1、清熱通下中藥對(duì)膽管炎大鼠腸屏障保護(hù) 和炎癥反應(yīng)調(diào)控之研究_西醫(yī)學(xué)論文,論文集        摘要  目之：探討清熱通下中藥在急性膽管炎治療中對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)和炎癥調(diào)控之作用。方法：60只SD大鼠分為3組，每組20只。模型組（A組）制作急性膽管炎模型；治療組（B組）制作急性膽管炎模型并喂清熱通下中藥治療；假手術(shù)組（C組）僅剖腹后縫合。取血檢測(cè)細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素和細(xì)菌移位等指標(biāo)。結(jié)果：A組白細(xì)胞介素6（interleukin6, IL6）、白細(xì)胞介素8（interleukin8, IL8）、腫瘤壞死因子（tum

2、or necrosis factor, TNF）、血清C反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)和一氧化氮(nitric oxide, NO)明顯高于B組和C組（P<0.01），IL2則顯著低于B組和C組（P<0.01）；A組之血清內(nèi)毒素和肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位數(shù)顯著高于B組和C組（P<0.01）。結(jié)論：具有清熱通下作用之中藥在治療急性膽道感染中具有保護(hù)腸黏膜屏障、降低血清內(nèi)毒素和調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)之作用。    關(guān)鍵詞  清熱通下中藥; 膽管炎; 細(xì)胞因子; 炎癥介質(zhì)    

3、; Impact of antipyretic and purgative herbs on intestinal mucosal barrier and inflammatory response in treatment of acute cholangitis in rats       ABSTRACT  Objective: To investigate the effects of antipyretic and purgative herbs on intestinal mucosal barrier and

4、inflammatory response in the treatment of acute cholangitis. Methods: Sixty SD rats were randomly pided into group A (untreated group, acute cholangitis was induced, n=20), group B (treatment group, acute cholangitis was induced and treated with antipyretic and purgative herbs, n=20) and group C (sh

5、am operation group, n=20). At the third or fifth day after operation, the rats were sacrificed and sampled. The serum endotoxin, cytokines and inflammatory mediators were tested and the numbers of labeled bacteria in the liver, spleen and mesenteric lymph nodes translocated from the gut were assayed

6、. Results: As compared with group A, the serum content of endotoxin, IL6, IL8, TNF, CRP and NO was significantly lower and that of IL2 was significantly higher, and the translocated numbers of labeled bacteria from gut were reduced in both group B and group C（P<0.01）. Conclusion: Antipyretic and

7、purgative herbs can play therapeutic roles in the treatment of acute biliary tract infections, including the protection of intestinal mucosal barrier from bacterial translocation, reduction of serum endotoxin content and regulation of inflammatory response.    KEY WORDS  antipyre

8、tic and purgative herbs; cholangitis; cytokines; inflammatory mediators     近年，隨著對(duì)重癥感染研究之不斷深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者更加注重保護(hù)機(jī)體防御功能和調(diào)節(jié)機(jī)體適度炎癥反應(yīng)在抗感染治療中之地位。穩(wěn)定和保護(hù)機(jī)體天然屏障以及調(diào)控炎癥時(shí)機(jī)體體液性因子與細(xì)胞因子之平衡，正成為提高外科重癥感染治療效果之重要研究方向。急性膽管炎是外科常見和危重感染性疾病，迄今為止，手術(shù)和抗生素療法是治療這一疾病之主要手段，其病死率和病殘率還很高。以往中西醫(yī)結(jié)合治療急性膽道感染之臨床實(shí)踐已經(jīng)顯示，清熱通下中藥具有

9、較為理想之療效，尤其在緩解癥狀、減少并發(fā)癥和加速康復(fù)等方面作用顯著1。中醫(yī)中藥在治療急性膽道感染中之獨(dú)特作用正引起臨床上廣泛關(guān)注。本研究旨在探討清熱通下中藥在膽道感染時(shí)對(duì)機(jī)體腸黏膜防御屏障和全身炎癥反應(yīng)之干預(yù)作用。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組  選擇SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量225245 g，隨機(jī)分為3組，每組20只(上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，純系清潔級(jí)動(dòng)物)。模型組（A組）大鼠參照龔建平等2之方法，將膽總管結(jié)扎，同時(shí)向膽總管內(nèi)注入致病性大腸桿菌，制作大鼠急性膽道感

10、染模型，手術(shù)后喂生理鹽水。清熱通下中藥治療組(B組)大鼠同上造模，手術(shù)后喂清熱通下中藥錦紅片懸液。假手術(shù)組（C組）大鼠剖腹后縫合，手術(shù)后喂生理鹽水。    1.2  實(shí)驗(yàn)材料    1.2.1  藥物  錦紅片系已故中醫(yī)名家顧伯華教授和著名中西醫(yī)結(jié)合外科專家徐長(zhǎng)生教授之經(jīng)驗(yàn)方，主要成分為紅藤、蒲公英、生大黃。由上海中藥制藥一廠提供錦紅片干粉，以蒸餾水配成含干粉110 mg/ml之懸混液，用于動(dòng)物灌胃。    1.2.2  標(biāo)記細(xì)菌  由上海衛(wèi)生防疫站提供菌

11、株，菌株置于肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)并配制成菌液。大腸桿菌O111B4(菌液濃度5×109 cfu/ml)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽總管內(nèi)注入，制作急性膽道感染模型。大腸桿菌O55B5(菌液濃度5×109 cfu/ml)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃，作為標(biāo)記菌檢測(cè)腸道細(xì)菌移位數(shù)。    1.2.3  試劑與儀器  鱟試劑內(nèi)毒素定量檢測(cè)試劑盒，上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所提供；滅菌肉湯瓊脂培養(yǎng)基，F(xiàn)MG182放射線免疫計(jì)數(shù)器，上海中醫(yī)藥大學(xué)龍華醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；CPS2型超聲粉碎機(jī)，上海超聲波儀器廠生產(chǎn)；85超低溫冰箱，美國(guó)Harris公司產(chǎn)品；LXJ型離心沉淀機(jī)，上

12、海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；免疫化學(xué)定量?jī)x，美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；一氧化氮(nitric oxide, NO)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；白細(xì)胞介素6（interleukin6, IL6）、白細(xì)胞介素8（interleukin8, IL8）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）放射免疫分析測(cè)定盒，北京北方生物技術(shù)研究所提供；ELISA試劑盒，深圳晶美生物工程有限公司提供。    1.3  實(shí)驗(yàn)方法    1.3.1  造模方法  動(dòng)物以戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔

13、注射麻醉，腹部備皮，以新潔爾滅酊消毒皮膚，無(wú)菌條件下進(jìn)入腹腔，游離膽總管，雙重結(jié)扎膽總管，向膽總管近端內(nèi)注入大腸桿菌O111B4 1 ml/kg，縫合創(chuàng)口。假手術(shù)動(dòng)物同樣在無(wú)菌條件下打開并縫合腹腔，但不結(jié)扎膽總管，也不予標(biāo)記菌注入。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于手術(shù)后第3和第5天處死取材，于取材前24 h予大腸桿菌O55B5 7 ml/kg灌胃。    1.3.2  給藥方法  模型組大鼠造模后每天以生理鹽水10 ml/kg灌胃2次。中藥組大鼠造模前1天予錦紅片懸液10 ml/kg灌胃1次，造模當(dāng)天以相同劑量錦紅片懸液灌胃1次，并于灌胃后4 h造模，方法同模型

14、組。造模后每天以相同劑量錦紅片懸液灌胃2次。假手術(shù)組大鼠手術(shù)后每天以生理鹽水10 ml/kg灌胃2次。    1.3.3  取材方法  各組動(dòng)物均以戊巴比妥鈉25 mg/kg腹腔注射麻醉，再次在無(wú)菌條件下進(jìn)入腹腔，于后腔靜脈處抽取血標(biāo)本，用于血清內(nèi)毒素、細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)等檢測(cè)；取肝、脾、回腸及盲腸腸系膜等組織供標(biāo)記細(xì)菌移位檢測(cè)。    1.4  檢測(cè)指標(biāo)    1.4.1  細(xì)胞因子檢測(cè)  血清IL2測(cè)定采用ELISA法，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明步驟操作

15、測(cè)定。血清IL6、IL8和TNF采用放射免疫分析法測(cè)定，根據(jù)各自之放射免疫分析測(cè)定盒說(shuō)明之步驟檢測(cè)。    1.4.2  炎癥介質(zhì)  血清C反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)采用Beckman免疫化學(xué)定量?jī)x自動(dòng)測(cè)定，NO采用硝酸還原酶法測(cè)定。    1.4.3  血清內(nèi)毒素測(cè)定  采用鱟試劑定量測(cè)定各組動(dòng)物血清內(nèi)毒素含量。    1.4.4  標(biāo)記菌檢測(cè)  取各組動(dòng)物之肝、脾、回腸及盲腸腸系膜(其中含有腸系膜淋巴結(jié))，稱重

16、后分別加10倍重生理鹽水稀釋，置于超聲勻漿機(jī)中制成10%組織勻漿，各取0.1 ml置于肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)標(biāo)記大腸桿菌O55B5菌落數(shù)。    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。 2  結(jié)  果    2.1  細(xì)胞因子  實(shí)驗(yàn)第3天C組IL2含量顯著高于其他兩組，A組最低（P<0.01），見表1。至第5天時(shí)，各組IL2均有下降趨勢(shì)，但B組仍顯著高于A組（P<0.01），見表2。實(shí)驗(yàn)第3天A組TNF、IL6、

17、IL8含量顯著高于其他兩組，以C組最低（P<0.01或P<0.05），見表1。至實(shí)驗(yàn)第5天，各組TNF、IL6均有所下降，但B組仍顯著低于A組（P<0.01）；而實(shí)驗(yàn)第5天，A、B組IL8仍維持較高水平，但B組仍顯著低于A組（P<0.05），見表2。    2.2  炎癥介質(zhì)  實(shí)驗(yàn)第3天A組和B組動(dòng)物血清CRP含量明顯高于C組（P<0.01），其中A組尤為明顯，B組與A組之間比較也有明顯差異(P<0.05)，見表3；第5天A組和B組CRP含量均有降低，以B組下降幅度更明顯（P<0.01），見表4。實(shí)驗(yàn)

18、第3天A、B兩組動(dòng)物血清NO含量明顯高于C組（P<0.01），其中A組最高，B組與A組之間比較有顯著性差異(P<0.05)，見表3；第5天A、B兩組之NO仍處于高值水平，與C組比較差異顯著，而A、B兩組間無(wú)明顯差異，見表4。 表1  第3天各組動(dòng)物血清細(xì)胞因子含量表2  第5天各組動(dòng)物血清細(xì)胞因子含量表3  第3天各組動(dòng)物血清炎癥介質(zhì)含量表4  第5天各組動(dòng)物血清炎癥介質(zhì)含量    2.3  細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)  B組動(dòng)物血清內(nèi)毒素含量明顯低于A組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組有顯著差異(P <0.0

19、1)；B組與C組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表5。    2.4  標(biāo)記細(xì)菌移位  3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph node, MLN)中均發(fā)現(xiàn)有標(biāo)記細(xì)菌之移位，但C組細(xì)菌移位數(shù)明顯低于A、B組(P<0.01)，提示膽道感染之發(fā)生對(duì)腸道黏膜屏障之影響較大。B組細(xì)菌移位數(shù)明顯低于A組，兩組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P<0.01),見表6表5  第3天各組動(dòng)物血清內(nèi)毒素含量表6  第3天各組動(dòng)物肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位檢測(cè)結(jié)果    3&

20、#160; 討  論    3.1  “清熱通下”治療急性膽道感染之理論基礎(chǔ)  急性膽管炎是外科炎性急腹癥中常見之危重疾病，發(fā)病率隨著膽石病之高發(fā)生率而不斷升高，嚴(yán)重威脅廣大人民之健康。研究表明，急性膽道感染時(shí)，細(xì)菌及其產(chǎn)生之毒素和病損之自身組織作為抗原性炎癥刺激物激活巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，觸發(fā)炎癥介質(zhì)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表現(xiàn)出以炎癥反應(yīng)增強(qiáng)為代表之過(guò)度炎癥反應(yīng)。同時(shí)，疾病造成之機(jī)體天然防御屏障之損害又會(huì)進(jìn)一步加重這種炎癥反應(yīng)，干擾機(jī)體之免疫平衡，影響疾病之恢復(fù)和預(yù)后。盡管抗生素治療是目前非手術(shù)治療急性膽道感染之主要手段，但抗生

21、素在機(jī)體屏障功能之保護(hù)和炎癥反應(yīng)之調(diào)控方面缺乏有效作用，這恰好又是近年國(guó)內(nèi)外學(xué)者在重癥感染治療中特別注重之研究方向。    急性膽管炎在中醫(yī)學(xué)中雖無(wú)明確病名，但有關(guān)類似癥狀之記載，散見于“結(jié)胸”、“黃疸”、“腹痛”、“膽脹”、“脅痛”等證之?dāng)⑹鲋?。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性膽道感染之病因病機(jī)，主要為肝膽氣滯、疏泄失常，邪熱蘊(yùn)阻、橫逆脾土，濕熱蘊(yùn)結(jié)、熱結(jié)不散?！澳懜煌ā?、“不通則痛”是本病之基本病理改變。急性膽道感染之早、中期臨床征象在中醫(yī)辨證中屬里熱實(shí)證，病變發(fā)展迅速，一旦治療不當(dāng)或不及時(shí)，即可因熱腐成膿、熱毒熾盛擴(kuò)入營(yíng)血而導(dǎo)致亡陰、亡陽(yáng)等危重證象。這種邪正交爭(zhēng)之過(guò)程，尤其

22、是肝膽濕熱交蒸，熱勝肉腐演變至熱毒囂張，火毒逆?zhèn)餍陌I(yíng)血），出現(xiàn)熱深厥深之過(guò)程，酷似西醫(yī)現(xiàn)今認(rèn)識(shí)之全身性炎癥反應(yīng)綜合征多器官功能障礙綜合征多器官功能衰竭之過(guò)程。在急性膽道感染之早、中期采用清熱通下之法蕩滌實(shí)結(jié)，清泄郁熱，使邪外出，是控制該病轉(zhuǎn)歸之關(guān)鍵，符合中醫(yī)“六腑以通為用”之原則。本次研究結(jié)果顯示，清熱通下中藥對(duì)急性膽管炎大鼠之腸黏膜屏障和全身炎癥反應(yīng)具有一定之干預(yù)作用。    3.2  “清熱通下”保護(hù)腸黏膜屏障和抗內(nèi)毒素  膽道梗阻時(shí)腸道內(nèi)膽鹽缺乏，同時(shí)膽汁中富含之SIgA不能進(jìn)入腸道， 加上腸道內(nèi)革蘭氏陰性桿菌之優(yōu)勢(shì)繁殖，極易導(dǎo)致細(xì)菌

23、移位和內(nèi)毒素血癥之發(fā)生2，3。本研究發(fā)現(xiàn)急性膽管炎動(dòng)物細(xì)菌移位數(shù)顯著高于對(duì)照組，證明急性膽道感染可損害腸黏膜屏障而促進(jìn)細(xì)菌移位之發(fā)生。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)急性膽道感染動(dòng)物在出現(xiàn)細(xì)菌移位之同時(shí)，其血漿內(nèi)毒素含量也明顯增高。而經(jīng)清熱通下中藥治療之動(dòng)物其腸道細(xì)菌移位數(shù)和血漿內(nèi)毒素含量明顯下降，提示“清熱通下”在機(jī)體膽管炎病理狀態(tài)下具有保護(hù)腸黏膜屏障從而減少細(xì)菌移位之作用。從這類中藥之相關(guān)研究資料來(lái)看46，中藥通過(guò)“通下”這一功效能使腸蠕動(dòng)增加，蕩滌胃腸道積滯，使腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素隨腸內(nèi)容物排出體外，從而減少細(xì)菌移位并降低內(nèi)毒素之吸收。同樣，中藥也可能通過(guò)“清熱”這一功效抑制腸道細(xì)菌生長(zhǎng)，中和內(nèi)毒素以及抗炎等，

24、發(fā)揮保護(hù)腸屏障，減少細(xì)菌移位和降低內(nèi)毒素之作用。    3.3  “清熱通下”調(diào)節(jié)免疫和調(diào)控炎癥反應(yīng)  國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，體液性炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子之變動(dòng)，反映了機(jī)體在感染和應(yīng)激情況下之免疫和炎癥狀態(tài)。這類物質(zhì)如不能維持抗炎和促炎之適度與動(dòng)態(tài)平衡，將導(dǎo)致病變之惡化7。    細(xì)胞因子IL2之主要生物學(xué)效應(yīng)是促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)及其他細(xì)胞因子之產(chǎn)生，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞之生長(zhǎng)分化和B細(xì)胞之增殖與抗體之合成。嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染患者常因IL2生成減少而導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能低下8。本實(shí)驗(yàn)第3天時(shí)C組IL2明顯高于其他各組，其中A組降低最為顯著，

25、也提示了這種變化。而B組在同樣感染之情況下，IL2明顯高于A組，說(shuō)明“清熱通下”有助于調(diào)節(jié)免疫功能和減輕膽道感染時(shí)之急性炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子IL6可刺激活化B細(xì)胞增殖及其免疫球蛋白之轉(zhuǎn)錄和生成，是一內(nèi)源性致熱源，能刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生一系列之急性相蛋白，同時(shí)協(xié)調(diào)IL1促進(jìn)B細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生，促進(jìn)急性期反應(yīng)，是最重要之致炎性細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第3天時(shí)A組IL6之含量明顯高于其他組，B組與A組間有顯著性差異，提示“清熱通下”能顯著減輕急性膽道感染時(shí)IL6對(duì)機(jī)體之影響。細(xì)胞因子IL8作為重要之炎癥介質(zhì)參與免疫、代謝和炎癥急性期反應(yīng)之調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗感染之能力，但過(guò)多分泌則可損害正常細(xì)胞和組織。本實(shí)驗(yàn)第

26、3天，A組IL8之含量明顯高于其他各組，提示其炎癥反應(yīng)最重。B組則相對(duì)較低，說(shuō)明“清熱通下”對(duì)急性膽道感染時(shí)之炎癥有調(diào)控作用。第5天時(shí)A組IL8數(shù)值稍降，B組反而輕度升高，提示中藥可能對(duì)IL8之影響較穩(wěn)定。細(xì)胞因子TNF低濃度時(shí)是防御病原微生物之重要因素，濃度過(guò)高時(shí)則導(dǎo)致一系列炎性損害。本實(shí)驗(yàn)中A組TNF含量明顯高于其他組，而B組則相對(duì)較低，說(shuō)明“清熱通下”在急性膽道感染時(shí)對(duì)TNF之影響與干預(yù)IL8相似。    CRP是急性炎癥狀態(tài)下血液中最常見之一種非抗體性蛋白質(zhì)。本次研究發(fā)現(xiàn)，急性膽道感染動(dòng)物CRP增加十分顯著，達(dá)正常之?dāng)?shù)百倍。CRP之增加程度在一定范圍內(nèi)與機(jī)體炎癥反應(yīng)程度成正相關(guān)，用“清熱通下”治療之動(dòng)物，則CRP顯著降低。說(shuō)明“清熱通下”能緩解急性膽道感染時(shí)之過(guò)度炎癥反應(yīng)。NO作為一種第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)，也是一個(gè)活性自由基，可調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間之信息，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞毒性，各種免疫細(xì)胞之激活均以NO為效應(yīng)分子。本研究發(fā)現(xiàn)急性膽道感染時(shí)NO含量顯著升高，而施以中