1、    【關(guān)鍵詞】  神經(jīng)膠質(zhì)瘤    Expression and significance of osteopontin in human gliomas【Abstract】 AIM: To investigate the expression of osteopontin in human gliomas as well as its function. METHODS: Osteopontin expression in human normal brain cells and glioma cells w

2、as detected by immunohistochemical staining and RTPCR method. RESULTS:  Osteopontin was expressed in glioma cells but was not expressed in human normal brain cells. CONCLUSION:  Osteopontin expression in glioma is closely related to the malignant degree of glioma.【Keywords】 gliom

3、a; osteopontin; immunohistochemistry【摘要】 目的：探討骨橋蛋白（OPN）在人腦膠質(zhì)瘤中的作用、表達(dá)及其意義. 方法： 采用RTPCR及免疫組化染色方法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織和正常組織中骨橋蛋白. 結(jié)果： 骨橋蛋白在膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞中表達(dá)，而在正常腦組織細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，而且OPN的表達(dá)濃度與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān). 結(jié)論： 人腦膠質(zhì)瘤中OPN的表達(dá)與其惡性程度密切相關(guān). 【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)膠質(zhì)瘤；骨橋蛋白；免疫組織化學(xué)0引言人腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)是術(shù)后復(fù)發(fā)和臨床療效差的主要原因，過(guò)程涉及到細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移等多個(gè)環(huán)節(jié). 骨橋蛋白（osteopontin,&#

4、160; OPN）是一種含有整合素結(jié)合序列GRGDS的分泌型磷酸化酸性糖蛋白，它對(duì)于OPN的黏附功能起重要作用. 整合素是OPN的受體，OPN通過(guò)細(xì)胞黏附序列GRGDS識(shí)別整合素與細(xì)胞結(jié)合，刺激了細(xì)胞信號(hào)的傳送途徑，促進(jìn)了細(xì)胞的黏附與遷移，促使了細(xì)胞向惡性發(fā)展1-3，我們采用免疫組化和RTPCR方法，探討OPN在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá). 1材料和方法1.1材料河南省人民醫(yī)院200308/200502手術(shù)切除膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移和正常腦組織標(biāo)本共36例. 按WHO病理分級(jí)將膠質(zhì)瘤分為級(jí)，其中級(jí)6例，級(jí)7例，級(jí)6例，級(jí)4例，轉(zhuǎn)移癌8例，正常腦組織5例. 1.2方法1.2.1免疫組化染色采用SP染色三步法

5、.  SP試劑盒購(gòu)于美國(guó)ZYMED生物技術(shù)公司. 按操作說(shuō)明進(jìn)行各組的OPN免疫組化染色. 簡(jiǎn)要步驟： 30 mL/L過(guò)氧化氫室溫孵育，DH2O沖洗，PBS浸泡，100 mL/L山羊血清封閉；滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液，PBS沖洗；滴加生物素標(biāo)記二抗，PBS沖洗；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物，顯色劑(DAB)顯色. 陽(yáng)性對(duì)照用已知OPN表達(dá)陽(yáng)性的組織切片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，以胞漿/胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞.1.2.2總RNA的提取和RTPCR 每0.1 g組織中加入1 mL Trizol，提取總RNA并按說(shuō)明書(shū)操作. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)： 總RNA 4 g, 0.

6、5 g/L oligo(Dt) 1 L,加入一定量DPEC處理水,使總體積少于15 L，放70 5 min. 將反應(yīng)體系立即置冰上，再加入5 mmol/L Buffer 6 L,10 mmol/L dNTP 1 L, 833.5 kat/L  RNAsin 0.5 L, 3.334 mkat/L MMLV 1 L,用DPEC處理水定容于30 L. 37 1 h, 94 5 min. PCR： 將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增. 引物是自行設(shè)計(jì)并由上海生物有限公司合成. OPN上游引物序列為5CTGATGCTACAGACGAGGAC 3(668687)；下游引物序列為5ACTATCAAT

7、CACATCGGAAT 3（912893）；內(nèi)參照G3PDH上游引物序列為5GGTCGGAGTCAACGGATTGGTCG 3(90113)；下游引物序列為5CCTCCGACGCCTGCTTCACCA 3 (877856). 50 L的反應(yīng)體系中加入10 mmol/L buffer 2L, 25 mmol/L MgCl2 10 mmol/L dNTP 1 L,G3PDH引物各1 L, OPN引物各1 L, 83.35 kat/L Taq酶0.5 L,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 L,加DEPC處理水至50 L. 94  5 min預(yù)變性，94 30 s55 1 min72 80 s,共30

8、個(gè)循環(huán)，72 10 min,4冷卻后-20保存. 電泳及定量分析：PCR產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，結(jié)果為OPN灰度值/G3PDH灰度值. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 各組織相對(duì)積分值以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn). 2結(jié)果在正常腦組織中(Fig 1)未見(jiàn)棕黃色或棕色陽(yáng)性顆粒，即沒(méi)有表達(dá)OPN，而在膠質(zhì)瘤組織(Fig 2)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中以及血管內(nèi)皮細(xì)胞均見(jiàn)棕黃色或棕色陽(yáng)性顆粒，即表達(dá)OPN. 且IV級(jí)膠質(zhì)瘤組織中OPN的表達(dá)要比II級(jí)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯增加（Tab 1）.表1RTPCR檢測(cè)O

9、PN mRNA在正常人腦組織和人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量（略）3討論OPN是一種細(xì)胞分泌性蛋白，富含甘氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸殘基的磷酸化酸性糖蛋白2,它首先由骨骼中分離出，在人體免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、癌腫的轉(zhuǎn)移中起重要作用，通過(guò)其受體融合素及CD44等促進(jìn)細(xì)胞趨化、黏附、遷移并刺激細(xì)胞信號(hào)的傳送途徑4-6，從而促進(jìn)了細(xì)胞的惡性發(fā)展. 免疫組化結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)惡性星形細(xì)胞瘤表達(dá)OPN的量較高，而良性星形細(xì)胞瘤與非腫瘤組織表達(dá)OPN的量較低，這些結(jié)果也表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞能表達(dá)OPN，且表達(dá)程度與它的惡性程度相關(guān)1，而與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)的是OPN中的GRGDS序列通過(guò)其受體整合素與細(xì)胞結(jié)合

10、完成對(duì)細(xì)胞的黏附與遷移作用. Takano等7認(rèn)為OPN與血管生成有關(guān)，可介導(dǎo)OPNmRNA在血管內(nèi)皮中的表達(dá).本結(jié)果說(shuō)明，OPN和膠質(zhì)瘤惡性程度之間及膠質(zhì)瘤與正常腦組織間存在內(nèi)在聯(lián)系，統(tǒng)計(jì)學(xué)上呈明顯的正相關(guān)性. 有學(xué)者認(rèn)為，OPN在啟動(dòng)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞素Th1、抑制素Th2的延遲性超敏反應(yīng)中起重要作用，腫瘤的生長(zhǎng)常常因?yàn)闄C(jī)制缺乏正常的免疫識(shí)別能力和抵抗能力來(lái)調(diào)節(jié)應(yīng)急反應(yīng)8，而OPN可能在這種情形中起到了關(guān)鍵性的作用. 而在轉(zhuǎn)移癌中OPN的積分稍低于級(jí)腦膠質(zhì)瘤中OPN的積分，原因是OPN主要與癌瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及細(xì)胞遷移有關(guān). 在轉(zhuǎn)移腫瘤與正常組織交界處表達(dá)比較強(qiáng)，在腫瘤實(shí)質(zhì)中心部分表達(dá)不對(duì)周圍

11、腦組織影響，而主要是擠壓和引起腦水腫為主，這也許可以解釋為什么轉(zhuǎn)移癌與腦組織的手術(shù)界限一般比較清楚，且術(shù)后神經(jīng)功能少有缺失，復(fù)發(fā)相對(duì)較少.關(guān)于OPN在組織細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)，從20世紀(jì)90年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者就對(duì)它與許多組織、細(xì)胞（血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞）、腫瘤（人腦膠質(zhì)瘤）的密切關(guān)系進(jìn)行報(bào)道. 1996年Bautista等9建立了一種血中OPN抗原檢測(cè)方法. 楊力等10觀察到OPN在侵襲轉(zhuǎn)移胃癌中的表達(dá). 但是OPN在微血管及內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在低級(jí)別的星性細(xì)胞瘤微血管及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，正常微血管內(nèi)皮中的陽(yáng)性表達(dá)，還未見(jiàn)系統(tǒng)的表達(dá). OPN在人腦膠質(zhì)瘤微血管及內(nèi)皮

12、細(xì)胞中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在低級(jí)別的星性細(xì)胞瘤微血管及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)呈弱陽(yáng)性，正常微血管及內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)不表達(dá)，這與Takano等7所認(rèn)為的OPN與血管生成并可介導(dǎo)OPN在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)、促進(jìn)血管快速生成、刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移有關(guān). 劉智敏等11報(bào)道了粘著斑相關(guān)非激酶是血管生成的一個(gè)標(biāo)志，對(duì)膠質(zhì)瘤的遷移有抑制作用. 本結(jié)果表明OPN表達(dá)的強(qiáng)弱，是膠質(zhì)瘤血管生成的一個(gè)標(biāo)志，與膠質(zhì)瘤的生成呈正相關(guān). 這些實(shí)驗(yàn)與報(bào)道，或許可以證明，通過(guò)抗血管治療，能為抗膠質(zhì)瘤提供一條新的治療途徑.【參考文獻(xiàn)】1靖大道, 李繼坤, 黃君劍,等. 骨橋蛋白mRNA的表達(dá)與胃癌臨床病理分期的關(guān)系J. 胃腸病學(xué), 200

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14、77-1881.3Hynes RO. Integrins: Versatility, modulation, and signaling in cell adhesion J. Cell, 1992; 69(1):11-25.4柴錫慶, 鄭斌, 韓梅,等. 骨橋蛋白的制備及功能研究J. 中國(guó)老年病學(xué)雜志, 2004; 24(8): 725-727.Chai XQ, Zheng B, Han M, et al. Preparation and characterization of osteopontin J. Chin J Geront, 2004; 24(8): 725-727.5Oates

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17、brain cancers J. Brain Res Bull, 2000; 53(4):421-424.9Bautista DS, Saad Z, Chambers AF, et al. Quantification of osteopontin in human plasma with an ELISA: Basal levels in preand postmenopausal women J. Clin Biochem, 1996; 29(3):231-239.10楊力, 張東濤, 郭新寧. 骨橋蛋白和核因子B在侵襲轉(zhuǎn)移性胃癌中的表達(dá)J. 中國(guó)腫瘤臨床, 2004; 31(16): 901-904.Yang L, Zhang D