1、HPLC的基礎知識及應用的基礎知識及應用2007年年10月月26日日工業(yè)催化與反應器設計實驗室內(nèi)部學術交流活動工業(yè)催化與反應器設計實驗室內(nèi)部學術交流活動徐徐 帥帥State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringContents液相色譜法發(fā)展史與分類液相色譜法發(fā)展史與分類1色譜方法基本原理色譜方法基本原理2345樣品分析方法的建立樣品分析方法的建立液相色譜的維護及注意事項液相色譜的維護及注意事項軟件的簡單介紹及示范軟件的簡單介紹及示范State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering

2、1 液相色譜發(fā)展歷史與分類液相色譜發(fā)展歷史與分類1.1 1.1 色譜的起源色譜的起源 (1903)(1903)M.S. TswettState Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv IUPAC definition of chromatography (1993) :Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of whi

3、ch is stationary while the other moves in a definite direction.v 固定相（固定相（stationary phase）：）：在色譜分離中固定不動、對樣在色譜分離中固定不動、對樣品產(chǎn)生保留的一相。品產(chǎn)生保留的一相。v 流動相（流動相（mobile phase）：）：帶動樣品向前移動的另一相。帶動樣品向前移動的另一相。v 色譜法：色譜法：是一種物理化學分離方法，它利用不同組分與兩相（固定是一種物理化學分離方法，它利用不同組分與兩相（固定相和流動相）之間的作用力（分配、吸附、離子交換等）的差別，樣相和流動相）之間的作用力（分配、吸附、離子

4、交換等）的差別，樣品在兩相中做相對移動時，各組分在兩相間進行多次平衡，使不同物品在兩相中做相對移動時，各組分在兩相間進行多次平衡，使不同物質達到相互分離。質達到相互分離。1.2 色譜的定義色譜的定義State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering1.3 色譜的發(fā)展歷程色譜的發(fā)展歷程State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering1.4 色譜中的分離過程色譜中的分離過程定性定性

5、定量定量串聯(lián)應用串聯(lián)應用樣品純化樣品純化成分分析成分分析分離分離State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering色譜中的分離過程色譜中的分離過程咖啡咖啡利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學作用性能的差異配、吸附等化學作用性能的差異,當兩相作相對當兩相作相對運動時運動時,使各組分在兩相中反復多次受到上述各使各組分在兩相中反復多次受到上述各作用力而達到相互分離作用力而達到相互分離State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering

6、1.5 色譜的分類色譜的分類v 按流動相的物態(tài)分按流動相的物態(tài)分: 氣相色譜氣相色譜(Gas Chromatography, GC)： 用氣體作為流動相用氣體作為流動相(又叫載氣又叫載氣) 液相色譜液相色譜(Liquid Chromatography, LC)： 用液體作為流動相用液體作為流動相(又叫洗脫劑又叫洗脫劑)v 按固定相的形態(tài)分按固定相的形態(tài)分: 平面色譜平面色譜 紙色譜紙色譜 薄層色譜薄層色譜 柱色譜柱色譜v按流動相和固定相的相對對性按流動相和固定相的相對對性 正相色譜正相色譜(Normal Phase Chromatography) 固定相的對性大于流動相固定相的對性大于流動相

7、反相色譜反相色譜(Reversed Phase Chromatography) 固定相的對性小于流動相固定相的對性小于流動相State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringHPLC 與與 GC 的應用差異的應用差異State Key Laboratory of Chemical Resource EngineeringHPLC 與與 GC 的的應用差異應用差異揮發(fā)揮發(fā)非揮發(fā)非揮發(fā)疏水性疏水性親水性親水性糖糖環(huán)氧化環(huán)氧化合物合物多氯聯(lián)苯多氯聯(lián)苯脂肪酸甲酯脂肪酸甲酯芳香酯芳香酯C2/C5 碳氫化合物碳氫化合物無機離子無機離子氨基酸氨基酸糖類

8、衍生物糖類衍生物香精油香精油聚合物單體聚合物單體甘油三酸酯甘油三酸酯磷脂磷脂亞硝胺亞硝胺有機磷有機磷殺蟲劑殺蟲劑酒精酒精多環(huán)芳烴多環(huán)芳烴芳族胺芳族胺脂溶性維生素脂溶性維生素抗體抗體天然食用色素天然食用色素類黃酮類黃酮抗生素抗生素腈類腈類抗氧化劑抗氧化劑乙二醇乙二醇脂肪酸脂肪酸磺胺類磺胺類揮發(fā)性羧酸揮發(fā)性羧酸醛酮類醛酮類甘草膦甘草膦合成食用色素合成食用色素苯酚苯酚黃曲霉毒素黃曲霉毒素酶酶糖醇糖醇State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering2. 色譜方法基本原理色譜方法基本原理v色譜的主要理論 熱力學理論 以相的平衡觀點研究色譜過程 塔

9、板理論為代表 (Martin & Synge) 動力學理論 以動力學觀點研究各種動力學因素對色譜峰的影響 Van Deemter 方程為代表MartinSyngeState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分離的原理v 樣品組分在固定相和流動相之間的分配 流動相帶動樣品經(jīng)過色譜柱 不同組分與固定相之間相互作用 的強度不同 不同組分在固定相上移動速度不同， 形成分離v 分配系數(shù) KD Xm Xs KD1 = Xs / Xm Ym Ys KD2 = Ys / Ym 流動相固定相State Key Laboratory of C

10、hemical Resource Engineering 樣品組分的分離v 進樣、分配、移動、流出、分離KD2 KD1 ，所以 Y 先流出來State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分配系數(shù)分配系數(shù)Kv 分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質有關，也與溫度、壓力有關。v 在條件（流動相、固定相、溫度和壓力等）一定，樣品濃度很低時（Cs、Cm很?。r，K只取決于組分的性質，而與濃度無關。這只是理想狀態(tài)下的色譜條件，在這種條件下，得到的色譜峰為正常峰正常峰；在許多情況下，隨著濃度的增大，K減小，這時色譜峰為拖尾峰；而有時隨著溶質

11、濃度增大，K也增大，這時色譜峰為前延峰。因此，只有盡可能減少進樣量，只有盡可能減少進樣量，使組分在柱內(nèi)濃度降低，使組分在柱內(nèi)濃度降低，K恒定時，才能獲得正常峰。恒定時，才能獲得正常峰。v 在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。v 在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質影響。實踐中主要靠調整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。 State Key Laboratory

12、of Chemical Resource Engineering樣品組分分離情況v A. 樣品與色譜柱固定相無任何作用 三種樣品在 t0 時間流出， 無保留 無保留時間v B. 樣品組分保留時間一致 與色譜柱作用力相同 v C. 樣品組分保留時間不一致 樣品各組分與色譜柱作用力不同 v D. 實際分離狀況 高斯分布曲線State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 色譜出峰形狀v實際出峰形狀為高斯分布曲線 (Gaussian curve) 樣品的擴散效應無擴散 樣品擴散State Key Laboratory of Chemical

13、Resource Engineering 分離度 分離度（分離度（Resolution)Resolution)兩個相鄰峰的分離程度。兩個相鄰峰的分離程度。以兩個組份保留值之差以兩個組份保留值之差與其平均半峰寬值的比與其平均半峰寬值的比來表示：來表示：R=? 時兩峰認為已分開時兩峰認為已分開?State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 不同分離度 Rv 相鄰兩吸收峰分離度 R=1.0, 98%, 基線分離 R=1.5, 99.7%v R=1.5 時，完全分離（中國藥典規(guī)定） 兩色譜峰被視為 分開State Key Laborator

14、y of Chemical Resource Engineering 分離度R 的數(shù)學表達v 分離度R的基本公式 k: 容量因子 (capacity factor) 反映吸收峰的保留特性 : 選擇因子 (selectivity factor) 反映相鄰兩色譜峰的分離程度 色譜過程熱力學因素 N: 理論塔板數(shù)，反映色譜柱的分離效率 (column efficiency)色譜過程動力學因素有關R = 1/4Nxxk1 + k- 1柱效柱效選擇因子選擇因子容量因子容量因子State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 容量因子 k 測量溶質

15、在固定相和流動相中分布的摩爾數(shù)（量）之比 與溫度有關 (GC) 與流動相溶劑種類及組成有關 (LC)Injectiont0tRtRState Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringvk 決定樣品能進入色譜柱固定相的量 k太小，在固定相上保留太短，很快流出，難以確定保留時間 k太大，在固定相上保留太強，洗脫時間太長， 理想的 k為 15 State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分離效果與 k 值的最優(yōu)化v k值的優(yōu)化 改變?nèi)軇┏煞?、梯度條件 (洗脫強度)State Key

16、Laboratory of Chemical Resource Engineering 選擇因子 v 色譜柱分開兩組份的能力 1 時兩組分分離 表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質的差異，即分子間相互作用力的差異。 t0tR1tR2InjectionState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering選擇因子 的影響因素v影響 的因素 改變流動相成分，包括改變 pH 值 改變柱溫 (在 LC 不明顯) 改變固定相成分 使用特殊化學效應State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering

17、理論板數(shù)理論板數(shù) Nv塔板理論 熱力學平衡理論 色譜柱效的量化 從分餾法技術衍生而來 分離法依組分揮發(fā)性不同而分餾 色譜法依組分分配系數(shù)不同而分離 分配系數(shù) K=Cs/Cm 理論板數(shù) N、塔板高度 H 柱效隨 N增大和 H減小而增加 分配色譜流程模型State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv理論塔板數(shù)N 與半峰寬W1/2和保留時間的關系如下 在相同保留時間色譜峰越尖銳，則色譜柱效越高 State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 分離效能的最優(yōu)化增加容量增加容量增加選

18、擇因子增加選擇因子增加柱效增加柱效增加增加 k 值可增加值可增加分離度分離度但會增加分析時間但會增加分析時間改變流動相、固定相成分改變流動相、固定相成分 增加增加 值可增加分離度值可增加分離度但不能因此但不能因此影響影響 k 值值State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering液相色譜儀設備概述液相色譜儀設備概述State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 液相色譜儀器組成液相色譜儀器組成溶劑傳輸系統(tǒng)（泵系統(tǒng)）進樣系統(tǒng) 檢測器工作站組分收集（選項）State Key Labo

19、ratory of Chemical Resource Engineering液相色譜儀器結構組成示意圖液相色譜儀器結構組成示意圖 流動相儲液瓶流動相儲液瓶單元或多元泵單元或多元泵梯度混合器梯度混合器預柱預柱手動手動-進樣器進樣器自動自動-進樣器進樣器保護柱保護柱色譜柱色譜柱柱后反應器柱后反應器柱溫箱柱溫箱檢測器檢測器餾分收集器餾分收集器積分儀積分儀工作站工作站計算機計算機接口接口溫度控制單元溫度控制單元樣品制備單元樣品制備單元State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering3. 樣品分析方法開發(fā) 3 選擇儀器類型，確定檢測器及其參數(shù)2

20、 是否需要樣品預處理，是否有特殊的步驟1 了解樣品的有關情況，明確分析目的State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering7a 回收純化物質8 方法論證進入常規(guī)實驗室7b 定量校正7c 定性方法6 檢查出現(xiàn)的各種現(xiàn)象和問題(包括儀器、樣品穩(wěn)定性等）選擇解決辦法和特殊步驟5 優(yōu)化分離條件，選擇最佳檢測器參數(shù)、色譜柱、流動相比例等4 選擇液相色譜分離類型，色譜柱，流動相，其他相關條件（如波長等），進行預實驗，估計最佳條件State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering樣品預處理樣品預

21、處理樣品預處理的目的是為了純化樣品。完成純化的方法有完成純化的方法有:u稀釋- 用一種互溶的且比流動相弱的溶劑或流動相本身稀釋樣品u過濾- 有不同孔徑的過濾材料. 提示: 有的化合物可能吸附在過濾器上，從而影響定量.u離心離心- 可除去樣品中的顆粒物質.u萃取萃取-液液萃取，固相萃取u揮發(fā)揮發(fā)- 采用惰性氣體通過樣品鼓泡或抽真空除去溶劑樣品準備樣品準備State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering優(yōu)化概覽優(yōu)化概覽優(yōu)化應當是系統(tǒng)進行的，也就是說每個參數(shù)應當逐步變化. !每次運行只改變一個參數(shù)!目標是在最短的分析時間內(nèi)獲得最好的分離結果.

22、 優(yōu)化溶劑強度 流速 溫度 柱長 固定相* 優(yōu)化優(yōu)化State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering流動相的選擇流動相的選擇流動相的選擇原則是：流動相的選擇原則是： 樣品易溶，且溶解度盡可能大。 化學性質穩(wěn)定，不損壞柱子。 不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。 粘度低，流動性好。 易于從其中回收樣品。 無毒或低毒，易于操作。 易于制成高純度，即色譜純。 廢液易處理，不污染環(huán)境。反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下：反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是：正

23、相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering系統(tǒng)方法開發(fā)系統(tǒng)方法開發(fā)1) 選擇初始色譜柱選擇初始色譜柱 (直徑直徑, 長度長度, 填料粒度填料粒度 ）- 4.6 x 250 mm, 5 m 使用適當?shù)目讖绞褂眠m當?shù)目讖?初始運行采用與流動相組成條件一致的初始運行采用與流動相組成條件一致的pH2) 優(yōu)化優(yōu)化 k* (保留保留) 梯度范圍梯度范圍, 時間時間, 斜率斜率 流動相流動相 - 很小變化很小變化3) 優(yōu)化回收率優(yōu)化回收率 樣品的溶解性樣品的溶解性 溫度的作用溫度

24、的作用 鍵合相的作用鍵合相的作用 有機改性劑有機改性劑4) 優(yōu)化優(yōu)化 * * (選擇性選擇性) 溫度溫度 鍵合相鍵合相 pH (最后的手段最后的手段)5) 優(yōu)化優(yōu)化 N (色譜柱條件色譜柱條件) 流速流速 長度長度 填料粒度填料粒度State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering分離度與分離度與 k, N, 和和 的關系的關系初始初始改變改變k提高提高N提高提高 梯度范圍梯度范圍, 斜率斜率流速流速, 填料粒度填料粒度, 柱長柱長溫度、流動相、溫度、流動相、pH 優(yōu)化優(yōu)化State Key Laboratory of Chemical

25、Resource Engineering 色譜的定性分析色譜的定性分析v色譜定性分析色譜定性分析:v 用保留值定性和色譜聯(lián)用技術（如用保留值定性和色譜聯(lián)用技術（如LC-MS、LC-FTIR)定性定性v利用保留值定性利用保留值定性v基本依據(jù)：兩個相同的物質在相同的色譜條件下應該有相同的保留基本依據(jù)：兩個相同的物質在相同的色譜條件下應該有相同的保留 值。但是，相反的結論卻不成立，即在相同的色譜條件值。但是，相反的結論卻不成立，即在相同的色譜條件 下，具有相同保留值的兩個物質不一定是同一個物質下，具有相同保留值的兩個物質不一定是同一個物質v利用已知物直接對照進行定性分析利用已知物直接對照進行定性分析

26、用絕對保留值定性一般要求用自動進樣用絕對保留值定性一般要求用自動進樣用相對保留值定性用相對保留值定性用已知物增加峰高法定性用已知物增加峰高法定性利用文獻值對照進行定性分析采用保留指數(shù)利用文獻值對照進行定性分析采用保留指數(shù)(I)State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv檢測器信號響應與時間的關系檢測器信號響應與時間的關系v測量每個峰的保留時間測量每個峰的保留時間tR1t0tR2timesignalState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 色譜的定量分析色譜的定量分析

27、l檢測器信號響應與時間的關系檢測器信號響應與時間的關系l測量每個峰的峰面積測量每個峰的峰面積State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv定量分析的基本公式： Mi i組分的量；Aii組分的峰面積；fi i組分的校正因子，與檢測器的行為和被測組份的行為有關。 定量分析的依據(jù)是被測組分的量與響應信號成正比，但相同含量的物質由于物理、化學性質的差別，即使在同一檢測器上產(chǎn)生的信號也不同，直接用響應信號定量，必然導致較大誤差。故引入校正因子。校正因子校正因子是定量計算公式中的比例常數(shù)，其物理意義是單位面積所代表的被測組分的量。 iiiAfm

28、State Key Laboratory of Chemical Resource Engineeringv1. 面積百分法面積百分法 (Area Percent)v2. 外標法外標法 (External Standard)v3. 內(nèi)標法內(nèi)標法 (Internal Standard)v4. 歸一化法歸一化法 (Normalized Percent)色譜定量分析方法的種類色譜定量分析方法的種類State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 面積百分法面積百分法 最簡單的計算方法樣品中的所有成分對檢測器的響應值相同樣品中的所有成分必須完全

29、分離表示樣品中單一組份相對于其他組份的含量 面積 % = ( AI / A ) * 100 AI = 單一色譜峰的面積 A = 全部色譜峰的面積之和v 不要求進樣量準確不要求進樣量準確v 不適用于選擇性檢測器不適用于選擇性檢測器State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering歸一化法歸一化法(Normalized %)v 將樣品中所有組份的含量之和定為100%。計算其中某一組份百分含量的定量方法：其中：xi試樣中組份I的百分含量 fi組份I的校正因子 Ai組份I的峰面積或峰高100%)(iiiiAfAfixState Key Labor

30、atory of Chemical Resource Engineering 歸一化法示例歸一化法示例 化合物 峰面積校正因子峰面積校正因子 百分比含量C8 2001.2 240240/1708=14.1%C12 2301.6 368368/1708=21.5%C16 2001.8 360360/1708=21.1%C18 3001.8 540540/1708=31.6%C20 1002.0 200 200/1708=11.7% 1030 1708 100%優(yōu)點：方法簡便，進樣量與載氣流速的影響不大優(yōu)點：方法簡便，進樣量與載氣流速的影響不大缺點：樣品中所有組份必須都能出峰，并且必須知道各自組份

31、的校缺點：樣品中所有組份必須都能出峰，并且必須知道各自組份的校正因子（校正因子需要由已知的標準品來求得）。正因子（校正因子需要由已知的標準品來求得）。歸一化法主要用于氣相色譜的定量測定。且一般只適用于通用型檢歸一化法主要用于氣相色譜的定量測定。且一般只適用于通用型檢測器。測器。State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering直接峰面積歸一化無校正因子法直接峰面積歸一化無校正因子法 % (NOCalibration)當樣品中各組份的校正因子近似相等，如同系物或同分異構體，可直接用峰面積歸一化進行定量。即簡化為下式：示例：給出了采用校正因子

32、和不用校正因子進行歸一化法的定量結果示例：給出了采用校正因子和不用校正因子進行歸一化法的定量結果100%iiAAix組份乙苯對二甲苯間二甲苯鄰二甲苯峰面積（Ai）校正因子（fi）f*Ai1200.97116751.00751400.961341050.98103校正因子歸一化法定量結果直接峰面積歸一化定量結果27.027.217.517.131.331.824.123.9State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering多點校正的定量分析多點校正的定量分析 單點校準單點校準峰面積峰面積進樣量進樣量峰面積峰面積進樣量進樣量響應值響應值 =樣

33、品量樣品量unn =峰面積峰面積響應值響應值峰面積峰面積進樣量進樣量多點校準多點校準State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering外標法（外標法（External Standard)又稱校正曲線法又稱校正曲線法v在相同分析條件下，比較標準物質與樣品的色譜峰面在相同分析條件下，比較標準物質與樣品的色譜峰面積或峰高積或峰高1. 用已知的標準品配成不同濃度的標準系列，在用已知的標準品配成不同濃度的標準系列，在與被測樣品相同的色譜條件下，等體積準確進樣，與被測樣品相同的色譜條件下，等體積準確進樣，測量各種濃度的峰高或峰面積，繪制響應信號與測量

34、各種濃度的峰高或峰面積，繪制響應信號與百分含量的關系曲線；百分含量的關系曲線；2. 測量樣品的峰面積或峰高，在校正曲線上查出測量樣品的峰面積或峰高，在校正曲線上查出其對應的百分含量。其對應的百分含量。State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering外標法定量外標法定量State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering濃度峰面積標準1127187標準24012845標準38021437標準412027557標準514031440v 樣品結果直接在標準工作曲線上讀出，非常簡單，尤其對大

35、量樣品分樣品結果直接在標準工作曲線上讀出，非常簡單，尤其對大量樣品分析時特別適合。析時特別適合。v 要求進樣量、色譜分析條件嚴格不變；容易出現(xiàn)較大誤差。要求進樣量、色譜分析條件嚴格不變；容易出現(xiàn)較大誤差。State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering內(nèi)標法內(nèi)標法(Internal Standard)State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering 用用DBP做內(nèi)標測定做內(nèi)標測定Pynamin. 配制標準溶液：配制標準溶液：準確稱量準確稱量200mgDBP和和220mg90%的的

36、Pynamin配制成配制成溶液溶液100ml。色譜測定得到。色譜測定得到As=12000,Ai=10000,則相對校正因子為：則相對校正因子為：188. 11000020012000%90220issiisAmAmf 配制樣品溶液：稱量稱量210mgDBP210mgDBP和和220mg220mg的樣品，配制成溶液的樣品，配制成溶液100ml100ml。色譜測定得到色譜測定得到As=12500,Ai=9500,As=12500,Ai=9500,則樣品中則樣品中PynaminPynamin的含量為：的含量為：mgmfmsAAisisi6 .189210125009500188. 1 故樣品中Pynamin的百分含量為： %2.86%1002206.189mgmgState Key Laboratory of Chemical Resource Engineering4.液相色譜儀（液相色譜儀（HPLC）的保養(yǎng)）的保養(yǎng)1、HPLC的