1、 第一節(jié) 蛋白質(zhì)表面特性 第二節(jié) 鹽析沉淀 第三節(jié) 其他沉淀法 第四節(jié) 沉淀生成動(dòng)力學(xué)定義定義常用加入試劑的方法，改變?nèi)軇┖腿苜|(zhì)的能量平衡來降低其溶解度，使產(chǎn)物離開溶液生成不溶性顆粒，沉降析出。沉淀具有濃縮與分離的雙重作用。與結(jié)晶聯(lián)系與結(jié)晶聯(lián)系 在本質(zhì)上都是新相析出的過程，主要是物理變化，當(dāng)然也存在化學(xué)反應(yīng)的沉淀或結(jié)晶。區(qū)別區(qū)別結(jié)晶為同類分子或離子以有規(guī)則排列形式析出，沉淀為同類分子或離子以無規(guī)排列形式析出。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)A、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、放大容易，產(chǎn)物濃度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液體積很快地減小1050倍，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；C、使中間產(chǎn)物保持在一個(gè)中性溫和的環(huán)境；D、

2、及早地將目標(biāo)pro.從其pro.水解酶分離出來，避免pro降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；E、用沉淀法作為pro色譜分離前處理，可使使用色譜分離的限制因素降低到最少。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：A、沉淀物可聚集有多種物質(zhì)，如大量鹽類和溶劑，所以沉淀法所產(chǎn)品純度通常都比結(jié)晶法低；B、過濾較困難蛋白質(zhì)溶解：蛋白質(zhì)溶解：相似者相溶aaaa的親水性和疏水性：的親水性和疏水性：有利因素：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團(tuán)、離子化側(cè)鏈、親水a(chǎn)a所占的%等。如白蛋白不利因素：不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團(tuán)、疏水a(chǎn)a所占的%等。如纖維蛋白原。1)、水化層水化層(hydration shell)2)、靜電排斥靜電排斥 zeta電

3、勢(shì)電勢(shì)Tight hydration shellProtein coreLoose hydration shell1）、鹽析法2）、有機(jī)溶劑沉淀法3）、 |pH水 pI| Value調(diào)節(jié)法4）、凝聚5）、絮凝6）、高價(jià)金屬離子沉淀法7）、親和沉淀法l沉淀劑是否會(huì)引起蛋白的破壞；l沉淀劑本身的性質(zhì)；l沉淀操作的成本和難易；l殘留沉淀劑的去除難度；l最終產(chǎn)品的產(chǎn)率及純度要求等綜合考慮。l加沉淀劑；l沉淀物的陳化，促進(jìn)粒子生長(zhǎng)；l離心或過濾，收集沉淀物。1、機(jī)理：、機(jī)理：A、zeta potential；B、hydration shell式中, S為蛋白質(zhì)的溶解度(g/L)；I為離子強(qiáng)度；m為鹽的摩

4、爾濃度；值為蛋白質(zhì)在純水中(I=0時(shí))的假想溶解度對(duì)數(shù)值，是pH值和溫度的函數(shù)，在蛋白質(zhì)pI時(shí)最??；Ks為鹽析常數(shù)，與溫度和pH值無關(guān)。A A、 “KsKs”分級(jí)鹽析法：分級(jí)鹽析法：在一定pH值及溫度下，改變鹽濃度（即I）達(dá)到沉淀的目的。B B、“”分級(jí)鹽析法：分級(jí)鹽析法：在一定I下，改變?nèi)芤旱膒H值及溫度達(dá)到沉淀的目的。C C、應(yīng)用：、應(yīng)用：一般的初步分離用第一種方法，進(jìn)一步純化時(shí)用第二種方法。A A、無機(jī)鹽種類、無機(jī)鹽種類感膠離子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister對(duì)一系列鹽沉淀蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行了測(cè)定研究。陰離子排序?yàn)椋簷幟仕岣?- 酒石酸根3- F- I

5、O-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 對(duì)陽離子排序?yàn)椋?Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)？如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)？ 結(jié)論？結(jié)論？結(jié)論：結(jié)論：a 不同種類的鹽主要影響Ks；b 離子半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好。無機(jī)鹽的挑選原則：無機(jī)鹽的挑選原則： a 較高的鹽析效能；b 高溶解度，能配置高離子強(qiáng)度的鹽溶液；c 溶解度受溫度的影響小；d 鹽溶液的密度不高，便于蛋白質(zhì)沉淀和離心分離；e 不易引起蛋白質(zhì)的變性；f 價(jià)格低廉； 最常用最常用(NH

6、4)2SO4。優(yōu)點(diǎn)：符合上述要求；缺點(diǎn)：水解后溶液pH降低，在高 pH下產(chǎn)氨，腐蝕性強(qiáng)，有異味，有毒，終產(chǎn)物必須除盡。 次常用次常用Na2SO4。缺點(diǎn)：在400C以下溶解度較低，主要用于熱穩(wěn)定蛋白。B B、無機(jī)鹽添加方式、無機(jī)鹽添加方式C C、溫度、溫度T TT影響Cohn方程中的值。T ， ；T ， 。Why? Why? 一般，現(xiàn)在D D、溶液、溶液pHpHpH影響Cohnx方程中的值。見圖圖有何用？圖有何用？等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法中的pH值作用于值而隱含在Cohnx公式中，pI值通常在pH46范圍內(nèi)變化，一般用無機(jī)酸（如鹽酸、磷酸和硫酸）作沉淀劑。在蛋白質(zhì)疏水性比較大和結(jié)合水比較小時(shí)這種

7、類型的沉淀更有效。為了提高等電點(diǎn)法的沉淀能力，常將其與鹽析法、有機(jī)溶劑法或其他沉淀法一起使用。最大缺點(diǎn)：無機(jī)酸會(huì)引起較大的蛋白質(zhì)不可逆變性的危險(xiǎn)。 同鹽析一樣，隨著沉淀劑有機(jī)溶機(jī)濃度的上升，蛋白質(zhì)溶解度也呈指數(shù)規(guī)律下降。 式中, So為當(dāng)（K/e2） 0時(shí)S的外推值；e為水-有機(jī)溶劑混合物的介電常數(shù)；K為常數(shù)(水的介電常數(shù)的吸收系數(shù))。有機(jī)溶劑的種類：有機(jī)溶劑的種類：丙酮(首選)、乙醇、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀pro。機(jī)理：機(jī)理：A、有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理是加入溶劑后，會(huì)使水溶液的介電常數(shù)降低，而使pro分子間的靜電引力（庫侖力）增大，導(dǎo)致凝集和沉淀。B、有機(jī)溶劑使pro溶劑化，使原來與

8、pro結(jié)合的水被溶劑所取代，從而降低了pro溶解度。這種理論不能說明為什么乙醇比丙酮的親水性強(qiáng)，丙酮卻比乙醇沉淀pro的能力強(qiáng)，也解釋不了丙酮、乙醇之類溶劑在所謂脫去pro水膜的過程中容易造成pro變性，而鹽析脫水時(shí)不造成pro變性。C、丙酮、乙醇等不僅是pro的沉淀淀劑，而且還是一種變性劑，可見作用有機(jī)溶劑使pro在沉淀和變性之間既有區(qū)別又相關(guān)聯(lián)。影響因素及控制影響因素及控制A、T：當(dāng)乙醇與水混合時(shí)，會(huì)放出大量的稀釋熱，使溶液T顯著升高，對(duì)不耐熱的pro影響較大。解決辦法：攪拌、少量多次加入，以避免溫度驟然升高損失pro活力。另一方面溫度還會(huì)影響有機(jī)溶劑對(duì)pro的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀

9、越完全，所以在乙醇沉淀人血漿蛋白時(shí)，溫度控制在-10C下進(jìn)行。B、乙醇：通常隨乙醇上升，pro溶解度下降。如血纖維蛋白原的最大溶解度在乙醇濃度為8%時(shí)達(dá)到最大，而當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)達(dá)到最小。C、pH值：在確定了乙醇以后，pro最低溶解度出現(xiàn)在蛋白.的pI處，因此可以通過調(diào)節(jié)pH值來選擇性分離蛋白質(zhì)。D、pro：避免使用很稀的濃度，因pro在高濃度下才較穩(wěn)定。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：A、某些蛋白質(zhì)沉淀的濃度范圍相當(dāng)寬，所得產(chǎn)品的純度較高，B、從沉淀的蛋白質(zhì)中除去有機(jī)溶劑很方便，而且有機(jī)溶劑本身可部分地作為蛋白質(zhì)的殺菌劑；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：A、耗用大量溶劑，而溶劑來源、貯存都比較困難麻煩；B、且沉淀操作需在低溫下

10、進(jìn)行，使用上有一定的局限性；C、收率也比鹽析法低；D、試劑易燃，有毒。 溶解度是一個(gè)平衡特性，但是溶解度值的降低是一個(gè)動(dòng)力學(xué)過程。當(dāng)體系變得不穩(wěn)定以后，分子互相碰撞并產(chǎn)生聚集作用。通常認(rèn)為相互碰撞由下面幾種運(yùn)動(dòng)引起：A、熱運(yùn)動(dòng)（Brownian運(yùn)動(dòng)）；B、對(duì)流運(yùn)動(dòng)，由機(jī)械攪拌產(chǎn)生；C、差示沉降，由顆粒自由沉降速度不同造成的。第A、B兩種機(jī)理在蛋白質(zhì)沉淀中起主導(dǎo)作用，第種機(jī)理在沉降過程中起主導(dǎo)作用(如在廢水處理中)。異向聚集：異向聚集：由Brownian運(yùn)動(dòng)所造成的碰撞導(dǎo)致。同向聚集：同向聚集：而由對(duì)流運(yùn)動(dòng)所造成的碰撞導(dǎo)致。沉淀過程步驟：沉淀過程步驟：A、初始混合，蛋白質(zhì)溶液與沉淀劑在強(qiáng)烈攪拌下混合；B、晶核生成，新相形成，產(chǎn)生極小的初始固體微粒；C、擴(kuò)散限制生長(zhǎng)，晶核在Brownian擴(kuò)散作用下生長(zhǎng)，生成亞微米大小的核，這一步速度很快；D、流動(dòng)引起的生長(zhǎng)，這些核通過對(duì)流傳遞（攪拌）引起的碰撞進(jìn)一步生長(zhǎng)，產(chǎn)生絮體或較大的聚集體，這一步是在較低的速度下進(jìn)行的。E、絮體的破碎，破碎取決于它們的大小、密度和機(jī)械阻力。F、聚集體的陳化，在陳化過程中，絮體聚得大小和阻力平衡。 早在50年前