8，124.7，71.7，67.8和32.8)，1個CH2(86.2)，1個CH3(14.9)。1H-NMR譜中有2個低場的CH(6.62和6.05)互相偶合，偶合常數(shù)10.2Hz，說明分子中存在一對順勢偶合的烯碳。根據(jù)HMQC確定了與H直接所連的各個C的化學(xué)位移(表2)。HMBC譜中可觀察到

14、下列相關(guān)信號：H-7與C-1，C-5，C-6；H-5與C-1，C-3，C-6；H-2與C-1，C-3，C-2；H-與6C-2以及H-6與C-4，C-5；根據(jù)以上信號，可獲得2572A的平面結(jié)構(gòu)。通過NOE譜，照射H-2(4.32)時，H-6(3.35)和H-5(5.32)出現(xiàn)信號增強(qiáng)，說明H-2，H-6和H-5 三個氫原子空間位置接近，確定了該化合物的相對構(gòu)型。通過與文獻(xiàn)3相對照確認(rèn)該化合物為6-epi-5-hydroxymycosporulone，其結(jié)構(gòu)見圖1。     2572B為黃色無定形粉末，ESI-MS(positive)顯示該化合物

15、準(zhǔn)分子離子峰為377M+H+。13C-NMR和DEPT譜包括17個碳的信號，其中8個季碳(全都 表22572B的1H-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)位于低場)，5個CH，2個CH2，2個CH3。其中110170有10個不飽和碳信號，說明可能存在芳香基團(tuán)；4080區(qū)域有5個碳信號，結(jié)合1H-NMR譜中3.05.0的含7個氫的多重峰信號，推測分子中可能含有一個糖基。經(jīng)查閱化合物數(shù)據(jù)庫(Spectral Database for Organic Compounds, SDB, http:/www.aist.go.jp/RIODB/SD

16、B S/cgi-bin/cliretc-frame top.cgi? lang=eng)和文獻(xiàn)4，2572B的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與核黃素基本一致，因此確定其為同一個化合物，分子式為C17H20N4O6，結(jié)構(gòu)見圖2。本文還根據(jù)其HMQC和HMBC數(shù)據(jù)對其碳、氫信號進(jìn)行了歸屬，結(jié)果見表2。     圖2    2572B的結(jié)構(gòu)圖     2.4  白介素6受體(IL-6R)拮抗活性檢測方法   &

17、#160; 重組人IL-6(溶于pH7.2，PBS緩沖液，1g/ml)以每孔100l加至96孔酶標(biāo)板，4放置過夜；吸出后每孔加入250l 3%小牛血清的PBS緩沖液(KH2PO4 0.024%，Na2HPO4 0.363%，KCl 0.02%，NaCl 0.8%，pH7.4)，4放置8h；再以PBS洗板5次；待測樣品溶于含1% BSA的PBS溶液，每孔加入樣品50l和重組IL-6R(11000)50l，4放置過夜；以PBST(含0.1% Tween 20的PBS)洗滌5次；每孔加入小鼠抗人IL-6R抗體(

18、R&D systems，11000)100l，4放置1h；以PBST洗板5次；每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗小鼠IgG抗體(15000)100l，4放置1h；以PBST再洗板5次后，每孔加入底物TMB(3，3，5，5-tetramethyl benzidine dihydrochloridide)及過氧化氫溶液各100l，室溫放置3060min，每孔加入2mol/L鹽酸100l以終止顯色，采用酶標(biāo)比色計于450nm測定A值， 試驗中設(shè)定空白對照(TMB)和樣品對照(表3)，結(jié)果顯示2572A活性較好，且隨濃度降低其活性也降低；2572B的活性則

19、較低。     3  討論     6-epi-5-hydroxymycosporulone(2572A)是1997年從真菌Microsphaeropsis sp. F-5050中分離出來的一種螺環(huán)類成分，它對人白血病細(xì)胞(HL-60)的細(xì)胞粘附功能(cell adhesion)有一定抑制作用，但對HL-60和黑素瘤細(xì)胞B16/BL6的細(xì)胞生長功能的抑制活性一般3。真菌2572是經(jīng)過IL-6R拮抗劑篩選模型檢測篩選出的活性菌株之一，2572A在真菌2572發(fā)酵液中含

20、量較高，也表現(xiàn)出了較好的IL-6R拮抗活性。鑒于IL-6R在骨髓瘤細(xì)胞中的高豐度分布，因此還需要對該化合物是否有抑制骨髓瘤細(xì)胞作用做進(jìn)一步的研究。核黃素(2572B)是機(jī)體中的必需微量成分，生物功能廣泛，但本研究未發(fā)現(xiàn)它在IL-6R拮抗方面有較好的活性。表3產(chǎn)物濃度與IL-6R活性關(guān)系(拮抗率，%)   【參考文獻(xiàn)】   1 Gentiletti J, Fava R A. Does vascular endothelial growth factor play a role in interleukin-6 receptor antagonist therapy for rheumatoid arthritis J. Arthritis Rheum,2003,48(6):14711474. 2